Name: electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Heart, Lung, og Blood Institute (R01 HL073965, IL) og (T32 HL007829-24, ISF). Forfatterne vil også erkjenne Scientific Machine Shop ved University of Illinois i Chicago for å generere vår nyeste MPP Flow kamre.

Bruken av dyr i våre studier er godkjent av University of Illinois i Chicago Animal Care Committee (#16-183).
1. montering av modifisert parallell plate Flow Chamber
Merk: Vennligst referer til tabell 1 og figur 1 for MPP Flow Chamber Piece-IDer. Vennligst referer til figur 1 for en skjematisk detaljering orienteringen av kammer stykker for montering.
<ol><li>For å over...

<ol>
	<li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans:+Role+of+Hemodynamic+Stimuli.">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 230-239 (2000).</li><li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K++current+in+vascular+endothelial+cells.">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li><li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secrets+of+the+code:+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals?.">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?.</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li><li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise.">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li><li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+K(+)+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries.">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li><li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K(+)+Channels.">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li><li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance.">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350 (2017).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force.">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li><li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field.">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K++channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li><li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress.">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers.">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478 (2018).</li><li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Assembly+and+Application+of+'Shear+Rings':+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital,+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress.">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632 (2016).</li><li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers.">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress.">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li><li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel.">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li><li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-activated+Na(+)and+K(+)Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells.">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li><li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery.">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li><li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+SK(Ca)+and+IK(Ca)+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow.">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349 (2012).</li><li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells.">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li><li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins.">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette:+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow.">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228 (2019).</li><li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K(+)+current+by+convectively+restoring+[K(+)]+at+the+cell+membrane+surface.">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585 (2016).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv.">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li><li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells.">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li><li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway.">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li><li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator.">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li></ol>

Det vaskulære systemet er stadig utsatt for aktive hemodynamisk tyrker, som aktiverer mechanosensitive ion kanaler3,22 men fysiologiske roller av disse kanalene i skjær stress-indusert mechanotransduction er bare begynner å dukke opp4,6,8. Mekanismene ansvarlig for mechanosensitivity av skjær stress-aktiverte kanaler forblir ukjent. Protokollen detaljert her beskrive...

