Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Författarna skulle vilja erkänna Hairy cell leukemi Fellowship för stöd av Yuan Jimin. Detta arbete stöddes av Asien fonden cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge finansiering Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF överbryggande Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) och SHF akademisk medicin Forskningsbidrag (ÄNDR/TP011/2018).

1. in vitro-Kinasanalys för mätning av den katalytiska aktiviteten hos RAF mutanter
<ol><li>Konstruera vektorer kodning RAF mutanter (figur 1A) med flagga (DYKDDDDK) tag på C-terminus med hjälp av Gibson montering eller traditionella molekylära klonings metoder.
	<ol>
<li>Introducera flaggan taggen och mutationer i RAF kodning sekvenser av PCRs, och sedan infoga hela sekvenser i pCDNA 3,1 (+) vektor med hjälp av Gibson Assembly eller T4 DNA ligering och efter tillver...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

I denna artikel, presenterade vi tre metoder för att karakterisera sjukdomsrelaterade RAF mutanter, som inkluderar in vitro Kinas assay, RAF Co-Activation assay, och gratis Split luciferas assay. Eftersom RAF-kinaser har både katalytisk aktivitet och allosterisk aktivitet kan olika RAF-mutanter aktivera nedströms signalering genom två distinkta mekanismer13,14,16,17, <sup class="...

RAF-familjen kinaser är en viktig del av ras/RAF/MEK/erk-signalkaskaden, som sänder en signal från ras för aktivering av mitogenaktiverat proteinkinas (MEK)1,2,3,4. Denna familj av kinaser spelar en avgörande roll i celltillväxt, överlevnad och differentiering, och deras förändringar inducerar många sjukdomar, särskilt cancer5,6,7,8. Nyligen har genomiska sequencings identifierat många sjukdomsrelaterade RAF mutanter som uppvisar olika egenskaper i signalöverföringen av ras/RAF/MEK/erk Cascade9,10,11. En noggrann karakterisering av RAF mutanter kommer att hjälpa oss att förstå de molekylära mekanismerna för hur RAF mutanter förändrar signalen från RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, så småningom välja lämpliga metoder för behandling av olika RAF Mutant-drivna sjukdomar.
RAF familjen kinaser omfatta tre medlemmar, craf, BRAF, och ARAF, som har liknande molekylära strukturer men olika förmågor för att aktivera nedströms signalering1,2,3,4. Bland dessa paralogs har BRAF den högsta aktiviteten på grund av dess konstitutivt fosforylerade nta (N-terminal acidic) motiv12,13,14, medan ARAF har lägst verksamhet som härrör från dess icke-kanoniska apa motiv15. Detta kan förklara de olika Mutations frekvenserna för RAF-paralogs vid sjukdomar: BRAF > CRAF > ARAF. Dessutom, inom samma RAF paralog, mutationer i olika platser kan utlösa nedströms signalering i distinkta sätt, vilket tillför ytterligare ett lager av komplexitet till regleringen av RAF familjen kinaser. Nyligen genomförda studier har visat att alla RAF-kinaser har både katalytisk och allosterisk verksamhet13,14,16,17,18. Konstitutivt aktiva RAF mutanter slå på nedströms signalering direkt av fosforylerande MEK, medan Kinas-döda RAF mutanter kan transaktivera sina Wild-Type motsvarigheter genom sida till sida Dimerization och aktivera MEK-ERK signalering16 ,19,20. Dimeraffinitet/stabilitet är en nyckelparameter som inte bara avgör den Allosteriska aktiviteten hos Kinase-döda RAF-mutanter utan även påverkar den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF-mutanter15,21, 22. den Kinas-döda RAF mutanter med hög dimer samhörighet/stabilitet kan transaktivera endogena vildtyp rafs direkt15, medan de med mellanliggande dimer samhörighet/stabilitet kräver en samordning av aktiva ras eller en förhöjda nivåer av vildtyp RAF-molekyler för att fungera13,15,20,21,23. Likaså, konstitutivt aktiva RAF mutanter fosforylera MEK på ett dimer-beroende sätt, och de med låg dimer affinitet/stabilitet förlorar sin katalytisk aktivitet in vitro-på immunoprecipitation som bryter de svaga RAF dimerer15, 21,22. Den dimer affiniteten/stabiliteten avgör också känsligheten av RAF mutanter till deras inhibitorer, och positivt korrelerar till motståndet av RAF-hämmare24. Därför, för att karakterisera sjukdomsrelaterade RAF mutanter, är det nödvändigt att mäta deras katalytisk och allosterisk verksamhet, och dimer samhörighet/stabilitet.
Under de senaste åren har vårt laboratorium och andra utvecklat olika metoder för att karakterisera RAF-familjekinaser och deras mutanter. Enligt vårt laboratorium och andras erfarenhet, tror vi att följande tre analyser har fördelar med att definiera sjukdomsrelaterade RAF mutanter: (1) in vitro-Kinas analys som kan utföras med lätthet att upptäcka den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter15; (2) Co-aktiveringsanalysen för RAF som är en tillförlitlig och bekväm metod för att mäta den Allosteriska aktiviteten hos Kinase-döda RAF-mutanter13,15,21,22,23, 25. (3) den kostnadsfria Split luciferas-analysen som har mycket högre känslighet vid mätning av den relativa dimeraffiniteten/stabiliteten hos RAF-mutanter i motsats till den traditionella Co-immunoprecipitation-analysen, och som kan utföra utan avancerad utrustning i kvantitativa analytiska metoder såsom spr (surface Plasmon Resonance) analys15,22. Kombinera dessa tre analyser, kan vi förstå lätt hur en sjukdomsrelaterad RAF Mutant förändrar nedströms signalering och därmed utnyttja en lämplig terapeutisk strategi för att behandla den sjukdom som orsakas av denna RAF-mutation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

