Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende den behårede celle Leukemia Fellowship for støtte af Yuan Jimin. Dette arbejde blev støttet af Asia fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge-finansierings pris (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF-overgangs tilskuddet (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) og SHF Academic Medicine Forskningstilskud (AM/TP011/2018).

1. in vitro-Kinaseassay til måling af RAF-mutanternes katalytiske aktivitet
<ol><li>Konstruere vektorer kodning RAF mutanter (figur 1A) med flag (DYKDDDDK) tag på C-Terminus ved hjælp af Gibson assembly eller traditionelle molekylære kloning metoder.
	<ol>
<li>Introducere flaget tag og mutationer i RAF kodning sekvenser af pcrs, og derefter indsætte hele sekvenser i pcdna 3.1 (+) vektor ved hjælp af Gibson assembly eller T4 DNA ligering og efter fremstillingen protok...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

I denne artikel præsenterede vi tre metoder til karakterisering af sygdomsrelaterede RAF-mutanter, som omfatter in vitro-kinaseassay, RAF-Co-aktiverings analyse og gratis split der-analyse. Da RAF-kinaser har både katalytisk aktivitet og allosterisk aktivitet, kan forskellige RAF-mutanter aktivere downstream-signaleringen gennem to særskilte mekanismer13,14,16,17, <sup class="xref...

RAF-familiens kinaser er en vigtig bestanddel af Ras/RAF/Mek/Erk signalering Cascade, som sender et signal fra Ras for at aktivere mitogen-aktiveret proteinkinase (Mek)1,2,3,4. Denne familie af kinaser spiller en afgørende rolle i cellevækst, overlevelse og differentiering, og deres ændringer fremkalde mange sygdomme, især kræft5,6,7,8. For nylig har genomiske sequencings identificeret mange sygdomsrelaterede RAF mutanter, der udviser forskellige egenskaber i signalet transmission af Ras/RAF/Mek/Erk Cascade9,10,11. En omhyggelig karakterisering af RAF-mutanter vil hjælpe os med at forstå de molekylære mekanismer for, hvordan RAF-mutanter ændrer signal outputtet fra RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, til sidst vælger passende tilgange til behandling af forskellige RAF-mutant-drevne sygdomme.
RAF-familiens kinaser omfatter tre medlemmer, Craf, BRAF og Araf, som har lignende molekylære strukturer, men forskellige evner til at aktivere downstream-signalering1,2,3,4. Blandt disse paralogs har BRAF den højeste aktivitet i kraft af sin konstitutivt fosforyleret NTA (N-tTerminal acidic) Motif12,13,14, mens Araf har den laveste aktivitet som følge af dens ikke-kanoniske APE motiv15. Dette kan forklare de forskellige Mutations frekvenser af RAF paralogs i sygdomme: BRAF > CRAF > ARAF. Desuden kan mutationer på forskellige steder inden for samme RAF paralog udløse downstream-signalering i særskilte manerer, hvilket tilføjer endnu et lag af kompleksitet til reguleringen af RAF-familie kinaser. Nylige undersøgelser har vist, at alle RAF-kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter13,14,16,17,18. Konstitutivt aktive RAF-mutanter tænder downstream-signaleringen direkte ved fosforylerende MEK, hvorimod kinase-døde RAF-mutanter kan transaktivere deres vildtype-modparter gennem side-til-side-dimerisering og aktivere MEK-ERK signalering16 ,19,20. Den dimer affinitet/stabilitet er en nøgleparameter, der ikke kun bestemmer den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter, men også påvirker den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter15,21, 22. de kinase-døde RAF-mutanter med høj dimer affinitet/stabilitet kan transaktivere de endogene Wild-type RAFs direkte15, mens dem med mellemliggende dimer affinitet/stabilitet kræver en koordination af aktive RAS eller en forhøjet niveau af Wild-type RAF molekyler til funktion13,15,20,21,23. Tilsvarende, konstitutivt aktive RAF mutanter fosforylat Mek i en dimer-afhængige måde, og dem med lav dimer affinitet/stabilitet mister deres katalytisk aktivitet in vitro ved immun opstød, der bryder de svage RAF dimerer15, 21,22. Dimerens affinitet/stabilitet bestemmer også RAF-mutanternes følsomhed over for deres hæmmere og er positivt korrelerer til modstanden i RAF-hæmmere24. For at karakterisere sygdomsrelaterede RAF-mutanter er det derfor nødvendigt at måle deres katalytiske og allosteriske aktiviteter og dimer affinitet/stabilitet.
I de seneste år har vores laboratorium og andre udviklet forskellige metoder til at karakterisere RAF familie kinaser og deres mutanter. Ifølge vores laboratorium og andres erfaring, mener vi, at følgende tre assays har fordele ved at definere sygdomsrelaterede RAF mutanter: (1) in vitro kinase assay, der kan udføres med lethed til at detektere den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter15; (2) RAF-Co-aktiverings analysen, der er en pålidelig og bekvem metode til at måle den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter13,15,21,22,23, 25; (3) den gratis split der assay, der har meget større følsomhed i at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af RAF mutanter i modsætning til den traditionelle Co-immunoprecipitation assay, og er i stand til at udføre uden avanceret udstyr i i modsætning til de kvantitative analytiske metoder såsom spr (soverflaoeaktive Plasmon Resonance) analyse15,22. Ved at kombinere disse tre assays kan vi nemt forstå, hvordan en sygdomsrelateret RAF-mutant ændrer downstream-signaleringen og dermed udnytter en passende terapeutisk strategi til behandling af sygdommen forårsaget af denne RAF-mutation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

