Name: pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Genome Canada, dem Ontario Research Fund und den Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802) unterstützt.

Die nachstehend beschriebenen Experimente sollten den Richtlinien des Amtes für Umweltgesundheit und -sicherheit des Instituts entsprechen.
1. Gepoolte CRISPR sgRNA lentivirale Bibliothek Plasmid-Amplifikation
<ol><li>Verdünnen Sie die vorgefertigte CRISPR sgRNA Plasmid-DNA-Bibliothek in TE auf 50 ng/l (z. B. TKOv3).</li>
	<li>Elektroporate die Bibliothek mit elektrokompetenten Zellen. Richten Sie insgesamt vier Elektroporationsreaktionen ein, wie unten beschrieben.<ol>
<li>Fügen Sie 2 l ...

<ol>
	<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms.">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li><li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+(Review).">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+CRISPR/Cas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes.">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+execution,+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR/Cas9+screens.">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR/SpCas9+Knock-out+Screens.">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li><li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies.">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms.">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li><li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors.">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras.">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li><li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions.">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li><li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification.">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li><li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STBL2:+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences.">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li><li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAGEL:+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens.">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).</li><li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ.">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>Pedregosa, F. V., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scikit-learn:+Machine+Learning+in+Python.">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li><li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens.">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213 (2011).</li><li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Am+I+ready+for+CRISPR?+A+user's+guide+to+genetic+screens.">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li><li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR/Cas9+technology.">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR/Cas9+knock-out+screens.">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).</li><li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens.">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li><li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells.">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li><li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators:+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays.">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li></ol>

Aufgrund seiner Einfachheit und hohen Geschmeidigkeit wurde die CRISPR-Technologie weithin als Werkzeug der Wahl für die präzise Genombearbeitung angenommen. Das gepoolte CRISPR-Screening bietet eine Methode, um Tausende von genetischen Störungen in einem einzigen Experiment zu hinterfragt. In gepoolten Bildschirmen dienen sgRNA-Bibliotheken als molekulare Barcodes, da jede Sequenz einzigartig ist und dem Zielgen zugeordnet ist. Durch die Isolierung der genomischen DNA aus der Zellpopulation können Gene, die den Phä...

CRISPR-Cas, kurz für gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurze palindromische Wiederholungen und CRISPR-assoziierte Nuklease, besteht aus einem einzigen Nukleaseprotein (z.B. Cas9) in Komplex mit einer synthetischen Guide RNA (sgRNA). Dieser Ribonukleoprotein-Komplex zielt auf das Cas9-Enzym ab, um doppelsträngige DNA-Brüche an einem bestimmten genomischen Ort1zu induzieren. Doppelsträngige Brüche können durch homology directed repair (HDR) oder, häufiger, durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert werden, ein fehleranfälliger Reparaturmechanismus, der zum Einfügen und/oder Löschen (INDELS) führt, das häufig die Genfunktion stört. 1. Die Effizienz und Einfachheit von CRISPR ermöglicht ein bisher unerreichbares Niveau der genomischen Ausrichtung, das die bisherigen Genom-Editing-Technologien [d.h. Zinkfingernukleasen (ZNF) oder Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen ( weit übertrifft ( TALENS), die beide unter erhöhter Designkomplexität, geringerer Transfektionseffizienz und Einschränkungen bei der Multiplex-Genbearbeitung2] leiden.
