Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

लेखकयुआन Jimin के समर्थन के लिए बालों सेल Leukemia फैलोशिप स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम एशिया फंड कैंसर रिसर्च (AFCR2017/2019-JH), ड्यूक-NUS फू ब्रिज फंडिंग अवार्ड (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF ब्रिजिंग ग्रांट (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), एनसीसीआरएफ पायलट अनुदान (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), और एस.सी.एफ.आर.एफ. अनुसंधान अनुदान (AM/TP011/2018).

1. आरएएफ उत्परिवर्ती की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए विट्रो काइनेज़ परख में
<ol><li>गिब्सन असेंबली या पारंपरिक आणविक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके सी-टर्मिनस पर FLAG (DYKDDK) टैग के साथ आरएएफ म्यूटेंट एन?...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. 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L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

इस लेख में, हम रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट, जो इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और मानार्थ विभाजन luciferase परख में शामिल विशेषता के लिए तीन तरीकों प्रस्तुत किया. चूंकि आरएएफ kinases दोनों उत्प्रेरक गतिवि?...

आरएएफ परिवार kinases आरएएस / RAF/MEK/ERK संकेत झरना का एक प्रमुख घटक है, जो आरएएस से एकसंकेत संचारित mitogen-सक्रिय प्रोटीन kinase (MEK) 1,2,3,4सक्रिय करने के लिए कर रहे हैं। काइनेस का यह परिवार कोशिका विकास , अस्तित्व और भेदभाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है , और उनके परिवर्तन कई रोगों , विशेष रूप से कैंसर5,6,7,8को प्रेरित करते हैं . हाल ही में, जीनोमिक अनुक्रमणों ने कई रोग-संबंधी आरएएफ म्यूटेंटों की पहचान की है जोआरएएस/आरएएफ/एमईके/ईआरके झरना 9,10,11के संकेत संचरण में विभिन्न गुणों का प्रदर्शन करते हैं। आरएएफ म्यूटेंट की एक सावधान विशेषता हमें कैसे आरएएफ उत्परिवर्ती आरएएस के संकेत उत्पादन को बदलने के आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगी / RAF/MEK/ERK झरना, अंततः विभिन्न आरएएफ उत्परिवर्ती संचालित रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण का चयन करें।
आरएएफ परिवार kinases तीन सदस्यों, CRAF, BRAF, और ARAF, जो इसी तरह के आणविक संरचनाओं लेकिन विभिन्न क्षमताओं को सक्रिय करने के लिए डाउनस्ट्रीम संकेतन1,2,3,4शामिल हैं. इन पैरालॉगमेंट्स में, बीआरएएफ की सबसे अधिक गतिविधि इसके गठन के कारण की जाती है , जो कि सबसे कम है (एन-टीएरमिनल एसिडिक ) आकृति12,13,14, जबकि एआरएएफ में सबसे कम है अपनी गैर-कैनोनिकल एपीई आकृति15से उत्पन्न होने वाली गतिविधि | यह रोगों में आरएएफ paralogs के विभिन्न उत्परिवर्तन आवृत्तियों की व्याख्या कर सकते हैं: BRAF और CRAF और ARAF. इसके अलावा, एक ही आरएएफ paralog के भीतर, विभिन्न साइटों में उत्परिवर्तन अलग शिष्टाचार में डाउनस्ट्रीम संकेतन ट्रिगर कर सकते हैं, जो आरएएफ परिवार kinases के विनियमन के लिए जटिलता की एक और परत कहते हैं. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएएफ के सभी काइनेस में उत्प्रेरक और एलोसेटिक दोनों गतिविधियां13,14,16,17,18हैं . Contitutively सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट फॉस्फोरीलेटिंग MEK द्वारा सीधे डाउनस्ट्रीम संकेतन पर बारी है, जबकि kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती पक्ष-से-साइड डिमराइजेशन के माध्यम से अपने जंगली प्रकार समकक्षों को स्थानांतरित कर सकते हैं और MEK-ERK संकेतन 16 सक्रिय करें ,19,20. dimer आत्मीयता / स्थिरता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि न केवल kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती की allosteric गतिविधि निर्धारित करता है, लेकिन यह भी गठन सक्रिय आरएएफ उत्परिवर्ती की उत्प्रेरक गतिविधि को प्रभावित करता है15,21, 22.उच्च dimer आत्मीयता के साथ kinase-मृत आरएएफ म्यूटेंट / स्थिरता अंतर्जात जंगली प्रकार RAFs सीधे15को निष्क्रिय कर सकते हैं , जबकि मध्यवर्ती dimer आत्मीयता के साथ उन / जंगली प्रकार के आरएएफ अणुओं का ऊंचा स्तर13,15,20,21,23कार्य करने के लिए । इसी प्रकार, एक dimer-निर्भर तरीके से, और कम dimer आत्मीयता के साथ उन लोगों के साथ गठन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट फॉस्फोरीलेट MEK, और कम dimer आत्मीयता के साथ उन लोगों को प्रतिरक्षा पर विट्रो में अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो देते हैं कि कमजोर आरएएफ dimers टूट जाता है15, 21,22. dimer आत्मीयता / स्थिरता भी उनके inhibitors के लिए आरएएफ उत्परिवर्ती की संवेदनशीलता निर्धारित करता है, और सकारात्मक आरएएफ inhibitors24के प्रतिरोध के लिए संबंधित है. इसलिए, रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट की विशेषता के लिए, उनके उत्प्रेरक और एलोसेटिक गतिविधियों को मापने के लिए आवश्यक है, और डिमर एफ़िनिटी/
हाल के वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट की विशेषता के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के अनुभव के अनुसार, हमें लगता है कि निम्नलिखित तीन परख रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट को परिभाषित करने में लाभ है: (1) इन विट्रो kinase परख है कि आसानी से किया जा सकता है के लिए गठन की उत्प्रेरक गतिविधि का पता लगाने सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट15; (2) आरएएफ सह सक्रियण परख कि kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती13,15,21,22,23, के allosteric गतिविधि को मापने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका है, 25; (3) मानार्थ विभाजन luciferase परख है कि रिश्तेदार dimer आत्मीयता को मापने में बहुत अधिक संवेदनशीलता है / मात्रात्मक विश्लेषणात्मक विधियों जैसे एसपीआर (स्यूफेस पीलास्मोन आरएसनेंस ) विश्लेषण15,22. इन तीन परख के संयोजन, हम आसानी से समझ सकते हैं कि कैसे एक रोग से संबंधित आरएएफ उत्परिवर्ती बहाव संकेतन बदल देता है और इस तरह इस आरएएफ उत्परिवर्तन की वजह से रोग के इलाज के लिए एक उपयुक्त चिकित्सीय रणनीति का उपयोग.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

