Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

著者らは、元ジミンの支援のための毛深い細胞白血病フェローシップを認めたい。この研究は、アジアファンドがん研究(AFCR2017/2019-JH)、デューク-NUSクーブリッジファンディングアワード(デューク-NUS-KBrFA/2018/0014)、NCCRFブリッジ助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(N研究助成金(AM/TP011/2018)

RAF変異体の触媒活性を測定するためのインビトロキナーゼアッセイ
<ol><li>ギブソンアセンブリまたは従来の分子クローニング法を用いて、C終産でFLAG(DYKDDK)タグを用いてRAF変異体(図1A)をコードするベクターを構築する。
	<ol>
<li>FLAGタグと変異をPCRによるRAFコード配列に導入し、ギブソンアセンブリまたはT4 DNAライゲーションを使用してpCDNA3.1(+)ベクターに?...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

本稿では,インビトロキナーゼアッセイ,RAF共活性化アッセイ,無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを含む疾患関連RAF変異体を特徴付けるための3つの方法を紹介した.RAFキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有するので、様々なRAF変異体は、2つの異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達を活性化することができます。</s...

RAFファミリーキナーゼは、RAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達カスケードの重要な構成要素であり、RASからのシグナルを伝達してミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MEK)1、2、3、4を活性化します。キナーゼのこのファミリーは、細胞の増殖、生存および分化に重要な役割を果たし、その変化は多くの疾患、特に癌5、6、7、8を誘発する。近年、ゲノムシーケンシングは、RAS/RAF/MEK/ERKカスケード9、10、11のシグナル伝達において異なる特性を示す多くの疾患関連RAF変異体を同定した。RAF変異体の慎重な特徴付けは、RAF変異体がRAS/RAF/MEK/ERKカスケードの信号出力を変化する方法の分子メカニズムを理解するのに役立ち、最終的には様々なRAF変異体駆動疾患を治療するための適切なアプローチを選択する。
RAFファミリーキナーゼは、CRAF、BRAF、およびARAFの3つのメンバーを含み、同様の分子構造を有するが、下流シグナル伝達1、2、3、4を活性化する能力が異なる。これらのパラログの中で、BRAFは、その構成的にリン酸化されたNtA(N -t erminal acidic)モチーフ12、13、14、ARAFが最も低いのに対して、最も高い活性を有する。その非正規APEモチーフ15から生じる活動.これは、疾患におけるRAFパラログの異なる突然変異周波数を説明するかもしれません: BRAF>CRAF>ARAF.さらに、同じRAFパラログ内で、異なる部位の突然変異が異なる方法で下流シグナリングを引き起こす可能性があり、これはRAFファミリーキナーゼの調節に複雑さの別の層を追加します。最近の研究は、すべてのRAFキナーゼが触媒およびアロステリック活性の両方を持っていることを実証しています13,14,16,17,18.構成的にアクティブなRAF変異体は、MEKをリン酸化することによって下流シグナリングを直接オンにするのに対し、キナーゼ死んだRAF変異体は、左右のダイマライゼーションを通じて野生型の変異体を転移させ、MEK-ERKシグナリング16を活性化することができます。 、19、20.ダイマーアフィニティ/安定性は、キナーゼ死んだRAF変異体のアロステリック活性を決定するだけでなく、構成的に活性なRAF変異体15、21の触媒活性に影響を与える重要なパラメータです。22.ダイマー親和性/安定性の高いキナーゼ死血RAF変異体は、内因性野生型AFを直接15をトランス活性化することができ、中間ダイマー親和性/安定性を有するものは、活性Rasまたは機能する野生型RAF分子の上昇レベル13,15,20,21,23.同様に、構成的に活性なRAF変異体は、ダイマー依存的な方法でMEKをリン酸化し、弱いRAFダイマー15を破壊する免疫沈殿時にインビトロでの触媒活性を失う。 21、22。ダイマーアフィニティ/安定性はまた、それらの阻害剤に対するRAF変異体の感受性を決定し、そしてRAF阻害剤24の耐性に正に相関する。したがって、疾患関連のRAF変異体を特徴付けるためには、触媒およびアロステリック活性、およびダイマー親和性/安定性を測定する必要がある。
近年、当研究室等では、RAFファミリーキナーゼとその変異体を特徴付ける様々な方法を開発しています。当研究室や他者の経験によると、以下の3つのアッセイは、疾患関連のRAF変異体を定義する上で有利であると考えています:(1)構成的に触媒活性を容易に検出できるインビトロキナーゼアッセイアクティブRAF変異体15;(2)キナーゼ死存RAF変異体13、15、21、22、23のアロステリック活性を測定するための信頼性が高く便利な方法であるRAF共活性化アッセイ25;(3)従来の共免疫沈殿アッセイとは対照的に、RAF変異体の相対的な薄暗い親和性/安定性を測定する上ではるかに高い感度を有し、かつ高度な装置なしで行うことができる無料のスプリットルシフェラーゼアッセイSPR(Surface PラスモンRエソナンス)分析15、22などの定量分析方法とは対照的である。 これら3つのアッセイを組み合わせることで、疾患関連のRAF変異体が下流シグナル伝達をどのように変化させるかを容易に理解し、このRAF変異によって引き起こされる疾患を治療するための適切な治療戦略を利用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