Die Grundlagenforschung der CRISPR-Single-Guide-RNA-basierten Genombearbeitung hat es Wissenschaftlern ermöglicht, die Funktionen einzelner Gene und die Topologie genetischer Interaktionsnetzwerke effizient und kostengünstig zu hinterfragt. Die Fähigkeit, funktionelle genomweite Bildschirme durchzuführen, wurde durch den Einsatz des CRISPR-Cas-Systems erheblich verbessert, insbesondere im Vergleich zu früheren genetischen Störtechnologien wie RNA-Interferenz (RNAi) und Gentrap-Mutagenese. Insbesondere leidet RNAi unter hohen Off-Target-Effekten und unvollständigem Knockdown, was zu einer geringeren Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu CRISPR3,4,5führt, während Gentrap-Methoden nur bei haploiden Zellen für Funktionsverlustbildschirme, die den Umfang von Zellmodellen einschränken, die abgefragt werden können6. Die Fähigkeit von CRISPR, einen vollständigen Gen-Knock-out zu erzeugen, bietet ein biologisch robusteres System zur Abhörung mutierter Phänotypen mit geringem Rauschen, minimalen Off-Target-Effekten und konsistenter Aktivität über Reagenzien5. CRISPR-Cas9 sgRNA-Bibliotheken, die auf das gesamte menschliche Genom abzielen, sind jetzt weit verbreitet und ermöglichen die gleichzeitige Generierung von Tausenden von Gen-Knock-outs in einem einzigen Experiment3,7,8,9 .
Wir haben einzigartige CRISPR-Cas9 genomweite sgRNA lentivirale Bibliotheken entwickelt, die Toronto Knock-out (TKO) Bibliotheken (verfügbar über Addgene) genannt werden, die kompakt und sequenzoptimiert sind, um hochauflösende funktionelle Genomik-Bildschirme zu ermöglichen. Die neueste Bibliothek, TKOv3, zielt auf 18.000 menschliche Protein-kodierende Gene mit 71.090 Leitfäden, die für die Bearbeitungseffizienz mit empirischen Daten optimiert sind10. Darüber hinaus ist TKOv3 als Einkomponenten-Bibliothek (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) verfügbar, die Cas9 und sgRNAs auf einem einzigen Vektor ausdrückt, wodurch die Notwendigkeit entsprochen wird, stabile Cas9-expressions-Zellen zu generieren, was genomweite Knock-out in einer breiten Palette von Säugetierzelltypen. TKOv3 ist auch in einem Vektor ohne Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID-Nr. 125517) erhältlich und kann in Zellen verwendet werden, die Cas911ausdrücken.
Eine genomweite CRISPR-Cas9-bearbeitete Zellpopulation kann unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt werden, wobei die Fülle von sgRNAs im Laufe der Zeit durch Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert wird, was eine Auslesung zur Beurteilung von Aussteigern oder Anreicherung von Zellen mit rückverfolgbaren genetischen Störungen. CRISPR-Knock-out-Bibliotheken können genutzt werden, um Gene zu identifizieren, die bei Störungen zelluläre Fitnessdefekte, eine moderate Arzneimittelempfindlichkeit (z. B. empfindliche oder resistente Gene) verursachen, die Proteinexpression regulieren (z. B. Reporter) oder für eine bestimmte Signalwegfunktion und Zellzustand12,13,14. Zum Beispiel können Differential-Fitness-Bildschirme in einer Krebszelllinie sowohl Erschöpfung oder Reduktion von Onkogenen und Anreicherung oder eine Zunahme der Tumorsuppressoren Gene3,14,15identifizieren. In ähnlicher Weise kann die Verwendung von Zwischendosen von therapeutischen Medikamenten sowohl Arzneimittelresistenz als auch Sensibilisierungsgene16,17zeigen.
