Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить волосатые клетки лейкемии стипендий для поддержки Yuan Jimin. Эта работа была поддержана Азиатского фонда онкологических исследований (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Мост Финансирование премии (Дюк-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF преодоление гранта (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF пилотный грант (NCCRF-YR2017-PG- Исследовательский грант (AM/TP011/2018).

1. In Vitro Kinase Assay для измерения каталитическая активность мутантов RAF
<ol><li>Построить векторы, кодируя мутантов RAF(рисунок 1A) с тегом FLAG (DYKDDDDK) на C-terminus с помощью Gibson Assembly или традиционных методов молекулярного клонирования.
	<ol>
<li>Введите тег FLAG и мутации в последова?...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

В этой статье мы представили три метода для характеристики связанных с болезнями мутантов RAF, которые включают в пробирке киназы анализ, RAF совместной активации анализа, и бесплатный анализ раскола luciferase. Так как киназы RAF имеют как каталитическую активность, так и аллостерическую актив...

Семейные киназы RAF являются ключевым компонентом каскада сигнализации RAS/RAF/MEK/ERK, которые передают сигнал от РАН для активации митоген-активированного протеина киназы (MEK)1,2,3,4. Это семейство киназ играет решающую роль в росте клеток, выживании и дифференциации, и их изменения вызывают многие заболевания, в частности, рак5,6,7,8. В последнее время геномные секвенирования выявили много связанных с болезнью мутантов RAF, которые обладают различными свойствами в передаче сигнала RAS/RAF/MEK/ERK каскад9,10,11. Тщательная характеристика мутантов RAF поможет нам понять молекулярные механизмы того, как мутанты RAF изменяют сигнальный выход каскада RAS/RAF/MEK/ERK, в конечном итоге выбирая подходящие подходы для лечения различных мутантов, управляемых RAF.
Семьи киназы RAF включают в себя три члена, CRAF, BRAF, и ARAF, которые имеют аналогичные молекулярные структуры, но различные способности, чтобы активировать вниз по течению сигнализации1,2,3,4. Среди этих паралогов, BRAF имеет самую высокую активность в силу своей составно фосфорилированной NtA (N-тerminal cidic) мотив12,13 ,14, в то время как ARAF имеет самый низкий деятельность, вытекающая из его неканонического мотива APE15. Это может объяснить различные частоты мутаций паралогов RAF при заболеваниях: BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. Кроме того, в рамках одного и того же паралога RAF мутации на разных участках могут вызывать сигнализацию вниз по течению в различных манерах, что добавляет еще один уровень сложности к регулированию семейных киназ RAF. Недавние исследования показали, что все киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность13,14,16,17,18. В соответствии с действующими мутантами RAF включить вниз по течению сигнализацию непосредственно фосфорилирование МЭК, в то время как киназы мертвых мутантов RAF могут трансактивировать свои аналоги дикого типа через боковую-стороннюю димеризацию и активировать MEK-ERK сигнализации16 ,19,20. Димер сродство / стабильность является ключевым параметром, который не только определяет аллостерную активность киназы мертвых мутантов RAF, но и влияет на каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF15,21, 22. Киназа-мертвые мутанты RAF с высоким dimer сродством/стабильностью могут transactivate endogenous wild-type RAFs сразу15, пока те с промежуточными dimer сродством/стабильностью требует координации активного Ras или повышенный уровень молекул RAF дикого типа для функции13,15,20,21,23. Аналогичным образом, в совокупности активных raf мутантов фосфорилат MEK в димер-зависимым образом, и те, с низким димер омрачитель близость / стабильность теряют свою каталитическую активность в пробирке на иммунопрециптом, что перерывы слабых RAF dimers15, 21,22. Димер сродство / стабильность также определяет чувствительность raf мутантов к их ингибиторы, и положительно коррелирует с сопротивлением ингибиторов RAF24. Поэтому, чтобы охарактеризовать связанные с болезнями мутанты RAF, необходимо измерить их каталитическую и аллостерную деятельность, а также димерную сродство/стабильность.
В последние годы наша лаборатория и другие разработали различные методы для характеристики семейства киназов RAF и их мутантов. Согласно нашему опыту лаборатории и другим, мы считаем, что следующие три анализа имеют преимущества в определении связанных с болезнью мутантов RAF: (1) анализ in vitro киназы, который может быть проведен с легкостью для обнаружения каталитическая активность составно активные мутанты RAF15; (2) RAF совместноактивации ассс, который является надежным и удобным методом для измерения аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF13,15,21,22,23, 25; (3) бесплатный анализ разделенной люциферазы, который имеет гораздо более высокую чувствительность в измерении относительной сродства димера/стабильности мутантов RAF в отличие от традиционного совместного иммунопреципции, и способен осуществлять без передового оборудования в в отличие от количественных аналитических методов, таких как SPR (Surface Plasmon Resonance) анализ15,22. Сочетая эти три анализа, мы можем легко понять, как связанные с болезнью RAF мутант изменяет вниз по течению сигнализации и тем самым использовать соответствующую терапевтическую стратегию для лечения болезни, вызванной этой мутации RAF.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