Den hastigt accelererede fibrosarkom (RAF) familie kinaser spiller en central rolle i cellebiologi og deres dysfunktion fører til kræft og udviklingsmæssige lidelser. En karakterisering af sygdomsrelaterede RAF-mutanter vil hjælpe os med at udvælge passende terapeutiske strategier til behandling af disse sygdomme. Nylige undersøgelser har vist, at RAF Family kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter, som er stramt reguleret ved dimerisering. Her opbyggede vi en række praktiske og gennemførlige metoder til at bestemme de katalytiske og allosteriske aktiviteter og den relative dimer affinitet/stabilitet i RAF-familiens kinaser og deres mutanter. For det første ændrede vi den klassiske in vitro-kinaseanalyse ved at reducere koncentrationen af vaskemiddel i buffere ved hjælp af en blid hurtig vaske procedure og ved at anvende en glutathion S-transferase (GST) fusion for at forhindre RAF-dimere i at dissociere under Rensning. Dette gør det muligt for os at måle den katalytiske aktivitet af konstitutivt aktive RAF-mutanter på passende vis. For det andet udviklede vi en ny RAF-Co-aktiverings analyse for at evaluere den allosteriske aktivitet af kinase-døde RAF-mutanter ved hjælp af N-terminal trunkerede RAF-proteiner, hvilket eliminerer kravet om aktive RAS i de nuværende protokoller og dermed opnår en højere Følsomhed. Endelig, vi genereret en unik supplerende split der assay til kvantitativt at måle den relative dimer affinitet/stabilitet af forskellige RAF mutanter, som er mere pålidelig og følsom i forhold til den traditionelle Co-immunoprecipitation assay. Sammenfattende har disse metoder følgende fordele: (1) brugervenlig; 2) kan udføre effektivt uden avanceret udstyr 3) omkostningseffektiv (4) meget følsom og reproducerbar.

RAF-familiens kinaser har både katalytiske og allosteriske aktiviteter, som gør det muligt for deres sygdomsrelaterede mutanter at tænde downstream-signaleringen gennem forskellige mekanismer13,14,16,17 ,18. Den konstitutivt aktive RAF mutanter direkte fosforylere deres substrater, mens kinase-døde RAF mutanter opfylde deres funktion gennem transaktiveren...

Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

I denne artikel præsenterede vi et sæt praktiske og gennemførlige metoder til karakterisering af sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser, som omfatter in vitro-kinaseassay, RAF-Co-aktiverings analyse og supplerende split der-analyse.