Hier ist ein detailliertes Screening-Protokoll für das genom-skala CRISPR-Cas9 Verlust-von-Funktions-Screening mit den Toronto Knock-out Bibliotheken (TKOv1 oder v3) in Säugetierzellen von der Bibliotheksgenerierung, Screening-Performance bis zur Datenanalyse. Obwohl dieses Protokoll für das Screening mit den Toronto Knock-out-Bibliotheken optimiert wurde, kann es angewendet werden und auf alle gepoolten CRISPR sgRNA-Bibliotheken skalierbar werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 micron filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#176;C plate incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C shaking incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X TAE buffer</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 N Hydrochloric acid solution</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>HCL666.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar blue</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-light transilluminator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cel culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endura electrocompetent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>90293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T packaging cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>recommend passage number &#60;15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>Cationic polymer to enhance transduction efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine Bromide (Polybrene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar plates with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium with carbenicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0544L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G (envelope plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12259</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 (packaging plasmid)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>lentiviral system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>400-160-UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C recovery medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYRB Safe DNA gel stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #90203</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Addgene ID #125517</td>
			<td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure agarose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard genomic DNA purification kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>06 365 809 001</td>
			<td>Lipid based transfection reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pooled crispr-based genetic screens in mammalian cells

Die Genombearbeitung mit dem CRISPR-Cas-System hat die Fähigkeit, die Genome verschiedener Organismen präzise zu bearbeiten, erheblich erweitert. Im Kontext von Säugetierzellen stellt diese Technologie ein neuartiges Mittel dar, um genomweite genetische Screens für funktionelle Genomstudien durchzuführen. Bibliotheken von Guide RNAs (sgRNA), die auf alle offenen Leserahmen abzielen, ermöglichen die einfache Generierung von Tausenden von genetischen Störungen in einem einzigen Pool von Zellen, die auf bestimmte Phänotypen untersucht werden können, um Genfunktion und zelluläre Prozesse in einem unvoreingenommenund systematisch. CRISPR-Cas-Bildschirme bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die genetischen Blaupausen für zelluläre Phänotypen aufzudecken. Darüber hinaus kann die Differentialanalyse von Bildschirmen, die in verschiedenen Zelllinien und aus verschiedenen Krebsarten durchgeführt werden, Gene identifizieren, die kontextuell in Tumorzellen wichtig sind, und potenzielle Ziele für spezifische Krebstherapien aufzeigen. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann entmutigend sein, da dies den Umgang mit zig Millionen Zellen beinhaltet und eine Analyse großer Datenmengen erfordert. Die Details dieser Bildschirme, wie z. B. die Charakterisierung von Zellenlinien, Überlegungen zur CRISPR-Bibliothek und das Verständnis der Einschränkungen und Fähigkeiten der CRISPR-Technologie während der Analyse, werden häufig übersehen. Hier ist ein detailliertes Protokoll für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-basierten Bildschirmen vorgesehen.

Überblick über den CRISPR-Screening-Workflow im Genommaßstab
Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den gepoolten CRISPR-Screening-Arbeitsablauf, beginnend mit der Infektion von Zielzellen mit CRISPR-Bibliotheklentivirus bei niedrigem MOI, um einzelne Integrationsereignisse und eine angemessene Bibliotheksdarstellung zu gewährleisten (in der Regel 200 bis 1000 -falte). Nach de...

