Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer a bolsa de leucemia de células peludas para o apoio de Yuan Jimin. Este trabalho foi apoiado pela Ásia fundo Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge financiamento Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF Pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), e SHF medicina acadêmica Subvenção à investigação (AM/TP011/2018).

1. ensaio in vitro quinase para medir a atividade catalítica de mutantes da RAF
<ol><li>Construa vetores codificando mutantes da RAF (Figura 1a) com tag Flag (dykddddk) no C-Terminus usando o conjunto Gibson ou métodos tradicionais de clonagem molecular.
	<ol>
<li>Introduza o Tag e as mutações da bandeira nas seqüências de codificação do RAF por PCRs, e insira então seqüências inteiras no vetor do pCDNA 3.1 (+) usando o conjunto de Gibson ou a ligadura do ADN T4...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

Neste artigo, nós apresentamos três métodos para caracterizar Mutants doença-relacionados do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase. Uma vez que a RAF quinases tem atividade catalítica e atividade alostômica, vários mutantes da RAF podem ativar a sinalização a jusante através de dois mecanismos distintos13,14,16,<sup class...

As quinases da família RAF são um componente chave da cascata de sinalização Ras/Raf/MEK/Erk, que transmitem um sinal de RAS para ativar a proteína quinase ativada por mitogen (MEK)1,2,3,4. Esta família de quinases desempenha um papel crucial no crescimento celular, sobrevivência e diferenciação, e suas alterações induzem muitas doenças, notadamente o câncer5,6,7,8. Recentemente, os sequenciamentos de Genomic identificaram muitos mutantes doença-relacionados do RAF que exibem propriedades diferentes na transmissão do sinal de Ras/Raf/MEK/Erk cascata9,10,11. Uma caracterização cuidadosa dos mutantes da RAF nos ajudará a entender os mecanismos moleculares de como os mutantes da RAF alteram a saída de sinal da cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selecionam abordagens apropriadas para o tratamento de várias doenças movidas por mutantes da RAF.
As quinases da família RAF incluem três membros, CRAF, BRAF e Araf, que têm estruturas moleculares semelhantes, mas diferentes habilidades para ativar a sinalização a jusante1,2,3,4. Entre estes paralogs, braf tem a atividade a mais elevada em virtude de seu Motif constitutivamente fosforilada NTA (N-tirtual umcidic)12,13,14, quando Araf tiver o mais baixo atividade decorrente de seu motivo não canônico APE15. Isto pode explicar as freqüências diferentes da mutação de de do RAF nas doenças: BRAF > CRAF > Araf. Além disso, dentro do mesmo paralog do RAF, as mutações em locais diferentes podem provocar a sinalização a jusante em maneiras distintas, que adiciona uma outra camada de complexidade à regulação de kinases da família do RAF. Estudos recentes demonstraram que todas as cinases da RAF têm atividades catalíticas e alopestericas13,14,16,17,18. Mutantes constitutivamente ativos da RAF giram sobre a sinalização a jusante diretamente pela fosforilação MEK, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead podem transacionar seus homólogos do tipo selvagem através da dimerização lado a lado e ativar a sinalização de MEK-ERK16 ,19,20. A afinidade/estabilidade do dímero é um parâmetro-chave que não só determina a atividade alostômica de mutantes da RAF de quinase morta, mas também afeta a atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos15,21, 22. a quinase-mortos RAF mutantes com alta afinidade de dímero/estabilidade pode transacionar o Wild-Type endógena rafs diretamente15, enquanto aqueles com intermediário dímero afinidade/estabilidade requer uma coordenação de Ras ativas ou um nível elevado de moléculas de RAF do tipo selvagem para funcionar13,15,20,21,23. Similarmente, mutantes constitutivamente ativos do RAF fosforilar MEK em uma maneira dímero-dependente, e aqueles com baixa afinidade/estabilidade do dímero perdem sua atividade catalítica in vitro em cima da imunoprecipitação que quebra os dímeros fracos do RAF15, 21,22. A afinidade/estabilidade do dímero também determina a sensibilidade dos mutantes da RAF aos seus inibidores e correlaciona-se positivamente com a resistência dos inibidores da RAF24. Portanto, para caracterizar os mutantes da RAF relacionados à doença, é necessário medir suas atividades catalíticas e aloestericas e afinidade/estabilidade de dímero.
Nos últimos anos, nosso laboratório e outros desenvolveram vários métodos para caracterizar as cinases da família RAF e seus mutantes. De acordo com o nosso laboratório e a experiência dos outros, pensamos que os três ensaios seguintes têm vantagens na definição de mutantes da RAF relacionados com a doença: (1) o ensaio in vitro quinase que pode ser realizado com facilidade para detectar a atividade catalítica de constitutivamente mutantes ativos da RAF15; (2) o ensaio da co-ativação do RAF que é um método confiável e conveniente para medir a atividade alostérico de mutantes da quinase-inoperante RAF13,15,21,22,23, de 25; (3) o ensaio de luciferase de divisão complementar que tem sensibilidade muito maior na medição da afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes da RAF em contraste com o ensaio de co-imunoprecipitação tradicional, e é capaz de realizar sem equipamentos avançados em contraste com os métodos analíticos quantitativos como a análise de SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estes três ensaios, nós podemos compreender facilmente como um mutante doença-relacionado da RAF altera a sinalização a jusante e utiliza desse modo uma estratégia terapêutica apropriada para tratar a doença causada por esta mutação do RAF.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