तेजी से त्वरित फाइब्रोसार्कोमा (आरएएफ) परिवार kinases सेल जीव विज्ञान में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और उनके रोग कैंसर और विकास संबंधी विकारों की ओर जाता है। रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट का एक लक्षण हमें इन रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त चिकित्सीय रणनीतियों का चयन करने में मदद करेगा। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएएफ परिवार kinases दोनों उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों, जो कसकर dimerization द्वारा विनियमित कर रहे हैं. यहाँ, हम उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों और RAF परिवार kinases और उनके म्यूटेंट के रिश्तेदार dimer आत्मीयता / सबसे पहले, हमने बफर्स में डिटर्जेंट एकाग्रता को कम करके, एक कोमल त्वरित धोने की प्रक्रिया का उपयोग करके, और आरएएफ डिमरकोस को अलग करने से रोकने के लिए एक ग्लूटाथियोन एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी) संलयन को रोजगार देकर क्लासिक इन विट्रो किनेज़ परख में संशोधन किया। शोधन. यह हमें उचित रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए सक्षम बनाता है। दूसरे, हम एक उपन्यास आरएएफ सह सक्रियण परख एन-टर्मिनल छोटा आरएएफ प्रोटीन का उपयोग करके kinase-मृत आरएएफ उत्परिवर्ती की allosteric गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए विकसित की है, वर्तमान प्रोटोकॉल में सक्रिय रास की आवश्यकता को नष्ट करने और इस तरह एक उच्च प्राप्त करने संवेदनशीलता. अंत में, हमने विभिन्न आरएएफ म्यूटेंटकेशों के सापेक्ष द्विमर आत्मीयता/स्थिरता को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक अद्वितीय पूरक विभाजित ल्यूसिफेरेस परख उत्पन्न की है, जो पारंपरिक सह-प्रतिरक्षा परख की तुलना में अधिक विश्वसनीय और संवेदनशील है। सारांश में, इन विधियों के निम्न लाभ हैं: (1) उपयोगकर्ता के अनुकूल; (2) उन्नत उपकरणों के बिना प्रभावी ढंग से बाहर ले जाने में सक्षम; (3) लागत प्रभावी; (4) अत्यधिक संवेदनशील और पुन: उत्पादन ीय।

