Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

저자는 위안 지민의 지원을 위한 털이 많은 세포 백혈병 동호회를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 아시아 펀드 암 연구 (AFCR2017 / 2019-JH), 듀크 누스 쿠 브릿지 자금 조달 상 (듀크 - NUS-KBrFA / 2018 / 0014), NCCRF 브리징 보조금 (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF 파일럿 보조금 (NCCRF-YR2017-2017)에 의해 지원되었습니다. 연구 보조금 (AM/ TP011/2018).

1. RAF 돌연변이의 촉매 활동을 측정하기위한 체외 키나제 분석
<ol><li>Gibson 어셈블리 또는 기존분자 복제 방법을 사용하여 C-종단에서 RAF 돌연변이체(그림 1A)를 FLAG(DYKDDDDK) 태그로 코딩하는 벡터를 생성합니다.
	<ol>
<li>PRS에 의해 RAF 코딩 서열에 FLAG 태그 및 돌연변이를 소개하고, 깁슨 어셈블리 또는 T4 DNA 결찰을 사용하고 제조의 프로토콜을 따라 pCDNA3.1(+) 벡터에...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 무료 분할 루시페라아아제 분석법을 포함하는 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하는 세 가지 방법을 제시했습니다. RAF 키나아제는 촉매 활성과 알로스테릭 활성을 모두 갖기 때문에, 다양한 RAF 돌연변이체는 두 가지 메커니즘을 통해 다운스트림 신호를 활성화할 수 있다13,14,<sup c...

RAF 계모 키나아제는 RAS/RAF/MEK/ERK 신호 캐스케이드의 핵심 구성 요소로, RAS로부터 신호를 전송하여 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MEK)1,2,3,4를활성화합니다. 키나아제의 이 가족은 세포 성장, 생존 및 분화에 중요한 역할을 하며, 이들의변화는 많은 질병, 특히 암 5,6,7,8을유발한다. 최근, 게놈 염기서열 분석은 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드9,10,11의신호 전송에 상이한 특성을 나타내는 많은 질병 관련 RAF 돌연변이체를 확인하였다. RAF 돌연변이체의 신중한 특성화는 RAF 돌연변이체가 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드의 신호 출력을 변경하는 방법의 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며, 결국 다양한 RAF 돌연변이 구동 질환 치료에 적합한 접근법을 선택하는 데 도움이 됩니다.
RAF 패밀리 키나제는 3개의 멤버, CRAF, BRAF 및 ARAF를 포함하며, 이는유사한 분자 구조를 가지고 있지만 다운스트림 신호화 1,2,3,4를활성화하는 다른 능력을 가진다. 이러한 파라로그 중에서 BRAF는 인산화된 NtA(N -terminal acidic) 모티프12,13,14,ARAF가 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 비 정식 APE 모티프에서 발생하는 활동15. 이것은 질병에 있는 RAF paralogs의 다른 돌연변이 주파수를 설명할 수 있습니다: BRAF>CRAF>ARAF. 더욱이, 동일 RAF paralog 내의, 다른 사이트에 있는 돌연변이는 RAF 가족 키나아제의 규칙에 복잡성의 또 다른 층을 추가하는 별개의 방식으로 다운스트림 신호를 시작할 수 있습니다. 최근 연구는 모든 RAF 키나제는 촉매 및 allosteric 활동모두 13,14,16,17,18을가지고 있음을 입증했다. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 MEK를 인산화하여 하류 신호를 직접 켜는 반면, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 좌우 이량화를 통해 야생 형 대응을 트랜스 활성화하고 MEK-ERK 신호 16을 활성화할 수 있습니다. ,19,20. 이량친 친화성/안정성은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 결정할 뿐만 아니라 조직적으로 활성RAF 돌연변이체(15,21)의 촉매 활성에 영향을 미치는 주요 파라미터이다. 22. 높은 이분화 친화성/안정성을 가진 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 내인성 야생형 RAF를 직접 15로 변환 할 수 있으며 중간 이량 친화성 / 안정성을 가진 돌연변이는 활성 Ras 또는 야생 형 RAF 분자의 높은 수준은 기능13,15,20,21,23. 유사하게, 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 이량체 의존적 방식으로 MEK를 인산화하고, 낮은 이량친 친화성/안정성을 가진 사람들은 약한 RAF 이동기를 깨뜨리는 면역 침전 시 시험관내에서 촉매 활성을 잃는다15, 21,22. 이량친친화성/안정성은 또한 그들의 억제제에 대한 RAF 돌연변이체의 민감도를 결정하고, RAF 억제제(24)의 내성에 긍정적으로 상관관계가 있다. 따라서 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하기 위해서는 촉매 및 알로스테릭 활동을 측정하고 친화성/안정성을 변화시켜야 합니다.
최근 몇 년 동안, 우리의 실험실 및 다른 RAF 가족 키나아제와 그들의 돌연변이를 특성화 하는 다양 한 방법을 개발 했다. 우리의 실험실 및 다른 사람의 경험에 따르면, 우리는 다음 세 가지 분석이 질병 관련 RAF 돌연변이를 정의하는 데 장점이 있다고 생각합니다: (1) 체외 키나아제 분석제는 구성적으로 촉매 활성을 검출하기 위해 쉽게 수행 될 수 있습니다. 활성 RAF돌연변이체 15; (2) RAF 공동 활성화 분석법은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체13,15,21, 22,23의알로스테릭 활성을 측정하는 안정적이고 편리한 방법이다. 25; (3) 기존의 동면역침전 분석과 는 달리 RAF 돌연변이체의 상대이량 친화성/안정성을 측정하는 데 훨씬 더 높은 감도를 가지며, 첨단 장비 없이도 수행할 수 있는 무료 분할 루시페라아제 분석 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석15,22와같은 정량적 분석 방법과는 대조적이다. 이 3개의 검사를 결합하는, 우리는 질병 관련 RAF 돌연변이가 어떻게 하류 신호를 바꾸는지 쉽게 이해할 수 있고, 그로 인하여 이 RAF 돌연변이에 기인한 질병을 취급하기 위하여 적당한 치료 전략을 이용하.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