Den snabbt accelererade fibrosarkom (RAF) familjen kinaser spelar en central roll i cellbiologi och deras dysfunktion leder till cancer och utvecklingsstörningar. En karakterisering av sjukdomsrelaterade RAF mutanter kommer att hjälpa oss att välja lämpliga terapeutiska strategier för att behandla dessa sjukdomar. Nyligen genomförda studier har visat att RAF familjen kinaser har både katalytiska och Allosteriska aktiviteter, som är tätt reglerade av Dimerization. Här har vi konstruerat en uppsättning av praktiska och genomförbara metoder för att bestämma den katalytiska och Allosteriska verksamheten och den relativa dimeraffinitet/stabiliteten hos RAF-familjekinaser och deras mutanter. För det första har vi ändrat den klassiska in vitro-kinasanalysen genom att minska tvättmedels koncentrationen i buffertar, använda en mild snabb tvätt förfarande och anställa en glutation S-transferas (GST) Fusion för att förhindra att RAF dimerer dissocierar under Rening. Detta gör det möjligt för oss att mäta den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter på lämpligt sätt. För det andra utvecklade vi en roman RAF Co-Activation assay för att utvärdera Alloster aktivitet av Kinas-döda RAF mutanter genom att använda N-Terminal stympade RAF proteiner, vilket eliminerar kravet på aktiva ras i nuvarande protokoll och därmed uppnå en högre Känslighet. Slutligen genererade vi en unik kompletterande Split luciferas assay att kvantitativt mäta den relativa dimer samhörighet/stabilitet olika RAF mutanter, som är mer tillförlitlig och känslig jämfört med den traditionella Co-immunoprecipitation analysen. Sammanfattnings, dessa metoder har följande fördelar: (1) användarvänlig; 2. kunna utföra effektivt utan avancerad utrustning, (3) kostnadseffektivt. (4) mycket känsliga och reproducerbara.