Hemodynamisk tyrker generert av blodgjennomstrømningen er velkjent for å spille store roller i endothelial og vaskulær funksjon1,2. Det er også velkjent at flere typer ion-kanaler akutt svare på endringer i skjær stress3,4,5 fører til hypotesen om at ion-kanaler kan være primære skjær stress sensorer. Mer nylig, vi og andre viste at mechanosensitive ion kanaler spille kritiske roller i flere skjær-stress sensitive vaskulære funksjoner, inkludert vasoactive respons på skjær stress6,7,8 , og utviklingsmessige angiogenese9. Mekanismene for skjær-stress følsomhet for ion-kanaler, men er nesten helt ukjent. Dette gapet av kunnskap er sannsynlig å være på grunn av de tekniske vanskelighetene med å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinerte skjær stress. I denne artikkelen, derfor gir vi en trinnvis detaljert protokoll rutinemessig utført i laboratoriet vårt for å oppnå dette målet6,7,10,11.
Det overordnede målet med denne metoden er å la sanntids undersøkelse av ion Channel mechanoactivation under veldefinerte skjær stress i det fysiologiske området. Dette oppnås ved å endre en standard parallell plate Flow kammer å tillate en elektrofysiologisk pipette skal senkes ned i kammeret og få tilgang til celler dyrket på bunnplaten under sanntid eksponering for flyt, og gir en unik tilnærming for å oppnå dette målet6,7,11. I kontrast kan standard parallell plate strømnings kamre, beskrevet i tidligere publikasjoner, brukes til bildeanalyse i sanntid av celler som utsettes for skjærkraft12 eller andre ikke-invasive tilnærminger13,14 , men ikke for elektrofysiologi. Tilsvarende kjegle og plate apparat, en annen kraftfull tilnærming for å utsette celler for å skjære stress15,16 er heller ikke egnet for elektrofysiologisk innspillinger. Dermed gjør disse flyt enheter ikke tillater etterforskning av skjær stress følsomhet for ion-kanaler. Vanskeligheten med å utføre elektrofysiologisk opptak under Flow er hovedårsaken til mangelen av informasjon om mekanismene som er ansvarlige for disse avgjørende effektene.
I forhold til alternative tilnærminger for å oppnå samme mål, er det ingen som er så nøyaktig eller kontrollert. Noen tidligere studier forsøkte å registrere ion Channel aktivitet under Flow ved å utsette celler til en strøm av væske som kommer fra en annen pipette brakt til nærheten av en celle fra over17,18. Dette er svært ikke-fysiologiske, som mekaniske krefter generert under disse forholdene har lite til felles med de fysiologiske profiler av skjær stress i blodkarene. Lignende bekymringer gjelder for forsøk på å simulere fysiologiske skjær stress ved å rekke åpne kamre. Som beskrevet i detalj i vår tidligere studie10, en åpen væske-luft-grensesnitt skaper flere forstyrrelser og resirkulering, som er ikke-fysiologiske. For å løse alle disse bekymringene, har vi utviklet en modifisert parallell plate (MPP) Flow Chamber, også referert til som "minimalt invasiv Flow Device" i våre tidligere studier6,7,10,11, laget fra akryl og mye brukt i laboratoriet vårt. Men til tross for det faktum at den opprinnelige beskrivelsen av design har blitt publisert nesten 20 år siden, og er den eneste flyten enhet som gjør det mulig å utføre elektrofysiologisk innspillinger under veldefinerte skjær stress, har denne metodikken ikke vært vedtatt av andre laboratorier og det er bare svært få studier som forsøker å ta opp strømninger underflyt. Vi tror derfor at å gi en detaljert beskrivelse for bruk av MPP Flow kammeret vil være til stor hjelp for forskere som er interessert i mechanosensitive ion kanaler og vaskulær biologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-501</td>
			<td>Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 grade forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>1252-30</td>
			<td>Used for transferring digested arteries to fresh solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipet</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td>Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm diameter Cover glass circles</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 40 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975224</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm Rectangluar Cover glass</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td>Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Co</td>
			<td>305175</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td>For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9528-50MG</td>
			<td>Used for generating the perforated whole-cell patch configuration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>100 mg - LS004194</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td>Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elastase, lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>25 mg - LS002290&#160;</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>For use with studies involving cultured cells and multiple treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral protease/dispase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td>
			<td>Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon ND 10-80 tubing</td>
			<td>Microbore Tubing</td>
			<td>AAQ04133</td>
			<td>ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recordings of single-cell ion currents under well-defined shear stress

Fluid skjær stress er godt kjent for å spille en viktig rolle i endothelial funksjon. I de fleste vaskulære senger, utløser forhøyet skjær stress fra akutte økninger i blodstrømmen en signalering Cascade resulterer i vasodilatasjon dermed lindre mekaniske påkjenninger på vaskulær veggen. Mønsteret av skjær stress er også godt kjent for å være en kritisk faktor i utviklingen av aterosklerose med laminær skjær stress blir atheroprotective og forstyrret skjær stress blir Pro-atherogenic. Mens vi har en detaljert forståelse av de ulike mellomliggende celle signalering trasé, reseptorene som først oversette den mekaniske stimulans i kjemiske meglere er ikke helt forstått. Mechanosensitive ion kanaler er avgjørende for responsen til skjær og regulere skjær-indusert celle signalering dermed kontrollere produksjonen av vasoactive meglere. Disse kanalene er blant de tidligste aktiverte signalering komponenter for å skjære og har vært knyttet til skjær-indusert vasodilatasjon gjennom fremme nitrogenoksid produksjon (f. eks innvendig rectifying K+ [KIR] og forbigående reseptor potensial [TRP] kanaler) og endotelet hyperpolarizing faktor (for eksempel Kir og kalsium-aktiverte K+ [KCa] kanaler) og skjær-indusert vasokonstriksjon gjennom en ubestemt mekanisme som involverer piezo kanaler. Forstå Biofysiske mekanismen som disse kanalene aktiveres av skjærkrefter (dvs. direkte eller gjennom en primær mechano-reseptor) kan gi potensielle nye mål å løse patofysiologi forbundet med endothelial dysfunksjon og atherogenesis. Det er fortsatt en stor utfordring å registrere Flow-indusert aktivering av ion-kanaler i sanntid ved hjelp av elektrofysiologi. Standardmetodene for å eksponere celler til veldefinerte skjær stress, slik som kjegle og plate rheometer og lukket parallell plate Flow kammer ikke tillater sanntids studie av ion kanal aktivering. Målet med denne protokollen er å beskrive en modifisert parallell plate Flow kammer som gjør at sanntid elektrofysiologisk innspillingen av mechanosensitive ion kanaler under veldefinerte skjær stress.