O fibrosarcoma ràpida acelerado (RAF) quinases da família jogam um papel central na biologia de pilha e sua deficiência orgânica conduz aos cancros e às desordens desenvolventes. Uma caracterização de mutantes da RAF relacionados à doença nos ajudará a selecionar estratégias terapêuticas apropriadas para o tratamento dessas doenças. Estudos recentes mostraram que as cinases familiares da RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que são fortemente reguladas por dimerização. Aqui, construímos um conjunto de métodos práticos e viáveis para determinar as atividades catalíticas e aloestericas e a afinidade/estabilidade do dímero relativo das cinases familiares da RAF e seus mutantes. Em primeiro lugar, alteramos o ensaio de quinase in vitro clássico, reduzindo a concentração de detergente em buffers, utilizando um procedimento de lavagem rápida suave, e empregando uma fusão de glutationa S-transferase (GST) para evitar que os dímeros da RAF se dissociem durante Purificação. Isto permite-nos de medir apropriadamente a atividade catalítica de mutantes constitutivamente ativos da RAF. Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio novo da coativação do RAF para avaliar a atividade alostérico de mutantes da RAF da quinase-inoperante usando proteínas truncadas do RAF do N-terminal, eliminando a exigência de Ras ativas em protocolos atuais e conseguindo desse modo um mais elevado Sensibilidade. Finalmente, nós geramos um único ensaio complementar da luciferase da separação para medir quantitativamente a afinidade/estabilidade do dímero relativo de vários mutantes do RAF, que é mais de confiança e sensível comparado ao ensaio tradicional da co-imunoprecipitação. Em resumo, esses métodos têm as seguintes vantagens: (1) fácil de usar; (2) capaz de realizar eficazmente sem equipamento avançado; (3) custo-eficaz; (4) altamente sensível e reprodutível.

As quinases da família RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que permitem que seus mutantes relacionados à doença ativem a sinalização a jusante através de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Os mutantes da RAF constitutivamente ativos fosforilar diretamente seus substratos, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead cumprem sua função atra...

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Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Neste artigo, nós apresentamos um jogo de métodos práticos e viáveis para caracterizar mutantes doença-relacionados de kinases da família do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase.