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Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPR-geprüfte Drop-Out-Screens bieten Forschern eine einfache, effiziente und kostengünstige Methode, um die Kettenfunktion auf genomweiter Ebene zu überprüfen. Der Vorteil von CRISPR ist seine Geschmeidigkeit, jedes Gen zu bearbeiten, indem es einfach die Führungssequenz ändert. CRISPR-Leitbibliotheken ermöglichen es Forschern, das gesamte Genom eines jeden Organismus in einem Experiment unvoreingenommen und systematisch zu befragen.Derzeit werden CRISPR-Screens verwendet, um wesentliche Gene über Hunderte von menschlichen Krebsarten zu identifizieren und genetische Wechselwirkungen abzubilden. Bildschirme können auch umfassende Profile Drogen, um Drogen-Wirk-Mechanismen der Aktion zu offenbaren. Die hier beschriebenen CRISPR-Bibliotheken zielen auf menschliche Zellen ab.Führungsbibliotheken, die auf andere Arten wie die Maus abzielen, sind jedoch verfügbar und können auf ähnliche Weise überprüft werden. Die Durchführung genomweiter Bildschirme in menschlichen Zellen kann in der Praxis entmutigend sein, da es sich um den Umgang mit zig Millionen in Zellen handelt und die Analyse großer Datensätze erfordert. Stellen Sie vor dem Starten eines Bildschirms sicher, dass die Zelllinien sorgfältig charakterisiert werden.Dazu gehören das Wissen um die Reinheit Ihrer Zelllinie, verdoppelende Zeit, Lentivirus-Transduktionseffizienzen und Empfindlichkeiten gegenüber Antibiotika-Selektionserregern. Eine visuelle Demonstration wird ein Bild davon liefern, wie man praktisch mit den Millionen von Zellen umgeht, die auf einem Bildschirm benötigt werden, und Tausende von Störungen systematisch verfolgen kann. Demonstriert wird das Verfahren von Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh und Ryan Climie, allesTechniker aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Umwandlung des vorgefertigten CRISPR sgRNA Plasmids in elektrokompetente Zellen und wachsen sie nach Manuskriptanweisungen. Wenn Sie bereit sind, die Kolonien zu ernten, fügen Sie sieben Milliliter LB mit Carbenicillin auf jede Platte und kratzen Sie die Kolonien mit dem Zellstreuer ab. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die zerkratzten Zellen in einen sterilen Ein-Liter-Konuskolben zu übertragen, und spülen Sie die Platte mit fünf Millilitern LB mit Carbenicillin ab.Übertragen Sie die Spüllösung erneut auf den Kolben. Zentrifugieren Sie die Zellen nach Manuskriptrichtungen und bestimmen Sie dann das Gewicht des nassen Pellets. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem Maxi- oder Mega-Plasmid-Reinigungskit.Bereiten Sie Zellen für die Transfektion vor, indem Sie 293 T-Zellen aussäen und über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die drei Transfektionsplasmid-Mischungen für 15-Zentimeter-Platten vorbereiten. Berechnen Sie die Menge an Plasmid, die für eine Transfektion benötigt wird, und erstellen Sie eine Mischung von Plasmiden für die Anzahl der Platten, plus eine, die transfiziert werden soll.Als nächstes bereiten Sie ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz für jede Transfektion und aliquot-reduzierte Serummedien in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren für die Anzahl der zu transfizierenden Platten vor. Das Transfektionsreagenz hinzufügen, sanft mischen und bei Raumtemperatur fünf Minuten brüten. Fügen Sie dem Transfektionsreagenz nach der Inkubation DNA in einem Verhältnis von Transfektionsreagenz zu Mikrogramm des DNA-Komplexes hinzu.Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu Verpackungszellen hinzu und inkubieren Sie sie nach Manuskriptanweisungen. Überprüfen Sie am Tag der viralen Ernte die Zellen auf abnormale und verschmolzene Morphologie als Hinweis auf eine gute Virusproduktion und ernten Sie das Lentivirus, indem Sie den Überstand sammeln und in ein steriles Zentrifugenrohr übertragen.Wählen Sie zunächst die CRISPR-Guide-RNA-Bibliotheksabdeckung aus, die auf dem gesamten Bildschirm beibehalten werden soll. Bestimmen Sie anhand der Bibliotheksabdeckung die Anzahl der Zellen, die für die Aufrechterhaltung pro Führungs-RNA erforderlich sind, und die Anzahl der Zellen, die für eine Infektion bei MOI 0,3 erforderlich sind. Als nächstes bestimmen Sie die Anzahl der Platten, die erforderlich sind, um die Infektion einzurichten, und ernten und säen Sie dann die Zellen auf jeder Platte.Hexadimethrinbromid zu allen Platten hinzufügen und das erforderliche Virusvolumen zum Screening und zur Kontrolle von zwei Platten hinzufügen. Fügen Sie keinen Virus hinzu, um einen zu kontrollieren. Ersetzen Sie dieses Volume durch Medien.Mischen Sie die Platten gründlich durch Kippen und legen Sie die Platten in einen Inkubator, um sicherzustellen, dass sie eben sind. Ernten Sie infizierte Zellen nach Manuskriptanweisungen und sammeln Sie drei Repliken von Zellpellets aus den gepoolten Zellen für die genomische DNA-Extraktion. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g und waschen Sie sie mit PBS.Beschriften Sie die Rohre und gefrieren Sie die Zellpellets bei minus 80 Grad Celsius. Teilen Sie den Pool infizierter Zellen in drei Replikationsgruppen auf, um sicherzustellen, dass die Bibliotheksabdeckung innerhalb jeder Replikation beibehalten wird. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte, die normalerweise bei der Erweiterung verwendet würde.Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Zellen für jede Replikation und die gleiche Gesamtzahl von Zellen zwischen Replikationen. Fahren Sie fort, die Zellen zu durchlaufen und drei Wiederholungen von Zellpellets aus jeder Replikation von gepoolten infizierten Zellen für bis zu 15 bis 20 Zellverdoppelungen zu ernten. An jedem Durchgang ernten Sie die Zellen von allen Platten in jedem replizieren miteinander.Beschriften Sie jedes Pellet mit der Zeit- und Nachbildungsbezeichnung. Richten Sie PCR1 nach Manuskriptanweisungen mit insgesamt 100 Mikrogramm genomischer DNA bei 3,5 Mikrogramm genomischer DNA pro 50-Mikroliter-Reaktion ein und richten Sie identische 50-Mikroliter-Reaktionen ein, um die gewünschte Abdeckung zu erzielen. Richten Sie eine PCR-Rohrreaktion nach Manuskriptanweisungen ein.Verwenden Sie fünf Mikroliter des gepoolten PCR1-Produkts als Vorlage und verwenden Sie eindeutige Indexprimerkombinationen für jedes einzelne Beispiel, um das Pooling von Sequenzierungsbibliotheksbeispielen zu ermöglichen. Nach Abschluss der PCR führen Sie das PCR-Rohrprodukt auf einem 2%Agarose-Gel bei niedriger Spannung für ein bis 1 1/2 Stunden aus. Visualisieren Sie das Produkt auf einem Blaulichttransilluminator und verbrauchen Sie das 200 Basispaarband.Reinigen Sie die DNA und messen Sie ihre Quantität und Qualität sowohl mit einem Spektralphotometer als auch mit einem Fluorometer. Eine ideale Guide-RNA-Bibliothek sollte jede einzelne Guide-RNA in ähnlichen Mengen dargestellt haben. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Bibliothek über eine enge Verteilung von Führungs-RNAs verfügt.Präzisions-Rückrufanalysen können verwendet werden, um die Bildschirmleistung zu bewerten. Ein leistungsstarker Bildschirm sollte eine große Anzahl von essentiellen Genen mit einem Basisfaktor größer als sechs und einer falschen Entdeckungsrate von weniger als 5% wiederherstellen. Der Bayes-Faktor stellt ein Vertrauensmaß dar, dass der Genknockout zu einem Fitnessfehler führt.Hohe Werte deuten auf ein erhöhtes Vertrauen hin, während niedrige Werte darauf hindeuten, dass der Gen-Knockout Wachstumsvorteile bietet. Genomweite Knockout-Pools können in Gegenwart von überschüssigem Wirkstoff kultiviert werden, um nach Suppressorresistenzgenen zu suchen. Um einen positiven Selektionsbild für den Suppressor des Thymidinblocks durchzuführen, werden normalisierte Lesezahlen für alle Führungs-RNAs bei T0 gegen mittelnormalisierte Lesezahlen für Thymidin-behandelte Proben geplottet.Ein wichtiges Detail für die erfolgreiche Durchführung von CRISPR-Bildschirmen ist die Aufrechterhaltung einer guten Verteilung jeder Führungs-RNA, angefangen bei der Transfektion des Plasmids bis zur Transduktion von Zellen. Dies minimiert die Wahrscheinlichkeit von Zufallseffekten, die die RNA-Darstellung verzerren und zu falschen positiven oder negativen Ergebnissen führen können. Nach einer Bildschirmvalidierung sollten Experimente durchgeführt werden, um Treffer zu bestätigen, da der primäre Bildschirm nur potenzielle Treffer identifiziert.Je nach Biologie der Treffer können verschiedene Methoden eingesetzt werden. Die CRISPR-Bearbeitung in Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation hat den Verlust von Funktionsbildschirmen im Genommaßstab in verschiedenen menschlichen Modellsystemen ermöglicht. Aufgrund der Einfachheit von CRISPR sind diese Arten von Bildschirmen nun für alle Forscher allgemein zugänglich, so dass mehr Wissenschaftler funktionelle genetische Methoden nutzen können, um biologische Prozesse und Krankheiten zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...