RAF-familjen kinaser har både katalytisk och allosterisk verksamhet, vilket gör det möjligt för deras sjukdomsrelaterade mutanter att slå på nedströms signalering genom olika mekanismer13,14,16,17 ,18. Den konstitutivt aktiva RAF mutanter direkt fosforylera sina substrat, medan Kinas-döda RAF mutanter uppfylla sin funktion genom transaktiverande Wild-...

Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

I den här artikeln presenterade vi en uppsättning praktiska och genomförbara metoder för att karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-familjekinaser, som inkluderar in vitro-Kinas-analys, RAF-Co-Activation-analys och kompletterande Split luciferas-analys.

Karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-Familjekinaser genom att använda en uppsättning praktiska och genomförbara metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Denna metod underlättar effektiv karakterisering av sjukdomsrelaterade RAF-kinasmetoder. Denna teknik är mycket känslig och reproducerbara, kostnadseffektiva, användarvänliga, och kräver inte någon avancerad utrustning. För att mäta den katalytiska aktiviteten hos RAF-mutanter, införa flagga tech mutationer i RAF kodning sekvens av PCR, innan du sätter in hela sekvenser i lämplig vektor enligt standardprotokoll.Sätt in glutationen som överföringskodningssekvens uppströms RAF-mutantkodningssekvenserna, för att generera vektorer som kodar glutation som överförassmälta RAF-mutanter, på samma sätt. Transvect 80%till 90%confluent 293T cellkulturer med vektorerna kodning flaggan taggade RAF kinaser eller deras mutanter, enligt standarder protokoll. Efter 24 timmars kultur, ersätta mediet i varje kultur.Efter 48 timmars kultur, tillsätt 400 mikroliter av lysbuffert kompletterat med proteas och fosfatashämmare, till varje brunn på is. Efter fem till 10 minuter överföra cellen lysates till en 1,5 milliliter rör för centrifugeringen till sediment cellen skräp. Överför 300 mikroliter av varje prov till individuella 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Avsätt 40 mikroliter per prov för nedströms grossist lysate fossil extra cellulär signal reglerad kinas en och två uttryck och aktivitet amino blot analys. Lägg till 20 mikroliter av anti-FLAG affinitet pärlor till varje rör, för en timmes inkubation med rotation i en fyra grader Celsius kylrum. I slutet av inkubationen snabbt och försiktigt tvätta anti flaggan pärlor en gång med lys buffert i kylrummet och en gång med kinas reaktion buffert innan du lägger 20 mikroliter av Kinas reaktion blandning.Graf mutanter med en låg Dima affinitet kan förlora sin katalytiska aktivitet in vitro på grund av Dima dissociation. Därför är den snabba och skonsamma tvätten kritisk. Efter 10 minuter i rumstemperatur med vändning varannan minut, stoppa kinasreaktionerna med fem mikroliter av fem XSDS provbuffert, per prov och koka proverna vid 90 grader Celsius i fem minuter.I slutet av inkubationen, kör proverna på en nio till 12%polyakrylamidelektroforesgel med 0,1%SDS, överför sedan proteinerna till ett nitrocellulosamembran för att möjliggöra detektering av nivåerna av fosfomidogen-aktiverade proteinkinas och RAF-mutanter i varje prov, genom immunsmock. För att utvärdera den allosteriska aktiviteten hos kinas döda RAF-mutanter, konstruerar vektorer som kodar för RAF-mottagaren eller kinasdöda RAF-aktivatorer. Transvect 293 T-celler med två vektorer som kodar både RAF-mottagaren och kinasdöda RAF-aktivator, eller en enda vektorkodning av ett av proteinerna som visats.Skörda hela cellen lysates efter 48 timmars kultur som visats, och blanda snabbt den rena hela cellen lysate med fem XSDS provbuffert vid rumstemperatur, Innan kokning av lysates i fem minuter vid 90 grader Celsius. Kör sedan de kokta hela cellen lysate prover på en nio till 12%polyakrylamid elektrofores gel som är 0,1%SDS och överföra proteiner till en nitrocellulosa membran för att upptäcka nivåerna av fosfo extra cellulära signal regleras kinas ett och två och kontrollera proteiner genom immun blotting som visat. För att mäta den relativa dimer affinitet och eller stabilitet av RAF mutanter konstruera vektorer kodning flagga tech utkast mutanter smält till ändstationen av Firefly luciferase eller C Terminus en firefly luciferase.Transvect 293 T celler med ett par vektorer kodning olika och Terminus av firefly luciferase RAF mutanter och C Terminus en firefly luciferase RAF mutanter som visas. 