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Este método facilita a caracterização efetiva dos métodos de quinase raf relacionados à doença. Esta técnica é altamente sensível e reprodutível, econômica, fácil de usar, e não requer nenhum equipamento avançado. Para medir a atividade catalítica dos mutantes da RAF, introduza mutações tecnológicas de bandeira na sequência de codificação da RAF pelo PCR, antes de inserir sequências inteiras no vetor apropriado de acordo com os protocolos padrão.Insira o glutationo como sequência de codificação transferase a montante das sequências de codificação mutantes da RAF, para gerar vetores codificando glutationa como mutantes da RAF fundidos transferase, da mesma forma. Transvect 80%a 90% confluente culturas celulares 293T com os vetores codificando a bandeira marcada raf kinases ou seus mutantes, de acordo com protocolos de padrões. Após 24 horas de cultura, substitua o meio em cada cultura.Após 48 horas de cultura, adicione 400 microliters de tampão de lise suplementados com inibidores de protease e fosfatase, a cada poço no gelo. Após cinco a 10 minutos, transfira os lises celulares para um tubo de 1,5 mililitro para centrifugação para sedimentar os detritos celulares. Transfira 300 microliters de cada amostra para tubos individuais de micro centrífugas de 1,5 mililitro.Reserve 40 microliters por amostra para o sinal celular extra fóssil a jusante regulado quinase um e dois análises de expressão e atividade amino blot. Adicione 20 microliters de contas de afinidade anti-FLAG a cada tubo, para uma incubação de uma hora com rotação em uma sala fria de quatro graus Celsius. No final da incubação, lave rapidamente e suavemente as contas anti-bandeira uma vez com tampão de lise na sala fria e uma vez com tampão de reação de quinase antes de adicionar 20 microliters de mistura de reação quinase.Mutantes gráficos com baixa afinidade dima podem perder sua atividade catalítica in vitro por causa da dissociação de Dima. Portanto, a lavagem rápida e suave é crítica. Depois de 10 minutos em temperatura ambiente com a inversão a cada dois minutos, pare as reações de quinase com cinco microliters de cinco tampão de amostra XSDS, por amostra e ferva as amostras a 90 graus Celsius por cinco minutos.No final da incubação, execute as amostras em um gel de eletroforrose de 9 a 12% de poliacrilamida com SDS 0,1%, depois transfira as proteínas para uma membrana nitrocelulose para permitir a detecção dos níveis de proteína mitogógena ativada por fosfogênio quinase e mutantes raf em cada amostra, por imuno-blotting. Para avaliar a atividade alusica de mutantes da RAF mortos pela quinase, construa vetores codificando o receptor RAF ou os ativadores da RAF mortos quinase. Transvect 293 Células T com dois vetores codificando tanto o receptor RAF quanto o ativador RAF morto quinase, ou um único vetor codificando uma das proteínas como demonstrado.Colhe toda a célula lysates após 48 horas de cultura como demonstrado, e misture rapidamente todo o lysato celular limpo com cinco tampão de amostra XSDS à temperatura ambiente, antes de ferver os lises por cinco minutos a 90 graus Celsius. Em seguida, execute as amostras de lise celular inteira cozida em um gel de eletroforese de 9 a 12% de poliacrilamida que é 0,1%SDS e transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose para detectar os níveis de sinal celular extra fosfo regulado quinase um e dois e controlar proteínas por manchas imunológicas como demonstrado. Para medir a relativa afinidade dimer e ou estabilidade dos mutantes da RAF construir vetores codificando os mutantes de rascunho de bandeira fundidos ao término da luciferase firefly ou o C Terminus uma luciferase vagalume.Transvect 293 Células T com um par de vetores codificando diferentes e Terminus de mutantes da RAF de flumebra e C Terminus uma luciferase de vagalume mutantes da RAF como demonstrado. 24 horas após a transvecção relatar duas vezes 10 para a quinta transação de células T 293 por poço em placas de imagem preta cristalina em meio livre de cores. 48 horas após a transvesção adicione a luciferina a transvectents de células T de 293 e incubar por 30 minutos.Antes de medir os sinais de luciferase em um sistema de detecção multi. No final da medição aspiram os supernatents, e os blices transacionados 293 células T com tampão lysas como demonstrado. Execute as amostras de lise celular inteira em um gel de eletroforese de poliacrilamida de 9 a 12% com SDS de 0,1%.Detecte os níveis de expressão do término final dos mutantes da RAF firefly, ou o termo C dos mutantes da RAF por anti-bandeira amino blot como demonstrado. Em seguida, normalize os sinais de luciferase dos transvectantes de células 293 T de acordo com os níveis de expressão do término final da luciferase Firefly e C terminus de mutantes da RAF. A quinase in vitro pode ser usada para sondar efetivamente a atividade catalítica de alguns mutantes da coluna vertebral, mas não a de mutantes mortos da quinase com uma espinha C fundida.A atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos com uma fraca afinidade ou estabilidade dimer, no entanto, pode não ser sondada usando este ASA como seus dimers são quebrados durante o processo de purificação. Para evitar a perda de atividade catalítica de mutantes da RAF com fraca afinidade ou estabilidade, esses mutantes podem ser fundidos com glutothionas transferase para resgatar a atividade catalítica dos mutantes. A CO-ativação DA RAF ASA pode ser usada para avaliar a atividade alusica dos mutantes da RAF mortos pela quinase.Como ilustrados mutantes mortos quinase com um motivo terminal final ácido e fusão da coluna C, funcionam como ativadores alósicos para desencadear a atividade catalítica de mutantes com um motivo terminal final ácido não fosfor, quando co expresso em células 293T. Além disso, uma luciferase dividida gratuita pode ser usada para medir a relativa afinidade ou estabilidade das quinases familiares da RAF e seus mutantes. O uso de um tampão de lysas com baixa concentração de detergente, e um procedimento rápido de lavagem suave durante a purificação da amostra é essencial para um SA de quinase in vitro bem sucedido. Essa técnica ajudará os pesquisadores a determinar precisamente como a doença retransmite os mutantes da RAF, ativar o caminho a jusante, facilitando a seleção de estratégias terapêuticas adequadas para o tratamento da doença.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Pesquisa do câncer

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET e MRI guiada irradiação de um modelo do rato de Glioblastoma usando um Microdifusora

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

Um guia prático para a produção e a imagem latente de PET/CT de 68Ga-DOTATATE para tumores neuroendócrinos na prática clínica diária

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Três métodos diferenciais de análise de expressão para sequenciamento de RNA: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...