급속하게 가속화된 섬유육종 (RAF) 가족 키나아제는 세포 생물학에 있는 중앙 역할을 하고 그들의 역기능은 암과 발달 무질서로 이끌어 냅니다. 질병 관련 RAF 돌연변이체의 특성화는 우리가 이 질병 취급을 위한 적당한 치료 전략을 선택하는 것을 도울 것입니다. 최근 연구에 따르면 RAF 패밀리 키나아제는 촉매 작용과 알로스테릭 활동이 모두 있으며, 이는 이분화에 의해 엄격하게 조절됩니다. 여기에서, 우리는 촉매 및 allosteric 활동 및 RAF 가족 키나아제 및 그들의 돌연변이체의 상대적인 이량친 친화성/안정성을 결정하기 위하여 실용적이고 실행 가능한 방법의 세트를 건설했습니다. 첫째, 완충제의 세제 농도를 줄이고, 완만한 세척 절차를 활용하고, RAF 이분분석(GST) 융합을 사용하여 RAF 이완제 중 해리되는 것을 방지함으로써 고전적인 시험관내 키나아제 분석기를 개정했습니다. 정화. 이를 통해 우리는 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 적절히 측정할 수 있다. 둘째, N-말단 절단 된 RAF 단백질을 사용하여 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 평가하기 위한 새로운 RAF 공동 활성화 분석방법을 개발하여 현재 프로토콜에서 활성 Ras의 요구 사항을 제거하고 더 높은 것을 달성했습니다. 감도. 마지막으로, 우리는 전통적인 동면역침전 분석실험에 비해 더 안정적이고 민감한 다양한 RAF 돌연변이체의 상대적 이량친 친화성/안정성을 정량적으로 측정하기 위해 독특한 상보성 분할 루시페라아아제 분석법을 생성했다. 요약하자면, 이러한 방법에는 다음과 같은 장점이 있습니다: (1) 사용자 친화적인; (2) 고급 장비없이 효과적으로 수행 할 수; (3) 비용 효율적; (4) 매우 민감하고 재현 가능.