Karakterisere sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser ved hjælp af et sæt praktiske og gennemførlige metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Denne metode letter en effektiv karakterisering af sygdomsrelaterede RAF kinase metoder. Denne teknik er meget følsom og reproducerbar, omkostningseffektiv, brugervenlig og kræver ikke avanceret udstyr. For at måle RAF-mutanters katalytiske aktivitet skal du indføre flagteknologimutationer i RAF-kodningssekvensen ved PCR, før hele sekvenser indsættes i den relevante vektor i henhold til standardprotokoller.Ifør glutathionen som transferase kodning sekvens opstrøms for RAF mutant kodning sekvenser, at generere vektorer kodning glutathion som transferase fusioneret RAF mutanter, på samme måde. Transvect 80% til 90% sammenløb 293T cellekulturer med vektorer kodning flaget mærkede RAF kinaser eller deres mutanter, i henhold til standarder protokoller. Efter 24 timers kultur, erstatte mediet i hver kultur.Efter 48 timers kultur tilsættes 400 mikroliter lysisbuffer suppleret med protease- og fosfatasehæmmere til hver brønd på is. Efter fem til 10 minutter overføres cellelysningerne til et 1,5 milliliterrør til centrifugering til sediment af celleresterne. 300 mikroliter af hver prøve overføres til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Der skal afsættes 40 mikroliter pr. prøve til downstream engroslyat fossil ekstra cellulære signal reguleret kinase en og to udtryk og aktivitet aminosmærkest analyse. Tilføj 20 mikroliter af anti-FLAG affinitet perler til hvert rør, for en times inkubation med rotation i en fire grader Celsius koldt rum. I slutningen af inkubationen vaskes antiflagperlerne en gang med lysisbuffer i det kolde rum og én gang med kinasereaktionsbuffer, før der tilsættes 20 mikroliter kinasereaktionsblanding.Graf mutanter med en lav Dima affinitet kan miste deres katalytiske aktivitet in vitro på grund af Dima dissociation. Derfor er den hurtige og blide vask kritisk. Efter 10 minutter ved stuetemperatur med spejlvende hvert andet minut stoppes kinasereaktionerne med fem mikroliter på fem XSDS-prøvebuffere pr. prøve og prøven koges ved 90 grader Celsius i fem minutter.Ved inkubationens afslutning køres prøverne på en 9-12% polyarylamidelektrophoresisgel med 0,1% SDS, hvor derefter proteinerne overføres til en nitrocellulosemembran for at gøre det muligt at detektionere niveauet af fosfor mitogenaktiveret proteinkinase og RAF-mutanter i hver prøve ved immunafsklering. For at evaluere den allosteriske aktivitet af kinase døde RAF mutanter, konstruere vektorer kodning RAF modtageren eller kinase døde RAF aktivatorer. Transvect 293 T-celler med to vektorer, der kodler både RAF-modtageren og kinasen døde RAF-aktivator eller en enkelt vektor, der kodning af et af proteinerne som påvist.Høst hele cellen lysates efter 48 timers kultur som påvist, og bland hurtigt den rene hele celle lysate med fem XSDS prøve buffer ved stuetemperatur, Før kogning lysates i fem minutter ved 90 grader Celsius. Derefter køre kogt hele celle lysate prøver på en ni til 12% polyarylamid elektroforese gel, der er 0,1% SDS og overføre proteiner til en nitrocellulose membran til påvisning af niveauet af fosfor ekstra cellulære signal reguleret kinase en og to og kontrol proteiner ved immun blotting som påvist. At måle den relative dimer affinitet og eller stabilitet af RAF mutanter konstruere vektorer kodning flag tech udkast mutanter smeltet til endinus af Firefly luciferase eller C Terminus en firefly luciferase.Transvect 293 T-celler med et par vektorer, der kodning forskellige og Terminus af firefly luciferase RAF mutanter og C Terminus en firefly luciferase RAF mutanter som påvist. 24 timer efter transvection replate to gange 10 til den femte 293 T-celle transaktioner pr godt i krystal sort billede plader i farvefri medium. 48 timer efter transvestionen tilsættes luciferin til 293 T celletransvectenter og inkuberes i 30 minutter.Før måling af luciferasesignalerne på et multidetektionssystem. Ved afslutningen af målingen aspirere supernatents, og blice de transacted 293 T celler med lysas buffer som påvist. Der køres hele cellelysatprøverne på en ni til 12% polyacryamidelektrophoresisgel med 0,1% SDS.Påbring ekspressionsniveauerne i endestationen for Firefly luciferase RAF-mutanter eller C-endestationen firefly luciferase RAF-mutanter ved antiflag aminosving som påvist. Derefter normalisere luciferase signaler af 293 T celle transvectants i henhold til udtrykket niveauer af slutningen endestation af Firefly luciferase og C endestation af Firefly luciferase RAF mutanter. In vitro kinase asa kan bruges til effektivt at undersøge katalytisk aktivitet af nogle konstituerende aktive R-rygsøjlen mutanter, men ikke af kinase døde mutanter med en sammensmeltet C-rygsøjlen.Katalytisk aktivitet af konstituerende aktive RAF-mutanter med en svag dimer affinitet eller stabilitet kan dog ikke undersøges ved hjælp af denne ASA, da deres dæmpnere brydes under rensningsprocessen. For at undgå tab af katalytisk aktivitet af RAF-mutanter med svag dimer affinitet eller stabilitet kan disse mutanter sammensmeltes med glutothionas transferase for at redde mutanters katalytiske aktivitet. RAF co-aktivering ASA kan bruges til at evaluere den allosteriske aktivitet af kinase døde RAF Mutanter.Som illustrerede kinase døde mutanter med en sur ende terminal motiv og C rygsøjlen fusion, fungere som allosteriske aktivatorer til at udløse katalytisk aktivitet af mutanter med en ikke fosfor relatable sure ende terminal motiv, når co udtrykt i 293T celler. Yderligere en gratis split luciferase SA kan bruges til at måle den relative dimer affinitet eller stabilitet af RAF familie kinaser og deres mutanter. Brug af en lysas buffer med en lav koncentration af vaskemiddel, og en hurtig skånsom vask procedure under prøven rensning er afgørende for en vellykket in vitro kinase SA. Denne teknik vil hjælpe forskerne med præcist at bestemme, hvordan sygdomsrelæ RAF-mutanterne, aktivere downstream-vejen, lette udvælgelsen af passende terapeutiske strategier for sygdomsbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En mus Model af træthed induceret af perifere Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiske overvejelser i studere metastatisk lunge kolonisering i Osteosarcoma ved hjælp af pulmonale metastaser Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET og Mr guidede bestråling af en glioblastom rotte Model ved hjælp af en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Metoder til evaluering af c-Fos rolle og Dusp1 i onkogen afhængighed

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisning af Protease aktivitet af fluorescerende peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

En praktisk vejledning for produktion og PET/CT billeddannelse af 68Ga-DOTATATE for Neuroendokrine tumorer i daglig klinisk praksis

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Overvågning af eIF4F-samling ved måling af eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Brug computer-baseret billedanalyse til at forbedre kvantificeringen af lungemetastase i 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre metoder til differentialudtryksanalyse til RNA-sekventering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...