急速に加速した線維全腫(RAF)ファミリーキナーゼは細胞生物学において中心的な役割を果たし、その機能不全は癌および発達障害につながる。疾患関連のRAF変異体の特徴付けは、これらの疾患を治療するための適切な治療戦略を選択するのに役立ちます。最近の研究では、RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、これは二層化によって厳しく規制されている。ここでは、触媒およびアロステリック活性とRAFファミリーキナーゼとその変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を決定するための実用的かつ実行可能な方法のセットを構築した。まず、バッファー内の洗剤濃度を低減し、緩やかなクイックウォッシュ手順を利用し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合を採用して、RAFダイマーの解離を防ぐことで、古典的なインビトロキナーゼアッセイを修正しました。浄化。これにより、構成的に活性なRAF変異体の触媒活性を適切に測定することができる。第二に、N末端切り捨てられたRAFタンパク質を用いてキナーゼ死死性RAF変異体のアロステリック活性を評価する新規RAF共活性化アッセイを開発し、現在のプロトコルにおける活性Rasの要件を排除し、より高いレベルを達成した。感度。最後に、我々は、従来の共免疫沈殿アッセイと比較して、より信頼性が高く、敏感である様々なRAF変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を定量的に測定するために、ユニークな相補的な分割ルシフェラーゼアッセイを生成しました。要約すると、これらの方法には、(1) ユーザーフレンドリーな利点があります。(2)高度な機器なしで効果的に行うことができる。(3) 費用対効果が高い。(4)高感度で再現性が高い。

RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、疾患関連変異体が異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達をオンにすることを可能にする 、18.構成的に活性なRAF変異体は基質を直接リン酸化し、キナーゼ死死性RAF変異体は野生型?...

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Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

