Name: characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Yazarlar Yuan Jimin desteği için Tüylü hücre lösemi Bursu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Asya Fonu kanser Araştırması (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS KBrFA/2018/0014), NCCRF köprüleme hibe (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot hibe (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) ve SHF akademik tıp tarafından desteklenmektedir Araştırma hibe (AM/TP011/2018).

1. RAF mutantların katalitik etkinliğini ölçmek için In vitro kinaz assay
<ol><li>, Gibson Assembly ya da geleneksel moleküler klonlama yöntemleri kullanarak C-Terminus Flag (dykddddk) etiketi ile raf mutantlar (Şekil 1A) kodlama vektörler oluşturun.
	<ol>
<li>Flag etiketini ve mutasyonlar raf kodlama dizileri PCRs tarafından tanıtmak ve sonra tüm dizileri pcdna 3.1 (+) vector Gibson derleme veya T4 DNA ligasyonu kullanarak ve üretim protokolleri aşağıdaki...

<ol>
	<li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family.">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li><li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAF+proteins+take+center+stage.">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li><li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+nature:+biological+functions+of+the+Raf-1+"kinase".">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li><li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling.">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li><li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raf+kinases:+oncogenesis+and+drug+discovery.">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li><li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer.">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li><li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Raf/MEK/ERK+pathway+in+cell+growth,+malignant+transformation+and+drug+resistance.">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li><li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer.">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li><li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guilty+as+charged:+B-RAF+is+a+human+oncogene.">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li><li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1,+but+not+B-Raf+activation.">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers.">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li><li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alike+but+different:+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs.">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants.">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li><li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF.">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li><li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinases+and+pseudokinases:+lessons+from+RAF.">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li><li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudokinases+from+a+structural+perspective.">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li><li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefran&#231;ois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation.">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li><li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF.">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis.">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF.">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer.">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li><li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF(V600E).">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras,+CRAF+and+BRAF.">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li><li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases:+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins.">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li><li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism.">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li><li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf.">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF.">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+relationships:+the+regulation+of+the+Ras/RAF/MEK/ERK+pathway+by+protein+interactions.">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).</li><li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="RAF"+neighborhood:+protein-protein+interaction+in+the+Raf/Mek/Erk+pathway.">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions:+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway.">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li><li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+regulated+protein&#8211;protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals.">Kinetics of regulated protein&#8211;protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120.">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li><li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF,+EGFR,+and+HER2.">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li></ol>

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil dahil hastalık ile ilgili raf mutantlar, karakterize etmek için üç yöntem sundu. Raf kinazları hem katalitik aktivite ve allosterik aktivite olduğundan, çeşitli raf mutantlar iki farklı mekanizmalar aracılığıyla akış sinyalizasyon aktive edebilir13,14,16,17, <sup...

