Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يعترفا بزمالة سرطان الدم في الخلايا المشعرة لدعم يوان جيمين. وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق آسيا لبحوث السرطان (AFCR2017/2019-JH)، وجائزة دوك-نوس خو لجسر التمويل (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014)، والمنحة الانتقالية لـ NCCRF (NCCRF-YR2018-JUL-BG4)، والمنحة التجريبية لـ NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3)، والطب الأكاديمي SHF منحة بحثية (AM/TP011/2018).

1. في المختبر كيناز الاختبار لقياس النشاط الحفاز لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني
<ol><li>بناء ناقلات ترميز متحولات RAF (الشكل1A) مع العلامة FLAG (DYKDDDDK) في C-terminus باستخدام جيبسون الجمعية أو أساليب الاستنساخ الجزيئي التقليدية.
	<ol>
<li>إدخال علامة FLAG والطفرات في تسلسلات الترم...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

في هذه المقالة، قدمنا ثلاث طرق لوصف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، وسلاح الجو الملكي البريطاني اختبار التنشيط المشترك، ومجانية انقسام لوسيفيراز اختبار. وبما أن كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني لها نشاط حفاز ونشاط أللوستريك على حد سواء، يمكن لمختلف ا...

وkinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني هي عنصر رئيسي من RAS / RAF / MEK / ERK إشارة تتالي، والتي تنقل إشارة من RAS لتنشيط كيناز البروتين المنشط ميثوجن (MEK)1،2،3،4. هذه الأسرة من kinases تلعب دورا حاسما في نمو الخلايا والبقاء على قيدالحياة والتمايز، وتعديلاتها تحفز العديد من الأمراض، ولا سيما السرطان 5،6،7،8. في الآونة الأخيرة، حددت التسلسلات الجينية العديد من المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض التي تظهر خصائص مختلفة في انتقال إشارة RAS / RAF / MEK / ERK شلال9،10،11. وصف دقيق لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني سوف تساعدنا على فهم الآليات الجزيئية لكيفية تغيير المتحولين RAF الناتج إشارة من RAS / RAF / MEK / ERK تتالي، في نهاية المطاف اختيار النهج المناسبة لعلاج مختلف الأمراض التي يحركها RAF متحولة.
وتشمل أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ثلاثة أعضاء، CRAF، BRAF، وARAF، والتيلديها هياكل جزيئية مماثلة ولكن قدرات مختلفة لتنشيط المصب إشارة 1،2،3،4. من بين هذه paralogs، BRAF لديها أعلى نشاط بحكم الفسفوريةالمكونة لها NtA (N -terminal acidic) عزر12،13،14،في حين أن ARAF لديه أدنى النشاط الناشئ عن عزر ها غير الكنسي APE15. وهذا قد يفسر ترددات الطفرة المختلفة من PARALOGS RAF في الأمراض: BRAF>CRAF>ARAF. وعلاوة على ذلك، فإن الطفرات في مواقع مختلفة، في إطار نفس paralog RAF، قد تؤدي إلى إشارات في المصب بطريقة متميزة، مما يضيف طبقة أخرى من التعقيد إلى تنظيم الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن جميع kinases RAF لديها كل من الأنشطة الحفازة وallosteric13،14،16،17،18. يقوم متحولو سلاح الجو الملكي البريطاني النشطون بشكل تأسيسي بتشغيل الإشارات إلى المصب مباشرة عن طريق الفسفوريلات MEK، في حين يمكن لمسوخي سلاح الجو الملكي البريطاني الميتين تحويل نظرائهم من النوع البري من خلال التمتميّز من جانب إلى جنب وتفعيل إشارة MEK-ERK16 ،19،20. التقارب/ الاستقرار هو المعلمة الرئيسية التي لا تحدد فقط النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت ولكن أيضا يؤثر على النشاط الحفاز من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة المكونة15،21، 22.يمكن للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت مع تقارب ديمر عالية / الاستقرار تحويل RAFs البرية من نوع الذاتية مباشرة15، في حين أن تلك مع تقارب ديمر المتوسطة / الاستقرار يتطلب تنسيق راس نشطة أو مستوى مرتفع من جزيئات سلاح الجو الملكي البريطاني من النوع البري لتعمل13،15،20،21،23. وبالمثل، فإن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل تأسيسي فوسفوريلات MEK بطريقة تعتمد على ديمر، وأولئك الذين يعانون من انخفاض التقارب/الاستقرار الخافت يفقدون نشاطهم الحفاز في المختبر على الترسيب المناعي الذي يكسر ضعف سلاح الجو الملكي البريطاني15، 21،22. كما يحدد التقارب/الاستقرار الخافت حساسية متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني لمثبطاتهم، ويرتبط بشكل إيجابي بمقاومة مثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني24. ولذلك، لتوصيف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، فمن الضروري لقياس أنشطتهم الحفازة واللوستريك، وتقارب/استقرار خافت.
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا وغيرها من الطرق المختلفة لتوصيف kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين بهم. وفقا لمختبرنا وتجربة الآخرين، ونحن نعتقد أن الاختبارات الثلاثة التالية لها مزايا في تعريف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض: (1) اختبار كيناز في المختبر التي يمكن تنفيذها بسهولة للكشف عن النشاط الحفاز من المكونة نشط [رف] متحولات15; (2) وسلاح الجو الملكي البريطاني المشاركة في تفعيل التقوله الذي هو وسيلة موثوقة ومريحة لقياس النشاط اللوستريك من kinase القتلى RAF متحولين13،15،21،22،23، 25; (3) الفحص لوسيفيراز الانقسام المجاني الذي لديه حساسية أعلى بكثير في قياس تقارب والاستقرار قاتمة نسبيا من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني على النقيض من الفحص التقليدي المشترك للمناعة، وقادرة على تنفيذ دون معدات متقدمة في على النقيض من الأساليب التحليليةالكمية مثل SPR (S urface Plasmon Resonance) تحليل15،22. الجمع بين هذه الاختبارات الثلاثة، يمكننا أن نفهم بسهولة كيف أن متحولة RAF ذات الصلة بالأمراض يغير الإشارات المصب وبالتالي استخدام استراتيجية علاجية مناسبة لعلاج المرض الناجم عن هذه الطفرة RAF.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