この方法は、疾患関連RAFキナーゼ法の効果的な特徴付けを促進する。この技術は非常に敏感で再現性が高く、費用効果が大きく、ユーザーフレンドリーで、高度な機器を必要としません。RAF変異体の触媒活性を測定するには、標準的なプロトコルに従って適切なベクターに配列全体を挿入する前に、PCRによってRAFコードシーケンスにフラグ技術変異を導入する。RAF変異体コード配列の上流にトランスレクターゼコーディング配列としてグルタチオンを挿入し、トランスポファーゼとしてグルタチオンをコードするベクターを生成し、同様にRAF変異体を融合させた。標準プロトコルに従って、フラグタグ付きRAFキナーゼまたはその変異体をコードするベクターを持つ80%〜90%confluent 293T細胞培養をトランスベクトする。24時間培養した後、各培養液中の培地を交換する。48時間培養後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのリシスバッファーを氷上の各ウェルに加える。5〜10分後、細胞のライセートを1.5ミリリットルチューブに移し、遠心分離して細胞の破片を沈下させる。各サンプルの300マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移す。下流卸売用のリゼート化石細胞外シグナルレギュレートキナーゼ1と2の発現と活性アミノブロット分析のために、サンプルあたり40マイクロリットルを確保します。各チューブに20マイクロリットルのアンチフラッグアフィニティービーズを加え、摂氏4度の冷たい部屋での回転で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに迅速かつ穏やかに冷たい部屋でリシスバッファーで一度、キナーゼ反応液で1回、キナーゼ反応混合物の20マイクロリットルを追加する前に、穏やかに洗浄します。低いディマアフィニティーを持つグラフ変異体は、ディマ解離のためにインビトロで触媒活性を失う可能性があります。したがって、迅速かつ穏やかな洗浄が重要です。1分おきに反転して室温で10分後、サンプルあたり5マイクロリットルの5つのXSDSサンプルバッファーでキナーゼ反応を停止し、サンプルを摂氏90度で5分間沸騰させます。インキュベーションの最後に、0.1%SDSの9〜12%ポリアクリルアミド電気泳動ゲルでサンプルを実行し、その後、各サンプル中のリンスマイトゲン活性化タンパク質キナーゼおよびRAF変異体のレベルを検出できるように、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、免疫ブロットによって検出します。キナーゼデッドRAF変異体のアロステリック活性を評価するために、RAF受信機またはキナーゼデッドRAF活性化剤をコードするベクターを構築する。293 T細胞をトランスベクト293 T細胞は、RAFレシーバとキナーゼ死んだRAF活性化剤の両方をコードする2つのベクターを有する、またはデモンストレーションされるようにタンパク質の1つをコードする単一のベクターである。48時間培養後に全細胞ライゼを収穫し、室温で5つのXSDSサンプルバッファーときれいな全細胞ライセートを素早く混合し、90°Cで5分間煮る前に。次に、沸騰した全細胞ライセートサンプルを0.1%SDSの9〜12%ポリアクリルアミド電気泳動ゲルで実行し、タンパク質をニトロセルロース膜に移して、リンホスホウ外細胞シグナル調節キナーゼ1と2のレベルを検出し、実証したように免疫ブロッティングによってタンパク質を制御します。RAF変異体の相対的なダイマー親和性およびまたは安定性を測定するために、ホタルルシメラーゼまたはC末語であるホタルルシメラーゼの末流に融合したフラグ技術ドラフト変異体をコードするベクターを構築する。293 T細胞は、デモンストレーションのようにホタルルシファーゼRAF変異体とCターミナスの異なるとテルミナスをコードする一対のベクターを有する。トランスベクションリプレート後24時間後、20〜5回目の293 T細胞トランザクションは、色フリー媒体の結晶黒色の画像プレートに十分に。女装後48時間後、ルシフェリンを293 T細胞トランスベクテントに加え、30分間インキュベートする。マルチ検出システム上のルシファーゼ信号を測定する前に.測定終了時にスーパーナテントを吸引し、例示したようにリサバッファーを有する293T細胞を滑らかにする。0.1%SDSの9〜12%ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で細胞全体のライセートサンプルを実行します。デモに示すように、フラフライルシファーゼRAF変異体の終末端、又は、抗フラグアミノブロットによるホタルルシファーゼRAF変異体のC末端を検出する。次に、293 T細胞トランスベクタントのルシメラーゼ信号をホタルルシファーゼの終末端およびホタルルシファーゼRAF変異体のC末端の発現レベルに従って正常化する。in vitroキナーゼasaは、いくつかの構成的に活性なR-脊椎変異体の触媒活性を効果的にプローブするために使用することができるが、融合されたC背脊椎を有するキナーゼ死んだ変異体のそれではない。しかし、弱いダイマー親和性または安定性を有する構成活性RAF突然変異体の触媒活性は、精製プロセス中にダイマーが壊れるため、このASAを使用して探査されない可能性がある。弱いダイマー親和性または安定性を有するRAF変異体の触媒活性の喪失を避けるために、これらの変異体は、変異体の触媒活性を救うためにグルトチオナストランスパーゼと融合することができる。RAFの共活性化ASAはキナーゼ死んだRAFミュータントのアロステリック活性を評価するために使用することができる。酸性末端モチーフとC脊椎融合を有するキナーゼ死死性変異体を例示したように、アロステリック活性化剤として機能し、293T細胞で共発現した場合に非リン酸終末末モチーフを有する変異体の触媒活性を引き起こす。さらに、無料のスプリットルシファーゼSAは、RAFファミリーキナーゼおよびその変異体の相対的なダイマー親和性または安定性を測定するために使用することができる。低濃度の洗剤を用いたリサバッファーを使用し、サンプル精製時の迅速な穏やかな洗浄手順は、インビトロキナーゼSAの成功のために不可欠です。この技術は、研究者がRAF突然変異体をリレーする疾患を正確に決定し、下流経路を活性化し、疾患治療のための適切な治療戦略の選択を促進するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET や MRI 誘導照射ラットの神経膠芽腫モデルのマイクロ照射器を使用して

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

蛍光ペプチド ザイモグラフィーによってプロテアーゼ活性の検出

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

生産と日常臨床神経内分泌腫瘍の68Ga DOTATATE ペット/CT イメージングのための実用的なガイド

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

ライブセルにおけるeIF4E-eIF4G相互作用を測定してeIF4Fアセンブリをモニタリング

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...