Быстро ускоренная фиброзаркома (RAF) семейные киназы играют центральную роль в клеточной биологии и их дисфункция приводит к раку и нарушениям развития. Характеристика связанных с болезнями мутантов RAF поможет нам выбрать соответствующие терапевтические стратегии для лечения этих заболеваний. Недавние исследования показали, что семейные киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность, которая жестко регулируется димеризацией. Здесь мы построили набор практических и осуществимых методов для определения каталитической и аллостерической деятельности и относительной сродства/стабильности киназов семейства RAF и их мутантов. Во-первых, мы внесли изменения в классический анализ in vitro kinase, снизив концентрацию моющего средства в буферах, используя нежную процедуру быстрой стирки и используя фьюжн-передатчик (GST) для предотвращения разъединения RAF димеров во время Очистки. Это позволяет адекватно измерять каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF. Во-вторых, мы разработали новый RAF совместной активации анализ для оценки аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF с помощью N-терминала усеченных белков RAF, устраняя требование активного Раса в текущих протоколах и тем самым достигая более высокого Чувствительность. Наконец, мы создали уникальный дополнительный анализ разделенной люциферазы для количественного измерения относительной сродства/стабильности различных мутантов RAF, которая является более надежной и чувствительной по сравнению с традиционным анализом совместного иммунопреципиции. Таким образом, эти методы имеют следующие преимущества: (1) удобный для пользователя; (2) в состоянии эффективно осуществлять без современного оборудования; (3) рентабельно; (4) очень чувствительны и воспроизводимы.

Семьи киназы RAF имеют как каталитические, так и аллостерные виды деятельности, которые позволяют их связанных с болезнью мутантов, чтобы включить вниз по течению сигнализации через различные механизмы13,14,16,17 ,<s...

Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

В этой статье мы представили набор практических и осуществимых методов для характеристики связанных с болезнями мутантов семейных киназ RAF, которые включают в себя анализ in vitro киназы, анализ совместной активации RAF и дополнительный анализ сплит-люциферазы.

Характеризуй связанных с болезнями мутантов семейки RAF Kinases с помощью набора практических и осуществимых методов