आरएएफ परिवार kinases दोनों उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों है, जो उनकी बीमारी से संबंधित म्यूटेंट विभिन्न तंत्र13,14,16,17 के माध्यम से बहाव संकेत पर बारी करने के लिए स?...

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Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

इस लेख में, हम आरएएफ परिवार kinases, जो इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और पूरक विभाजन luciferase परख में शामिल हैं रोग से संबंधित म्यूटेंट की विशेषता के लिए व्यावहारिक और व्यावहारिक तरीकों का एक सेट प्रस्तुत किया.

व्यावहारिक और संभावित तरीकों का एक सेट का उपयोग करके आरएएफ परिवार Kinases के रोग से संबंधित उत्परिवर्ती विशेषता

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

यह विधि रोग से संबंधित आरएएफ किनेज़ विधियों के प्रभावी लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है। यह तकनीक अत्यधिक संवेदनशील और प्रजनन योग्य, लागत प्रभावी, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, और इसके लिए किसी उन्नत उपकरण की आवश्यकता नहीं है। आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए, मानक प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त वेक्टर में पूरे दृश्यों को डालने से पहले पीसीआर द्वारा आरएएफ कोडिंग अनुक्रम में फ्लैग टेक म्यूटेशन पेश करें।आरएएफ उत्परिवर्ती कोडिंग अनुक्रमों के अपस्ट्रीम के रूप में ग्लूटाथिएक डालें, एक ही तरीके से ट्रांसफरेज फ्यूज्ड आरएएफ म्यूटेंट के रूप में वैक्टर एन्कोडिंग ग्लूटाथिएक उत्पन्न करने के लिए। ट्रांसवेक्ट 80% से 90% कॉन्फ्लोट 293T सेल संस्कृतियों के साथ वेक्टर के साथ ध्वज टैग आरएएफ kinases या उनके म्यूटेंट, मानकों प्रोटोकॉल के अनुसार। संस्कृति के 24 घंटे के बाद, प्रत्येक संस्कृति में माध्यम की जगह ।संस्कृति के 48 घंटे के बाद, बर्फ पर प्रत्येक अच्छी तरह से प्रोटीज और फॉस्फेटेस अवरोधकों के साथ पूरक लाइसिस बफर के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच से 10 मिनट के बाद सेल के मलबे को तलछट करने के लिए अपकेंद्रित्र के लिए सेल lysates को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित कर दें। प्रत्येक नमूने के 300 माइक्रोलीटर को अलग-अलग 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।डाउनस्ट्रीम थोक में जीवाश्म अतिरिक्त सेलुलर सिग्नल विनियमित किनेज एक और दो अभिव्यक्ति और गतिविधि अमीनो दाग विश्लेषण के लिए प्रति नमूना 40 माइक्रोलीटर अलग सेट करें। एक घंटे के लिए, चार डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में रोटेशन के साथ एक घंटे इनक्यूबेशन के लिए, प्रत्येक ट्यूब के लिए विरोधी झंडा आत्मीयता मोती के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें । इनक्यूबेशन के अंत में जल्दी और धीरे से विरोधी झंडा मोती एक बार ठंडे कमरे में लाइसिस बफर के साथ और kinase प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले kinase प्रतिक्रिया बफर के साथ धोने ।कम दीमा आत्मीयता के साथ ग्राफ म्यूटेंट दीमा वियोजन के कारण विट्रो में अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो सकते हैं। इसलिए, त्वरित और कोमल धोने महत्वपूर्ण है। हर दूसरे मिनट फ्लिपिंग के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के बाद, पांच XSDS नमूना बफर के पांच माइक्रोलीटर के साथ kinase प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, नमूना प्रति और पांच मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों फोड़ा ।इनक्यूबेशन के अंत में, 0.1% एसडीएस के साथ नौ से 12% पॉलीएक्रीलामाइड इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल पर नमूनों को चलाएं, फिर प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली में स्थानांतरित करें ताकि प्रत्येक नमूने में फॉस्फो माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज़ और आरएएफ म्यूटेंट के स्तर का पता लगाने की अनुमति दी जा सके। किनेज़ मृत आरएएफ म्यूटेंट की एलोस्टेरिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, आरएएफ रिसीवर या किनेस मृत आरएएफ एक्टिवेटर को एन्कोडिंग वैक्टर का निर्माण करें। ट्रांसवेक्ट 293 टी कोशिकाओं के साथ दो वैक्टर दोनों आरएएफ रिसीवर और kinase मृत आरएएफ सक्रियक, या एक एकल वेक्टर प्रोटीन के रूप में प्रदर्शन के एक encoding encoding ।