Flere fotografier som viser ulike visninger av MPP Flow kammer på mikroskopet scenen (øvre panel) og en skjematisk fremstilling av MPP strømnings kammer (nederste panel) er vist i figur 1. Den Skjematisk detaljer dimensjonene av hele enheten og Flow kammer. Figur 2 viser et fotografi av tyngdekraft systemet til MPP strømnings kammer i vårt laboratorium (øvre panel). Også vist er en skjematisk representasjon av strømnings ...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress at JoVE.com

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologisk innspillinger av single-Cell ion strømninger under godt definert skjær stress

Målet med denne protokollen er å beskrive en modifisert parallell plate Flow kammer for bruk i å undersøke sanntids aktivering av mechanosensitive ion kanaler ved skjær stress.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Bruk av det modifiserte parallelle platestrømningskammeret kan hjelpe forskere med å svare på viktige spørsmål knyttet til den funksjonelle responsen fra mekanosensitive ionkanaler for å skjære stress. Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig for sanntidsundersøkelse å flyte aktiverte ionkanaler i et lett montert, gjenbrukbart parallelt platestrømningskammer. For å starte prosedyren, påfør et tynt lag med silikoneeastomerløsning rundt kantene på det rektangulære rommet på stykke C, og legg forsiktig bort overflødig silikoneastomerløsning.Gjenta deretter prosedyren for å følge det rektangulære dekselglasset, stykke F, til bunnen av stykke E og la silikoneealytomerløsningen kurere over natten ved romtemperatur. Monter NÅ MPP-strømningskammeret ved å plassere hvert stykke på toppen av det forrige, som begynner med det nederste kammeret, del E, deretter stykke C, del B, etterfulgt av del A øverst. Deretter justerer du skruehullene i hvert stykke i hjørnene og skrur bitene tett sammen for å hindre at lekkasjer oppstår mens du administrerer strømmen til MPP-strømningskammeret.I en seks-brønns plate, plasser fire til fem, 12 millimeter dekker glass sirkler i hver brønn. Lagre cellene mellom 10%og 30% samløpet, slik at enkeltceller kan nås for elektrofysiologiske opptak. Deretter inkubere cellene under standard kulturforhold i ikke mindre enn to timer for å tillate celler å holde seg, og ikke mer enn 24 timer, da endotelceller vil bli flate og vanskelige å lappe når de seedes ved subkonfluens i mer enn 24 timer.Deretter fjerner du et dekkglass som inneholder de tilslutne cellene fra en brønn av seksbrønnsplaten og skyller raskt i PBS. Deretter overfører du dekkglasset med celler til en 35 millimeter petriskål som inneholder to milliliter elektrofysiologiske BAF-oppløsning. Overfør umiddelbart dekkglasset med celler til MPP-strømningskammeret.Overfør dekkglasssirkelen til det rektangulære dekkglasset, stykke D, som er festet til del C i MPP-strømningskammeret. Tilsett BAF-løsningen for å senke dekkglasssirkelen og cellene helt ned. Deretter plasserer du dekkglasssirkelen på stykke D slik at cellene vil være på linje med spalteåpningene på stykket B.Sørg for at dekselglasssirkelen fester seg til stykke D gjennom løsningsglass vedheft for å unngå forstyrrelse av dekkglasssirkelens posisjon ved strømningsapplikasjonen.Deretter monterer du MPP-strømningskammeret ved å skru bitene sammen i riktig rekkefølge. Overfør kammeret til mikroskopstadiet og perfuse umiddelbart kammeret med BAF-løsning. Deretter identifiserer du en sunn celle med en mørk