تلعب الكينازات العائلية السريعة التسارع (RAF) دوراً محورياً في بيولوجيا الخلايا ويؤدي اختلالها الوظيفي إلى السرطانات واضطرابات النمو. ومن شأنه أن يساعدنا توصيف المتحولين المرتبطين بالأمراض في سلاح الجو الملكي البريطاني على اختيار الاستراتيجيات العلاجية المناسبة لعلاج هذه الأمراض. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني لها أنشطة حفازة وأنشطة ألوستريك على حد سواء، والتي يتم تنظيمها بإحكام من خلال التمتميّز. هنا، قمنا ببناء مجموعة من الأساليب العملية والعملية لتحديد الأنشطة الحفازة وallosteric والتقارب/الاستقرار الخافت النسبي لقرابة أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ومسوخهم. أولا، قمنا بتعديل اختبار كيناز الكلاسيكية في المختبر عن طريق الحد من تركيز المنظفات في المخازن المؤقتة، وذلك باستخدام إجراء غسل سريع لطيف، واستخدام الجلوتاثيون S-transferase (GST) الانصهار لمنع الدمامل RAF من التفكك خلال تنقيه. وهذا يمكننا من قياس النشاط الحفاز للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشط بشكل مناسب. ثانيا، قمنا بتطوير جديد سلاح الجو الملكي البريطاني في التفعيل المشترك لتقييم النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني ميتا كيناز باستخدام N-محطة اقتطاع البروتينات سلاح الجو الملكي البريطاني، والقضاء على متطلبات راس نشطة في البروتوكولات الحالية وبالتالي تحقيق أعلى حساسيه. وأخيراً، قمنا بتوليد عملية مسح منفصلة فريدة من نوعها لقياس التقارب/الاستقرار النسبي للمتحولين في سلاح الجو الملكي البريطاني، وهو أكثر موثوقية وحساسية مقارنة بالفحص التقليدي للمناعة. وباختصار، فإن هذه الأساليب لها المزايا التالية: (1) سهلة الاستخدام؛ (2) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام (2) قادرة على تنفيذ فعال دون معدات متقدمة؛ (3) فعالة من حيث التكلفة؛ (4) حساسة للغاية واستنساخها.

لدى أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني أنشطة محفزة وألوستريك على حد سواء، والتي تمكن المتحولين المرتبطين بالأمراض من تشغيل المصب الإشارات من خلال آليات مختلفة13،14،16،17 ،18. إن متحولي سلاح الجو الملكي ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

في هذه المقالة، قدمنا مجموعة من الطرق العملية والعملية لوصف المتحولين ذات الصلة بالأمراض من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، ومختبر التنشيط المشترك، وتكملة الانقسام لوسيفيراز اختبار.

تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

هذه الطريقة تسهل توصيف فعال للأمراض المتعلقة أساليب كيناز RAF. هذه التقنية هي حساسة للغاية وقابلة للتكرار، فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستعمال، ولا تتطلب أي معدات متقدمة. لقياس النشاط الحفاز من المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني، إدخال الطفرات التكنولوجيا العلم في تسلسل الترميز سلاح الجو الملكي البريطاني من قبل PCR، قبل إدراج تسلسل كامل في ناقلات المناسبة وفقا للبروتوكولات القياسية.إدراج الجلوتاثيون كتسلسل الترميز transferase المنبع من تسلسل الترميز متحولة سلاح الجو الملكي البريطاني، لتوليد ناقلات ترميز الجلوتاثيون كما transferase تنصهر المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني، بنفس الطريقة. Transvect 80٪ إلى 90٪ التقاء 293T الثقافات الخلية مع ناقلات ترميز العلم الموسومة kinases سلاح الجو الملكي البريطاني أو المسوخ الخاصة بهم، وفقا لبروتوكولات المعايير. بعد 24 ساعة من الثقافة، استبدال الوسط في كل ثقافة.بعد 48 ساعة من الثقافة، إضافة 400 ميكرولترات من عازلة تحلل تكملها مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، إلى كل بئر على الجليد. بعد خمس إلى 10 دقائق نقل الخلية lysates إلى أنبوب 1.5 ملليلتر للطرد المركزي إلى رواسب حطام الخلية. نقل 300 ميكرولترات من كل عينة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي صغيرة 1.5 ملليلتر.جانبا 40 ميكرولترات لكل عينة للمصب الجملة lysate إشارة الخلوية اضافية ينظم كيناز واحد واثنين من التعبير والنشاط تحليل لطخة الأمينية. إضافة 20 ميكرولترات من الخرز تقارب المضادة لـ FLAG لكل أنبوب ، لمدة ساعة واحدة حضانة مع دوران في غرفة باردة أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة بسرعة وبلطف غسل الخرز العلم المضادة مرة واحدة مع عازلة تحلل في غرفة باردة ومواحدة من الوقت مع كيناز رد فعل العازلة قبل إضافة 20 ميكرولترات من خليط التفاعل كيناز.قد يمسخون جرافة مع تقارب ديما منخفضة فقدان نشاطهم الحفاز في المختبر بسبب انفصال ديما. ولذلك، فإن غسل سريع ولطيف أمر بالغ الأهمية. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب كل دقيقة، ووقف ردود فعل كيناز مع خمسة ميكرولترات من خمسة XSDS عينة العازلة، لكل عينة وغلي العينات في 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.في نهاية الحضانة، تشغيل العينات على 9 إلى 12٪ polyacrylamide هلام الكهرباء مع 0.1٪SDS، ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز للسماح الكشف عن مستويات بروتين الفوسفوجين المنشط كيناز وطفرات سلاح الجو الملكي البريطاني في كل عينة، عن طريق blotting المناعية. لتقييم النشاط Allosteric من المسوخ كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني الميت، وبناء ناقلات ترميز المتلقي سلاح الجو الملكي البريطاني أو kinase dead RAF المنشطات. Transvect 293 T الخلايا مع اثنين من ناقلات ترميز كل من مستقبل سلاح الجو الملكي البريطاني وkinase الميتة RAF المنشط، أو ناقل واحد ترميز واحد من البروتينات كما هو موضح.حصاد الخلية بأكملها lysates بعد 48 ساعة من الثقافة كما هو موضح، وخلط بسرعة الخلية كاملة نظيفة مع خمسة XSDS عينة العازلة في درجة حرارة الغرفة، قبل غليان ال ليسات لمدة خمس دقائق في 90 درجة مئوية. ثم تشغيل عينات الخلية الكاملة المسلوقة على هلام الكهرباء 9 إلى 12٪ بولياكريلاميد هذا 0.1٪SDS ونقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز للكشف عن مستويات إشارة الخلوية الزائدة فوسفو ينظم كيناز واحد واثنين والتحكم في البروتينات عن طريق النشاف المناعي كما هو موضح. لقياس التقارب خافت النسبية أو استقرار المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني بناء ناقلات ترميز ناقلات التكنولوجيا مشروع مشروع تنصهر إلى نهاية اليرا فيرفلي لوسيفراز أو C Terminus لوسيفايلاس اليراعات.Transvect 293 T الخلايا مع زوج من ناقلات ترميز مختلفة و Terminus من المسوخ في مجال اليراعات في مجال الحرائق سلاح الجو الملكي البريطاني وC Terminus طفرات luciferase سلاح الجو الملكي البريطاني اليراعات اليراعات كما هو موضح. 24 ساعة بعد إعادة تخزين transvection مرتين 10 إلى الخامس 293 معاملات الخلية T في جيدا في لوحات صورة سوداء الكريستال في المتوسطة ملونة خالية. 48 ساعة بعد transvestion إضافة لوسيفرين إلى 293 T الخلايا transvectents واحتضان لمدة 30 دقيقة.قبل قياس إشارات لوسيفراز على نظام الكشف المتعدد. في نهاية القياس pirate supernatents، وblice الخلايا T 293 التعامل مع lysas العازلة كما هو موضح. تشغيل كامل عينات الخلية lysate على 9 إلى 12٪ هلام الكهرباء 100000 1000 1000.الكشف عن مستويات التعبير من نهاية نهاية نهاية endinus من المسوخ فيرفلي لوسيفراسي سلاح الجو الملكي البريطاني، أو المدى C من المسوخ فيرفلي لوسيفايساي من قبل مكافحة لطخة أمينية العلم كما هو موضح. ثم تطبيع إشارات لوسيفراز من 293 ت الخلايا transvectants وفقا لمستويات التعبير عن نهاية نهاية لوسيفيراز وE المدى من المسوخ فيرفلاي لوسيفراز سلاح الجو الملكي البريطاني. ويمكن استخدام كيناز في المختبر asa لتحقيق فعال في النشاط الحفاز لبعض المسوخ R-العمود الفقري النشطة بشكل تأسيسي، ولكن ليس ذلك من المسوخ كيناز الميت مع دمج C-العمود الفقري.النشاط الحفاز من المسوخ RAF نشطة بشكل تأسيسي مع تقارب خافت ضعيف أو الاستقرار ومع ذلك، قد لا يكون التحقيق باستخدام هذا ASA كما يتم كسر الخافتات الخاصة بهم أثناء عملية تنقية. لتجنب فقدان النشاط الحفاز من المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني مع ضعف التقارب أو الاستقرار، يمكن أن تنصهر هذه المسوخ مع نقل الجلوتاثيون لإنقاذ النشاط الحفاز من المسوخ. يمكن استخدام سلاح الجو الملكي البريطاني المشترك تفعيل ASA لتقييم النشاط allosteric من كيناز الميت سلاح الجو الملكي المسوخ.كما يتضح كيناز المسوخ الميتة مع عزر الطرفية الطرفية الحمضية والانصهار العمود الفقري C، وظيفة المنشطات الالويسترية لتحريك النشاط الحفاز من المسوخ مع غير الفوسفور الحمضية نهاية عزر الطرفية، عندما شارك أعرب في خلايا 293T. مزيد من انقسام مجاني luciferase SA يمكن استخدامها لقياس التقارب خافت النسبية أو الاستقرار من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمسوخ بهم. استخدام عازلة lysas مع تركيز منخفض من المنظفات، وإجراء غسل لطيف سريع خلال تنقية العينة أمر ضروري لنجاح في المختبر كيناز SA. وستساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد كيفية ترحيل المرض على وجه التحديد إلى المسوخ التابعة لسلاح الجو الملكي البريطاني، وتنشيط مسار المصب، وتسهيل اختيار الاستراتيجيات العلاجية المناسبة لعلاج الأمراض.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

نموذج الفأر من التعب المستحث بواسطة الطرفية تشعيع

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

الحيوانات الأليفة والتصوير بالرنين المغناطيسي يسترشد تشعيع نموذج الفئران جليوبلاستوما استخدام الصغرى--إيرادياتور

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

دليل عملي للإنتاج والتصوير PET/CT من 68Ga-دوتاتاتي لاورام الغدد الصم العصبية في الممارسة السريرية اليومية

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

ثلاث طرق لتحليل التعبير التفاضلي لتسلسل الحمض النووي الريبي: ليما، إيدج آر، DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...