Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

De auteurs willen graag de Hairy Cell Leukemia Fellowship voor steun van Yuan Jimin erkennen. Dit werk werd gesteund door Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), hertog-NUS Khoo Bridge funding Award (hertog-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging subsidie (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), en SHF academische geneeskunde Onderzoeksbeurs (AM/TP011/2018).

1. in vitro kinase test voor het meten van de katalytische werking van de mutanten van de
<ol><li>Construct vectoren coderen RAF mutanten (afbeelding 1A) met vlag (DYKDDDDK) tag bij C-Terminus met behulp van Gibson assembly of traditionele moleculaire klonen methoden.
	<ol>
<li>Introduceer de vlag tag en mutaties in de RAF-coderings sequenties door PCRs, en voeg vervolgens hele sequenties in pcdna 3.1 (+) vector met behulp van Gibson assembly of T4 DNA ligatie en volgens d...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

In dit artikel presenteerden we drie methoden voor het karakteriseren van de ziekte-gerelateerde RAF mutanten, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay. Aangezien RAF kinases zowel katalytische activiteit als allosterische activiteit hebben, kunnen verschillende RAF-mutanten de stroomafwaartse signalering activeren via twee verschillende mechanismen13,14,16,<sup class="xre...

De RAF familie kinases zijn een belangrijk onderdeel van RAS/RAF/MEK/ERK signalering Cascade, die een signaal van RAS te activeren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MEK)1,2,3,4. Deze familie van kinasen speelt een cruciale rol in celgroei, overleving en differentiatie, en hun veranderingen induceren vele ziekten, met name kanker5,6,7,8. Onlangs hebben genomische sequencings veel ziektegerelateerde RAF-mutanten geïdentificeerd die verschillende eigenschappen vertonen in de signaaloverdracht van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade9,10,11. Een zorgvuldige karakterisering van de mutanten van de RAF zal ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen van hoe de mutanten van de RAF de signaal output van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade veranderen, en uiteindelijk passende benaderingen selecteren voor de behandeling van verschillende door de RAF gemuteerde ziekten.
De familie van de RAF kinases omvatten drie leden, CRAF, braf, en Araf, die vergelijkbare moleculaire structuren, maar verschillende capaciteiten te activeren downstream signalering1,2,3,4. Onder deze paralogs heeft braf de hoogste activiteit op grond van zijn constitutief gefosforyleerde NTA (N-terminal acidic) motief12,13,14, terwijl Araf de laagste activiteit die voortvloeit uit het niet-canonieke APE motief15. Dit kan verklaren de verschillende mutatie frequenties van RAF paralogs in ziekten: BRAF > CRAF > ARAF. Bovendien, binnen dezelfde RAF Paralog, mutaties in verschillende locaties kunnen leiden tot downstream signalering in verschillende manieren, die voegt een extra laag van complexiteit aan de regulering van de RAF familie kinases. Recente studies hebben aangetoond dat alle RAF kinases zowel de katalytische als de allosterische activiteiten13,14,16,17,18hebben. Constitutief actieve RAF-mutanten zetten de stroomafwaartse signalering rechtstreeks door fosforylating MEK, terwijl kinase-dode RAF-mutanten hun wild type tegenhangers kunnen transactiveren door middel van Side-to-side door dimerisatie en MEK-ERK-signalering16 activeren ,19,20. De dimeer-affiniteit/-stabiliteit is een belangrijke parameter die niet alleen de allosterische activiteit van kinase-dode RAF-mutanten bepaalt, maar ook de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten beïnvloedt,15,21, 22. de kinase-dode RAF mutanten met een hoge dimeer affiniteit/stabiliteit kunnen de endogene wild-type RAFs rechtstreeks transactiveren15, terwijl die met intermediaire dimeer affiniteit/stabiliteit vereist een coördinatie van actieve RAS of een verhoogde niveau van wild-type RAF moleculen om te functioneren13,15,20,21,23. Evenzo, grondwettelijk actieve RAF mutanten fosforylaat MEK in een dimeer-afhankelijke manier, en degenen met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit verliezen hun katalytische activiteit in vitro op immunoprecipitatie die de zwakke RAF Dimeren breekt15, 21,22. De dimeer affiniteit/stabiliteit bepaalt ook de gevoeligheid van de RAF mutanten aan hun remmers, en positief correleert met de weerstand van de RAF-remmers24. Om ziekte-gerelateerde RAF-mutanten te karakteriseren, is het daarom noodzakelijk om hun katalytische en allosterische activiteiten te meten, en dimeer affiniteit/stabiliteit.
In de afgelopen jaren hebben ons laboratorium en anderen verschillende methoden ontwikkeld om RAF familie kinasen en hun mutanten te karakteriseren. Volgens ons laboratorium en de ervaring van anderen, denken we dat de volgende drie assays voordelen hebben bij het bepalen van ziekte-gerelateerde RAF-mutanten: (1) de in vitro kinase assay die gemakkelijk kan worden uitgevoerd om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten15; (2) de RAF co-Activation assay is een betrouwbare en handige methode om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten13,15,21,22,23, 25; (3) de gratis gesplitste plaats test die een veel hogere gevoeligheid heeft bij het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de mutanten van de RAF in tegenstelling tot de traditionele Co-Immunoprecipitation Assay, en is in staat om uit te voeren zonder geavanceerde apparatuur in contrast met de kwantitatieve analytische methoden zoals SPR (Sppervlakte Plasmon Resonance) analyse15,22. Door deze drie testen te combineren, kunnen we gemakkelijk begrijpen hoe een ziektegerelateerde RAF Mutant de downstream signalering verandert en zo een geschikte therapeutische strategie gebruiken om de ziekte te behandelen die wordt veroorzaakt door deze RAF-mutatie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