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Этот метод облегчает эффективную характеристику заболеваний, связанных с методами киназы RAF. Этот метод является очень чувствительным и воспроизводимым, экономически эффективным, удобным для пользователя и не требует какого-либо современного оборудования. Для измерения каталитической активности мутантов RAF ввемит мутации технологий флага в последовательность кодирования RAF ПЦР, прежде чем вставлять целые последовательности в соответствующий вектор в соответствии со стандартными протоколами.Вставьте глутатион в качестве последовательности кодирования трансферазы вверх по течению последовательностей кодирования мутантов RAF, чтобы генерировать векторы, кодирующие глутатион, как трансферазы сплавленных мутантов RAF, таким же образом. Transvect 80%-90% слияние 293T клеточных культур с векторами кодирования флаг помечены RAF киназ или их мутантов, в соответствии со стандартами протоколов. После 24 часов культуры, заменить среду в каждой культуре.После 48 часов культуры добавьте 400 микролитров буфера лиза, дополненных ингибиторами протеазы и фосфатазы, к каждому колодец на льду. Через 5-10 минут перенесите лисаты клетки в 1,5 миллилитровую трубку для центрифугации для осаждения клеточного мусора. Перенесите 300 микролитров каждого образца в отдельные 1,5 миллилитровые микро центрифуги.Отложите 40 микролитров на образец для вниз по течению оптовой лизат ископаемых дополнительных сотовых сигнал регулируется киназы один и два выражения и активности аминокислот помарки анализа. Добавьте 20 микролитров анти-FLAG сродства шарики к каждой трубке, в течение одного часа инкубации с вращением в четыре градуса по Цельсию холодной комнате. В конце инкубации быстро и осторожно мыть анти флаг шарики один раз с лиза буфера в холодной комнате и один раз с буфером реакции киназы, прежде чем добавить 20 микролитров смеси реакции киназы.Граф-мутанты с низким сродством Димы могут потерять каталитической активности в пробирке из-за диссоциации Димы. Поэтому быстрая и нежная стирка имеет решающее значение. После 10 минут при комнатной температуре с листать каждую минуту, остановить реакции киназы с пятью микролитерами из пяти XSDS образца буфера, на образец и варить образцы при температуре 90 градусов по Цельсию в течение пяти минут.В конце инкубации, запустить образцы на 9 до 12%polyacrylamide электрофорез гель с 0,1% SDS, а затем передать белки в мембрану нитроцеллюлозы, чтобы позволить обнаружение уровней фосфомитогена активированных белковых киназы и RAF мутантов в каждом образце, путем иммуно blotting. Для оценки алостерической активности киназы мертвых мутантов RAF, построить векторы кодирования приемник RAF или киназы мертвых активаторов RAF. Transvect 293 Т-клеток с двумя векторами кодирования как приемник RAF и киназы мертвых RAF активатор, или один вектор кодирования одного из белков, как попродемонстрировано.Урожай всей клетки лисирует после 48 часов культуры, как попродемонстрировано, и быстро смешать чистую цельную клетку лисировать с пятью XSDS образца буфера при комнатной температуре, Перед кипячением лисаты в течение пяти минут при температуре 90 градусов по Цельсию. Затем запустите вареные образцы лизата всей клетки на 9 до 12%polyacrylamide электрофорез гель, который составляет 0,1% SDS и передачи белков в мембрану нитроцеллюлозы для обнаружения уровней фосфо дополнительный клеточный сигнал регулируется киназы один и два и контролировать белки иммунной blotting как попродемонстрировано. Для измерения относительного тусклого сродства и или стабильности RAF мутантов построить векторы кодирования флага технологий проекта мутантов сливается с конечной мизерной светлячков luciferase или C Terminus светлячок люциферазы.Transvect 293 Т-клеток с парой векторов кодирования различных и Terminus светлячков люциферазы RAF мутантов и C Terminus светлячок люцифераза RAF мутантов, как попродемонстрировано. Через 24 часа после трансвекции реляции два раза от 10 до пятого 293 Т-клеток сделок на колодец в кристально черные пластины изображения в цвете свободной среде. Через 48 часов после трансвестиона добавьте люциферин в 293 Т-клеточные трансвектенты и инкубировать в течение 30 минут.Перед измерением сигналов люциферазы на многофункциональной системе обнаружения. В конце измерения аспирируют супернатенты, и blice сделки 293 Т-клеток с лизас буфером, как попродемонстрировано. Вы запустите образцы лизата всей клетки на 9-12%полиакриламинидный электрофорезный гель с 0,1%SDS.Обнаружить уровни экспрессии конечной конечной части Светлячок luciferase RAF мутантов, или C конечной светлячок люциферазы RAF мутантов анти флаг аминокислоты пятно, как попродемонстрировано. Затем нормализуйте сигналы люциферазы 293 Т-клеток трансвектантов в соответствии с уровнем экспрессии конечного срока светлячков люциферазы и C конечной части Светлячок люциферазы RAF мутантов. In vitro киназы аса может быть использован для эффективного зондирования каталитической активности некоторых constitutively активных R-позвоночник мутантов, но не то, что из киназы мертвых мутантов с сплавленной C-позвоночника.Каталитическая активность constitutively активных мутантов RAF со слабым тусклым сродством или стабильностью, однако, не может быть исследована с помощью этого ASA, поскольку их димеры сломаны во время процесса очистки. Чтобы избежать потери каталитической активности мутантов RAF со слабым сродством или стабильностью, эти мутанты могут быть слиты с глутотионами трансферазы, чтобы спасти каталитической активности мутантов. Соактивная активация RAF ASA может быть использована для оценки алостерической активности киназы мертвых мутантов RAF.Как иллюстрирует киназы мертвых мутантов с кислым конце терминала мотив и C синтез позвоночника, функции как алостерические активаторы, чтобы вызвать каталитической активности мутантов с не фосфора relatable кислой конце терминальный мотив, когда совместно выражается в 293T клеток. Далее бесплатный раскол люцифераза SA может быть использован для измерения относительного тусклости или стабильности RAF семьи киназы и их мутантов. Использование буфера лиза с низкой концентрацией моющего средства, и быстрая процедура мягкой стирки во время очистки образца имеет важное значение для успешного in vitro киназы SA. Этот метод поможет исследователям точно определить, как болезнь реле RAF мутантов, активировать вниз по течению пути, облегчая выбор соответствующих терапевтических стратегий для лечения заболеваний.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Мышь Модель усталости, индуцированный Peripheral Облучение

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

ПЭТ и МРТ руководствуясь облучения глиобластома мышиной модели с помощью микро облучатель

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Методы для оценки роли c-Fos и Dusp1 в зависимости от онкогена

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Потенцирование эффективности противоопухолевой антитела, противоопухолевые препараты: обнаружение антител наркотиков синергизм с помощью комбинации индекс уравнения

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Обнаружение активности протеаз, флуоресцентный пептид Зимография

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

Практическое руководство для производства и ПЭТ/КТ из 68Ga-DOTATATE нейроэндокринных опухолей в повседневной клинической практике

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Три метода дифференциального экспрессионного анализа для секвенирования РНК: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...