RAF 패밀리 키나아제는 촉매 및 알로스테릭 활동을 모두 가지고 있으며, 이는 질병 관련 돌연변이가 다른 메커니즘13,14,16,17을 통해 하류 신호를 켤 수 있게 합니다. ,18. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 직접 그들의 기질을 인산화하고, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생?...

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Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

이 방법은 질병 관련 RAF 키나아제 방법의 효과적인 특성화를 용이하게 한다. 이 기술은 매우 민감하고 재현 가능하며 비용 효율적이며 사용자 친화적이며 고급 장비가 필요하지 않습니다. RAF 돌연변이의 촉매 활성을 측정하려면 표준 프로토콜에 따라 전체 서열을 적절한 벡터에 삽입하기 전에 PCR에 의해 RAF 코딩 서열에 플래그 기술 돌연변이를 삽입합니다.글루타티온을 RAF 돌연변이 코딩 시퀀스의 트랜스퍼라제 코딩 시퀀스 업스트림으로 삽입하여 글루타티온을 트랜스포마이즈 융합 RAF 돌연변이체로 인코딩하는 벡터를 동일한 방식으로 생성한다. 표준 프로토콜에 따라 표태그가 지정된 RAF 키나아제 또는 돌연변이를 코딩하는 벡터를 가진 80%에서 90%의 컨런트 293T 세포 배양을 변환합니다. 24 시간의 문화 후 각 문화에서 매체를 교체하십시오.48시간의 배양 후, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 400마이크로리터의 용액을 얼음 위에 잘 넣습니다. 5-10분 후에 세포는 세포 잔해를 퇴적시키기 위해 원심분리를 위해 1.5 밀리리터 튜브로 용해됩니다. 각 샘플의 300마이크로리터를 개별 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기습니다.다운스트림 도매 용액 화석 추가 세포 신호 조절 키나아제 1 및 2 발현 및 활성 아미노 블롯 분석을 위한 샘플 당 40 마이크로리터를 따로 설정합니다. 각 튜브에 안티 플래그 친화성 구슬 20 마이크로 리터를 추가하여 섭씨 4도의 차가운 방에서 회전하여 1 시간 동안 인큐베이션을 합니다. 인큐베이션의 끝에서 는 차가운 방에 리시스 버퍼로 한 번, 키나제 반응 버퍼로 한 번 안티 플래그 구슬을 재빨리 세척한 후 키나아제 반응 혼합물의 20 마이크로리터를 첨가한다.디마 선호도가 낮은 그래프 돌연변이는 디마 해리때문에 체외에서 촉매 활성을 잃을 수 있습니다. 따라서 빠르고 부드러운 세척이 중요합니다. 실온에서 10분 동안 다른 분마다 뒤집힌 후, 샘플당 5개의 XSDS 샘플 버퍼로 키나아제 반응을 멈추고 샘플을 섭씨 90도에서 5분간 끓입니다.인큐베이션의 끝에서, 0.1%SDS를 가진 9-12%의 폴리아크릴아미드 전기포고이젤에 견본을 실행한 다음, 면역 분비질에 의하여 각 견본에 있는 인산 미토겐 활성화한 단백질 키나아제 및 RAF 돌연변이의 수준을 검출할 수 있도록 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전송합니다. 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스터 활성을 평가하기 위해 RAF 수신기 또는 키나아제 죽은 RAF 활성제를 인코딩하는 벡터를 구성합니다. 2개의 벡터를 가진 트랜스Ct 293 T 세포는 RAF 수신기와 키나아제 죽은 RAF 활성제, 또는 단일 벡터를 코딩하는 것으로 입증된 바와 같이 단백질 중 하나를 인코딩하였다.전체 셀용액을 48시간 동안 수확한 후, 깨끗한 전체 셀 용액을 실온에서 5개의 XSDS 샘플 버퍼와 빠르게 혼합한 후, 90°C에서 5분간 용재를 끓입니다. 