24 timmar efter transvection replate två gånger 10 till den femte 293 T cell transaktioner per brunn in kristall svart bild plattor i färg fria medium. 48 timmar efter transvestionen tillsätt luciferin till 293 T-celltransvectenter och inkubera i 30 minuter.Innan du mäter luciferassignalerna på ett multidetekteringssystem. Vid slutet av mätningen aspirera supernatents, och blice de 293 T-celler med lysas buffert som visats. Kör hela cellen lysate prover på en nio till 12%polyakrylamidelektroforesgel med 0,1%SDS.Upptäcka uttrycksnivåerna för end terminus av Firefly luciferase RAF mutanter, eller C ändstation av Firefly luciferase RAF mutanter av anti flagg amino blot som visats. Sedan normalisera luciferassignalerna av de 293 T-celltransvektants enligt uttrycksnivåerna för end terminus av Firefly luciferase och C ändstation av Firefly luciferase RAF mutanter. In vitro-kinase asa kan användas för att effektivt sondera den katalytiska aktiviteten hos vissa kontitivt aktiva R-spine mutanter, men inte den hos kinas döda mutanter med en smält C-ryggrad.Den katalytiska aktiviteten hos kontituivt aktiva RAF-mutanter med en svag dimer affinitet eller stabilitet kanske dock inte undersöks genom att använda denna ASA eftersom deras dimers bryts under reningsprocessen. För att undvika förlust av katalytisk aktivitet av RAF mutanter med svag dimer affinitet eller stabilitet, kan dessa mutanter vara smält med glutothionas transferas att rädda den katalytiska aktiviteten av mutanterna. RAF co-aktivering ASA kan användas för att utvärdera allosteric aktivitet kinas döda RAF Mutants.Som illustrerade kinas döda mutanter med en sur slutet terminal motiv och C ryggrad fusion, fungera som allosteric aktivatorer att utlösa katalytiska verksamhet mutanter med en icke fosfor relatable sura slutet terminal motiv, när co uttryckt i 293T celler. Vidare en gratis split luciferase SA kan användas för att mäta den relativa dimer affinitet eller stabilitet RAF familj kinaser och deras mutanter. Med hjälp av en lysas buffert med en låg koncentration av rengöringsmedel, och en snabb mild tvätt förfarande under provet rening är avgörande för en framgångsrik in vitro-kinas SA. Denna teknik kommer att hjälpa forskare att avgöra exakt hur sjukdomen relä RAF mutanter, aktivera nedströms vägen, underlätta valet av lämpliga terapeutiska strategier för sjukdomsbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musmodell av trötthet inducerad av perifera bestrålning

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Praktiska överväganden studera metastaserande lungcancer kolonisationen i osteosarkom med pulmonell metastas-analys

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET och MRI guidad bestrålning av en Glioblastoma råtta modell med en mikro-irradiator

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Metoder för att utvärdera rollen av c-Fos och Dusp1 i onkogen beroende

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisande av proteas aktivitet av fluorescerande peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

En praktisk Guide för produktion och PET/CT-avbildning av 68Ga-DOTATATE för Neuroendokrina tumörer i daglig klinisk praxis

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Övervakning av eIF4F-sammansättning genom mätning av eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Använda datorbaserad bildanalys för att förbättra kvantifiering av lung metastasering i 4T1 Bröstcancermodellen

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre differentialuttrycksanalysmetoder för RNA-sekvensering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...