De snel versnelde fibrosarcoma (RAF) familie kinasen spelen een centrale rol in de celbiologie en hun disfunctie leidt tot kankers en ontwikkelingsstoornissen. Een karakterisering van ziekte-gerelateerde RAF mutanten zal ons helpen bij het selecteren van passende therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekten. Recente studies hebben uitgewezen dat de kinasen van de RAF-familie zowel katalytische als allosterische activiteiten hebben, die strak gereguleerd worden door dimerisatie. Hier bouwden we een reeks praktische en haalbare methoden om de katalytische en allosterische activiteiten en de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten te bepalen. Ten eerste hebben we de klassieke in-vitro kinase assay aangepast door de detergens concentratie in buffers te verminderen, gebruikmakend van een zachte Quick Wash procedure, en het gebruik van een glutathion S-transferase (GST) fusie om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie tijdens Zuivering. Dit stelt ons in staat om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten adequaat te meten. Ten tweede ontwikkelden we een roman RAF co-Activation assay om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten te evalueren door gebruik te maken van N-terminale afgeknotte RAF-eiwitten, waardoor de eis van actieve RAS in huidige protocollen wordt geëlimineerd en daardoor een hogere Gevoeligheid. Ten slotte genereerden we een unieke complementaire Split plaats-test om de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van verschillende RAF-mutanten te kwantificeren, wat betrouwbaarder en gevoeliger is in vergelijking met de traditionele Co-Immunoprecipitation-assay. Kortom, deze methoden hebben de volgende voordelen: (1) gebruiksvriendelijk; (2) in staat zijn om effectief te kunnen uitvoeren zonder geavanceerde apparatuur; (3) kosteneffectief; (4) zeer gevoelig en reproduceerbaar.

De familie kinasen van de RAF hebben zowel katalytische als allosterische activiteiten, waardoor hun ziektegerelateerde mutanten de stroomafwaartse signalering kunnen inschakelen via verschillende mechanismen13,14,16,17 ,18. De constitutief actieve RAF mutanten direct fosforylaathun substraten, terwijl de kinase-dode RAF mutanten hun functie vervullen door he...

Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Deze methode vergemakkelijkt de effectieve karakterisering van ziektegerelateerde RAF kinase-methoden. Deze techniek is zeer gevoelig en reproduceerbaar, kosteneffectief, gebruiksvriendelijk en vereist geen geavanceerde apparatuur. Om de katalytische activiteit van RAF-mutanten te meten, introduceert u flag tech mutaties in de RAF-coderingsvolgorde door PCR, voordat u hele sequenties in de juiste vector invoegt volgens standaardprotocollen.Plaats de glutathion als transferase coding sequentie stroomopwaarts van de RAF mutant codering sequenties, om vectoren coderen glutathion als transferase gesmolten RAF mutanten te genereren, op dezelfde manier. Transvect 80%tot 90% confluent 293T celculturen met de vectoren codering van de vlag gelabeld RAF kinases of hun mutanten, volgens de normen protocollen. Na 24 uur cultuur, vervang het medium in elke cultuur.Voeg na 48 uur cultuur 400 microliters lysebuffer toe, aangevuld met protease en fosfphataseremmers, aan elke put op ijs. Na vijf tot tien minuten breng je de cellysates over naar een buis van 1,5 milliliter voor centrifugatie om het celpuin te bespeuren. Breng 300 microliter van elk monster over in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.Zet 40 microliter per monster opzij voor downstream groothandelssfosiel extra cellulair signaal gereguleerde kinase één en twee expressie- en activiteitsamtatieanalyse. Voeg 20 microliter anti-FLAG affiniteit kralen aan elke buis, voor een uur incubatie met rotatie in een vier graden Celsius koude kamer. Aan het einde van de incubatie snel en voorzichtig wassen van de anti vlag kralen een keer met lyse buffer in de koude kamer en een keer met kinase reactie buffer voor het toevoegen van 20 microliters van kinase reactie mengsel.Grafmutanten met een lage Dima-affiniteit kunnen hun katalytische activiteit in vitro verliezen als gevolg van Dima-dissociatie. Daarom is de snelle en zachte was van cruciaal belang. Na 10 minuten bij kamertemperatuur met omkerende om de andere minuut, stop de kinase reacties met vijf microliters van vijf XSDS monsterbuffer, per monster en kook de monsters op 90 graden Celsius gedurende vijf minuten.Voer aan het einde van de incubatie de monsters uit op een negen tot 12%polyacrylamide elektroforese gel met 0,1%SDS en breng de eiwitten vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan om detectie van de niveaus van fosfo-mitogeneactiveerde eiwitkinasen en RAF-mutanten in elk monster, door middel van immunoblotting. Om de Allosteric activiteit van kinase dode RAF mutanten te evalueren, bouwen vectoren codering van de RAF ontvanger of de kinase dode RAF activators. Transvect 293 T cellen met twee vectoren coderen zowel de RAF ontvanger en de kinase dode RAF activator, of een enkele vector coderen een van de eiwitten zoals aangetoond.Oogst de hele cel lysates na 48 uur cultuur zoals aangetoond, en meng snel de schone hele cel lysate met vijf XSDS monster buffer op kamertemperatuur, Voor het koken van de lysates gedurende vijf minuten op 90 graden Celsius. Voer vervolgens de gekookte hele cel lysaat monsters op een negen tot 12%polyacrylamide elektroforese gel dat is 0,1% SDS en breng de eiwitten naar een nitrocellulose membraan voor het opsporen van de niveaus van fosfor extra cellulair signaal geregeld kinase een en twee en controle eiwitten door immuun blotting zoals aangetoond. Om de relatieve dimer affiniteit en of stabiliteit van de RAF mutanten te meten construeren vectoren coderen vlag tech ontwerp mutanten gesmolten aan het eindpunt van Firefly luciferase of de C Terminus een firefly luciferase.Transvect 293 T cellen met een paar vectoren coderen verschillende en Terminus van firefly luciferase RAF mutanten en C Terminus een firefly luciferase RAF mutanten zoals aangetoond. 24 uur na de transvection replate twee keer 10 naar de vijfde 293 T cel transacties per goed in kristalzwarte beeldplaten in kleur vrij medium. 48 uur na de travestie voeg de luciferin toe aan 293 T celtransctenten en broed gedurende 30 minuten.Voor het meten van de luciferase signalen op een multi detectie systeem. Aan het einde van de meting aspirate de supernatents, en blice de afgehandelde 293 T cellen met lysas buffer zoals aangetoond. Voer de hele cel lysate monsters op een negen tot 12%polyacrylamide elektroforese gel met 0,1%SDS.Detecteer de expressieniveaus van het eindeinde van Firefly luciferase RAF mutanten, of het C-eindpunt van Firefly luciferase RAF mutanten door anti vlag amino vlek zoals aangetoond. Normaliseer dan de luciferase signalen van de 293 T celtransvectanten volgens de expressieniveaus van het eindeinde eindeinde van Firefly luciferase en C eindpunt van Firefly luciferase RAF mutanten. De in vitro kinase asa kan worden gebruikt om effectief sonde de katalytische activiteit van sommige constitutief actieve R-spine mutanten, maar niet die van kinase dode mutanten met een gesmolten C-wervelkolom.De katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten met een zwakke, zwakkere affiniteit of stabiliteit kan echter niet worden onderzocht door deze ASA te gebruiken omdat hun dimers tijdens het zuiveringsproces worden gebroken. Om het verlies van katalytische activiteit van RAF-mutanten met zwakke, zwakkere affiniteit of stabiliteit te voorkomen, kunnen deze mutanten worden versmolten met glutothionas transferase om de katalytische activiteit van de mutanten te redden. De RAF co-activatie ASA kan worden gebruikt om de allosterische activiteit van kinase dode RAF Mutants te evalueren.Zoals geïllustreerd kinase dode mutanten met een zuur eind terminal motief en C wervelkolom fusie, functioneren als allosterische activators om de katalytische activiteit van mutanten met een niet fosfor relateerbare zure eindterminal motief, wanneer co uitgedrukt in 293T cellen trigger. Verder kan een gratis split luciferase SA worden gebruikt voor het meten van de relatieve dimer affiniteit of stabiliteit van RAF familie kinases en hun mutanten. Het gebruik van een lysas buffer met een lage concentratie wasmiddel, en een snelle zachte wasprocedure tijdens de monsterzuivering is essentieel voor een succesvolle in vitro kinase SA. Deze techniek zal onderzoekers helpen precies te bepalen hoe ziekte relais de RAF mutanten, activeren van de downstream-route, het vergemakkelijken van de selectie van de juiste therapeutische strategieën voor de behandeling van ziekten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET en MRI geleide bestraling van een Glioblastoma Rat-Model met behulp van een Micro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

Een praktische gids voor de productie en PET/CT beeldvorming van 68Ga-DOTATATE voor neuro-endocriene tumoren in de dagelijkse klinische praktijk

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Computergebaseerde beeldanalyse gebruiken om de kwantificering van longmetastase in het 4T1 Breast Cancer Model te verbeteren

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...