그런 다음 삶은 전체 세포 용해 시료를 9~12%의 폴리아크릴아미드 전기포고이스 젤로 실행하고 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이송하여 인엑스트라 세포 신호 조절 키나아제 1및 2의 수준을 검출하고 면역 블로팅에 의한 단백질을 조절한다. RAF 돌연변이의 상대적 이머 친화성 및 또는 안정성을 측정하기 위해 반딧불 루시파라제 또는 C 터미누스 반딧불 루시파라제의 종족에 융합된 플래그 기술 드래프트 돌연변이를 인코딩하는 벡터를 구성한다.반딧불 루시파제 RAF 돌연변이체와 C 터미누스의 상이하고 종신을 코딩하는 벡터 쌍의 293 T 세포를 반딧불 루시파제 RAF 돌연변이체. 트랜스프션 후 24시간 10~5차 293T 셀 트랜잭션을 잘 하여 색이 없는 매체의 크리스탈 블랙 이미지 플레이트로 한다. 복장 도착 후 48 시간 293 T 세포 경배분에 루시퍼린을 추가하고 30 분 동안 배양합니다.복수 검출 시스템에서 루시파아제 신호를 측정하기 전에. 측정의 끝에서 슈퍼 네티텐트를 흡인하고, 입증 된 대로 리사 버퍼와 거래 된 293 T 셀을 블리빙. 전체 세포 용액 샘플을 9~ 12% 폴리아크릴아미드 전기포레시스 젤에 0.1%SDS로 실행합니다.반딧불이 루시파라제 RAF 돌연변이의 종말 종단의 발현 수준을 감지하거나, 반딧불 루시파라기 RAF 돌연변이의 C 종점은 입증된 바와 같이 안티 플래그 아미노 블롯에 의한 반딧불 루시파라기 RAF 돌연변이의 종자. 그런 다음 반딧불 루시파라제와 반딧불 루시파라제 RAF 돌연변이체의 C 종단의 발현 수준에 따라 293 T 세포 경피제의 루시파래아제 신호를 정규화한다. 체외 키나아제 아사는 일부 구성 활성 R-척추 돌연변이체의 촉매 활성을 효과적으로 조사하는 데 사용할 수 있지만, 융합된 C-척추를 가진 키나아제 죽은 돌연변이의 활성은 그렇지 않습니다.그러나 약한 이질친 친화성 또는 안정성을 가진 구성 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성은, 정화 과정에서 그들의 희미한 자가 파손되기 때문에 이 ASA를 사용하여 조사되지 않을 수 있다. 약한 이질친 친화성 또는 안정성을 가진 RAF 돌연변이의 촉매 활성의 손실을 피하기 위해, 이러한 돌연변이는 돌연변이의 촉매 활성을 구출하기 위해 글루토티오나 트랜스포아제와 융합될 수 있다. RAF 공동 활성화 ASA는 키나아제 죽은 RAF 돌연변이의 알로스터 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.산성 말단 모티프 및 C 척추 융합을 가진 키나아제 죽은 돌연변이체와 같이, 알로스테릭 활성제로서 기능하여 293T 세포에서 공동 발현될 때 비 인광체 절제성 산성 말단 모티브를 가진 돌연변이체의 촉매 활성을 유발한다. 또한 무료 분할 루시파라제 SA는 RAF 가족 키나아제 및 돌연변이의 상대적인 이머 친화성 또는 안정성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 세제의 농도가 낮은 리사 버퍼를 사용하고, 시료 정제 시 빠른 부드러운 세척 절차는 시험관내 키나아제 SA에 필수적이다. 이 기술은 연구원이 질병이 RAF 돌연변이를 중계하고, 다운스트림 통로를 활성화하고, 질병 처리를 위한 적당한 치료 전략의 선택을 촉진하는 방법을 정확하게 결정하는 것을 도울 것입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

연구

암 연구학

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

애완 동물 및 MRI 유도 세포종 쥐 모델의 방사선 마이크로 irradiator를 사용 하 여

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

생산 및 매일 임상 연습에서 신경 내 분 비 종양에 대 한 68Ga-DOTATATE의 PET/CT 영상에 대 한 실용적인 가이드

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...