kant og åpenbar kjerne for eksperimentet.Unngå celler som ser ut til å være spekkede eller celler som er i kontakt med andre celler. For å kontrollere skjærstress, sett opp et gravitasjonsperfusjonssystem ved å koble en 30 milliliter gradert sprøytesylinder til en treveis Luer-lås utstyrt med mikroborerør. Deretter fester du den graderte sylinderen til Faraday-buret rundt elektrofysiologiriggen ved hjelp av dobbeltsidig tape.Før du setter inn slangen i MPP-kammeret, må sprøyten fylles ferdig og slangen med BAF-oppløsning. Deretter setter du slangen inn i MPP-strømningskammerets innløpshull i stykke A.Fyll MPP-strømningskammeret med løsning, slik at det fjernes i vakuumbeholderen. Stopp strømmen til kammeret og fyll den graderte sylinderen til toppmerket.Beregn strømningshastigheten manuelt ved hjelp av en stoppeklokke ved å la oppløsningen strømme gjennom kammeret i en gitt sprøytesylinderhøyde. Hev eller senk sprøyten for å endre strømmen og beregne skjærstresset i et parallelt kammer ved hjelp av denne ligningen. Gjenta denne prosessen til et ønsket nivå av skjærstress er funnet.Deretter overfører du et montert kammer som inneholder tilsplutne celler til mikroskopstadiet på elektrofysiologiriggen. Og sett slangen, ferdigfylt med BAF-løsning, inn i hullet på stykke A.Fyll deretter kammeret og vask cellene med 10 ml BAF-løsning samtidig. Når ønsket patch konfigurasjon er vellykket oppnådd, la kanalstrømmene stabilisere seg i et statisk bad ved romtemperatur.Så snart strømmene har stabilisert seg, bruk skjær på en trinnvis måte, slik at den økte strømmen stabiliseres før neste trinn av skjærstress øker. Fjern skjæreksponering for cellene ved å stoppe strømmen til kammeret, slik at mekanosensitive kanalstrømmer kan gå tilbake til grunnlinjestrømmer observert i det statiske badet. Vist her er en representativ rå opptak av Kir strøm fra en primær mus mesenterisk endotelcelle med bemerkelsesverdig lineær ytre lekkasjestrøm.En rampe på negative 140 til positive 40 millivolt ble brukt på plasteret over 400 millisekunder. Lekkasjestrøm forhindrer analyse av ekte Kir-kanalaktivitet. Hvis du vil trekke fra lekkasjestrøm, må du først beregne den lineære hellingsledningen til lekkasjestrømmen.Flere G-hellinger ved tilsvarende spenninger av hele råspor for å plotte lekkasjestrøm på rådata. Linjen skal legge over den ytre lineære lekkasjen nøyaktig. Deretter trekker du den plottede lekkasjestrømmen fra hele sporet slik at den lineære ytre strømmen er omtrent null picoamperes per picofarad, og den virkelige Kir-strømmen kan analyseres.Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren er å plassere dekkglasset i kammeret riktig slik at cellene er tilgjengelige for eksperimenter. I tillegg må du kontrollere at dekselet glir tilstrekkelig festet til stykke D, slik at væskestrømmen ikke forstyrrer dekkglasset som inneholder celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Encellete Målinger av vacuolar Rupture forårsaket av intracellulære patogener

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Utarbeidelse av encellede utestengelse for Cytofluorimetric analyse fra forskjellige muse Skin Regioner

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse av Adhesjon Under skjærspenning for studier av T-lymfocytter-adhesjonsmolekyl Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse av skjær flyt-indusert migrering av murint Marginal sone B celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...