48 घंटे की संस्कृति के बाद पूरी सेल को काटा जाता है, और जल्दी से साफ पूरे सेल को कमरे के तापमान पर पांच XSDS नमूना बफर के साथ मिलाएं, ९० डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए lysates उबलने से पहले । फिर उबले हुए पूरे सेल lysate नमूनों को नौ से 12% पॉलीएक्रीलामाइड इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल पर चलाएं जो 0.1% एसडीएस है और प्रोटीन को फॉस्फो अतिरिक्त सेलुलर सिग्नल विनियमित किनेज एक और दो के स्तर का पता लगाने के लिए एक नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली में स्थानांतरित करता है और प्रदर्शन के रूप में प्रतिरक्षा ब्लॉटिंग द्वारा प्रोटीन को नियंत्रित करता है। आरएएफ म्यूटेंट के सापेक्ष मंद आत्मीयता और या स्थिरता को मापने के लिए वेक्टर एन्कोडिंग फ्लैग टेक ड्राफ्ट म्यूटेंट का निर्माण जुगनू लूसिफ़ेरेस या सी टर्मिनस के टर्मिनस को जुगनू लूसिफ़ेरेस के टर्मिनस से जुड़ा हुआ है।ट्रांसवेक्ट 293 टी कोशिकाओं को वैक्टर की एक जोड़ी के साथ विभिन्न और टर्मिनस को जुगनू लूसिफेरेज आरएएफ म्यूटेंट और सी टर्मिनस के एक जुगनू लूसिफ़ेरेस आरएएफ म्यूटेंट के रूप में प्रदर्शित किया गया। 24 घंटे के बाद ट्रांसवेक्शन दो बार 10 से पांचवें २९३ टी सेल लेनदेन प्रति अच्छी तरह से क्रिस्टल काले छवि प्लेटों में रंग मुक्त माध्यम में । ट्रांसवेशन के 48 घंटे बाद लूसिफ़ेरिन को 293 टी सेल ट्रांसवेक्टेंट में डालें और 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें।मल्टी डिटेक्शन सिस्टम पर लूसिफ़ेरेस सिग्नल को मापने से पहले। माप के अंत में सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करते हैं, और प्रदर्शन के अनुसार लिसास बफर के साथ लेनदेन 293 टी कोशिकाओं को ब्लिस करते हैं। पूरे सेल lysate नमूनों को 0.1% एसडीएस के साथ नौ से 12% पॉलीएक्रीलामाइड इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल पर चलाएं।जुगनू लूसिफ़ेरेस आरएएफ म्यूटेंट के अंतिम टर्मिनस के अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाएं, या एंटी फ्लैग अमीनो दाग द्वारा जुगनू लूसिफ़ेरेस आरएएफ म्यूटेंट के सी टर्मिनस का प्रदर्शन किया। फिर जुगनू लूसिफ़ेरेस आरएएफ म्यूटेंट के जुगनू लूसिफ़ेरेस और सी टर्मिनस के अंत टर्मिनस के अभिव्यक्ति स्तर के अनुसार 293 टी सेल ट्रांसवैक्टेंट के लूसिफ़ेरेस संकेतों को सामान्य करें। इन विट्रो किनेज़ आसा का उपयोग कुछ संविलियन सक्रिय आर-स्पाइन म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि की प्रभावी ढंग से जांच करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन एक फ्यूज्ड सी-स्पाइन के साथ किनेज़ मृत म्यूटेंट नहीं।कमजोर मंद आत्मीयता या स्थिरता के साथ संविलियन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को इस आसा का उपयोग करके जांच नहीं की जा सकती है क्योंकि शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान उनके डाइमर टूट जाते हैं। कमजोर मंद आत्मीयता या स्थिरता के साथ आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए, इन म्यूटेंट को म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को बचाने के लिए ग्लूटोथियानस ट्रांसफरेज के साथ जोड़ा जा सकता है। आरएएफ के सह-सक्रियता एएएसए का उपयोग किनेज़ मृत आरएएफ म्यूटेंट की एलोस्टेरिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।अम्लीय अंत टर्मिनल आकृति और सी स्पाइन फ्यूजन के साथ सचित्र किनेज़ मृत म्यूटेंट के रूप में, 2 9 3T कोशिकाओं में व्यक्त किए जाने पर गैर फॉस्फोर रिलेबल अम्लीय अंत टर्मिनल आकृति के साथ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को ट्रिगर करने के लिए एलोस्टेरिक एक्टिवेटर के रूप में कार्य करें। इसके अलावा एक मानार्थ विभाजन लूसिफ़ेरेस एसए रिश्तेदार dimer आत्मीयता या आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट की स्थिरता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । डिटर्जेंट की कम एकाग्रता के साथ एक lysas बफर का उपयोग करना, और नमूना शुद्धिकरण के दौरान एक त्वरित कोमल धोने की प्रक्रिया विट्रो किनेस एसए में सफल के लिए आवश्यक है। इस तकनीक से शोधकर्ताओं को ठीक से यह निर्धारित करने में मदद मिलेगी कि रोग आरएएफ म्यूटेंट को कैसे रिले करता है, डाउनस्ट्रीम मार्ग को सक्रिय करता है, जिससे रोग उपचार के लिए उचित चिकित्सीय रणनीतियों के चयन की सुविधा मिलती है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

थकान के एक माउस मॉडल परिधीय विकिरण से प्रेरित

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

ऑस्टियो में फेफड़े के मेटास्टेसिस परख का उपयोग मेटास्टेटिक फेफड़ों औपनिवेशीकरण अध्ययन में व्यावहारिक विचार

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

पीईटी और एमआरआई एक ग्लियोब्लास्टोमा चूहा एक माइक्रो irradiator का उपयोग कर मॉडल के निर्देशित विकिरण

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Oncogene निर्भरता में सी-फोस और Dusp1 की भूमिका के मूल्यांकन के लिए तरीके

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

फ्लोरोसेंट पेप्टाइड Zymography द्वारा चिढ़ा गतिविधि का पता लगाने

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

उत्पादन और पीईटी/सीटी इमेजिंग के लिए एक व्यावहारिक गाइड ६८GA-DOTATATE न्यूरोएंडोक्राइन के लिए दैनिक नैदानिक अभ्यास में ट्यूमर

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

इन विट्रो परख से अध्ययन ट्यूमर-मैक्रोफेज इंटरेक्शन

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

लाइव सेल में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन को मापने के द्वारा eIF4F विधानसभा की निगरानी

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 स्तन कैंसर मॉडल में फेफड़ों के मेटास्टेसिस के क्वांटिफिकेशन में सुधार करने के लिए कंप्यूटर आधारित छवि विश्लेषण का उपयोग करना

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

आरएनए अनुक्रमण के लिए तीन अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण विधियां: लिम्मा, एजर, डीसेक्यू2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...