Raf aile kinazları RAS/raf/mek/erk sinyalizasyon Cascade, Mitojen aktif protein kinaz (mek)1,2,3,4etkinleştirmek için RAS bir sinyal iletme önemli bir bileşenidir. Bu kinazlar ailesi hücre büyüme, hayatta kalma ve farklılaşma önemli bir rol oynar, ve onların değişiklikler birçok hastalık neden, özellikle kanser5,6,7,8. Son zamanlarda, genomik sequencings RAS/raf/mek/erk Cascade9,10,11sinyal iletimi farklı özellikleri sergiler birçok hastalık ile ilgili raf mutantlar belirledi. RAF mutantların dikkatli bir karakterizasyonu bize RAF mutantların RAS/RAF/MEK/ERK Cascade sinyal çıkışını değiştirmek nasıl moleküler mekanizmaları anlamak yardımcı olacaktır, sonunda çeşitli RAF mutant odaklı hastalıklar tedavisinde uygun yaklaşımlar seçin.
RAF aile kinazlar üç üye içerir, CraF, BRAF, ve Araf, benzer moleküler yapıları ama farklı yetenekleri olan1,2,3,4sinyalizasyon akış etkinleştirmek için. Bu paraloglar arasında, BRAF onun kurucu fosforile NTA (N-tTerminal acidic) Motif tarafından en yüksek aktivite vardır12,13,14, Araf en düşük sahip iken , standart olmayan APE motif15' den kaynaklanan aktivite. Bu hastalıklarda RAF paralogları farklı mutasyon frekansları açıklayabilir: BRAF > CRAF > ARAF. Dahası, aynı RAF paralog içinde, farklı sitelerde mutasyonlar, RAF ailesinin kinazlarının düzenlenmesi için karmaşıklık başka bir katman ekler ayrı görgü, akış sinyalizasyon tetikleyebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar tüm raf kinlerinin katalitik ve allosterik faaliyetlere sahip olduğunu göstermiştir13, 14,16,17,18. Yapıcı aktif RAF mutantları, doğrudan fosforlama MEK tarafından geri akış sinyallerini açmak, kinaz ölü RAF mutantlar yan yana dimerization aracılığıyla vahşi tip meslektaşları transactivate ve Me-ERK sinyalizasyon aktive edebilirsiniz16 ,19,20. Dimer yakınlık/kararlılık sadece kinaz ölü raf mutantların allosterik etkinliğini belirler değil, aynı zamanda kurucu aktif raf mutantların katalitik etkinliğini etkileyen bir anahtar parametresidir15,21, 22. kinaz-ölü raf mutantlar yüksek dimer benzeşimi/stabilitesi ile doğrudan endojen vahşi tip RAFs transactivate olabilir15, ara dimer yakınlık ile olanlar/istikrar aktif RAS veya bir koordinasyon gerektirir 13,15,20,21,23işlevi için vahşi tip raf moleküllerinin yüksek düzeyde. Benzer şekilde, bir dimer bağımlı şekilde kurucu aktif raf mutantlar fosforylate mek, ve düşük dimer yakınlık/stabilitesi olan zayıf raf dimerleri tatili immünoprecipitation üzerine kendi katalitik etkinliğini kaybetmek15, 21,22. Dimer benzeşimi/kararlılık da kendi inhibitörleri için RAF mutantların duyarlılığı belirler ve pozitif RAF inhibitörleri direnci ile ilişkilidir24. Bu nedenle, hastalıkla ilgili RAF mutantlarını karakterize etmek için Katalitik ve allosterik aktivitelerini ve dimer yakınlık/stabilitesini ölçmek gerekir.
Son yıllarda, laboratuar ve diğerleri RAF aile kinazlar ve mutantları karakterize etmek için çeşitli yöntemler geliştirdik. Laboratuvarımıza ve başkalarının deneyimlerine göre, aşağıdaki üç testin hastalık ile ilgili RAF mutantları tanımlamada avantajları olduğunu düşünüyoruz: (1) kurucu katalitik etkinliğini algılamak için kolaylığı ile gerçekleştirilebilir in vitro kinaz tahlil aktif RAF mutantlar15; (2) kinaz-ölü raf mutantların allosterik etkinliğini ölçmek için güvenilir ve uygun bir yöntemdir raf Co-aktivasyon assay13,15,21,22,23, 25; (3) geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil karşıt olarak raf mutantların bağıl dimer benzeşimi/istikrar ölçümünde çok daha yüksek hassasiyete sahip ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil, ve gelişmiş ekipman olmadan yürütmek mümkün SPR (SUrface Plasmon Resonance) analizi15,22gibi nicel analitik yöntemlerle kontrast. Bu üç asder birleştiren, biz kolayca nasıl bir hastalık ile ilgili RAF mutant akış sinyalizasyon değiştirir ve böylece bu RAF mutasyonu nedeniyle hastalığı tedavi etmek için uygun bir terapötik strateji yararlanmak anlayabiliriz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:660px;" width="660">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">4370</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-phosphoMEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-ERK1/2</td>
			<td style="width:197px;">AB clonal</td>
			<td style="width:104px;">A0229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-MEK1/2</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">9124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(mouse)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-HA</td>
			<td style="width:197px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:104px;">MAB6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG(Rabbit)</td>
			<td style="width:197px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:104px;">14793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-&#946;-actin</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A2228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">anti-FLAG beads(M2)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A4596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HRP-conjugated anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:197px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:104px;">111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">pcDNA3.1(+)</td>
			<td style="width:197px;">In vitrogen</td>
			<td style="width:104px;">V79020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Gibson Assembly Cloning&#160; Kit</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">E5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:197px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Fugene 6</td>
			<td style="width:197px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">11 814 443 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DMEM w/o phenol red</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-luciferin&#160;</td>
			<td style="width:197px;">GoldBio</td>
			<td style="width:104px;">LUCK-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td>
			<td style="width:197px;">&#160;prepared in our previous studies</td>
			<td style="width:104px;">N.A.</td>
			<td>Reference 15.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GloMax-Multi Detection System.</td>
			<td style="width:197px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">E7041</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterize disease-related mutants of raf family kinases by using a set of practical and feasible methods

Hızla hızlandırılmış Fibrosarkom (RAF) aile kinazları hücre biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır ve bunların fonksiyon bozukluğu kanserler ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Hastalık ile ilgili RAF mutantlarının bir karakterizasyonu, bu hastalıkların tedavisinde uygun terapötik stratejileri seçmemize yardımcı olacaktır. Son çalışmalar RAF aile kinazların hem katalizör ve allosterik faaliyetler, sıkı dimerization tarafından düzenlenmiş olduğunu göstermiştir. Burada, katalitik ve allosterik faaliyetleri ve RAF ailesinin kinazlarının ve mutantların bağıl dimer yakınlık/stabilitesi belirlemek için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi inşa ettik. Öncelikle, biz tampon deterjan konsantrasyonu azaltarak klasik in vitro kinaz tahlil değiştirildi, nazik bir hızlı yıkama prosedürü kullanarak, ve bir glutatyon S-transferase (GST) füzyon sırasında bunalımları raf dimerleri önlemek için istihdam Arıtma. Bu da bize, kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesini uygun şekilde ölçmemizi sağlar. İkincisi, biz bir roman raf Co-aktivasyon assay N-terminal kesilmiş raf proteinleri kullanarak kinaz-ölü raf mutantlar allosterik etkinliğini değerlendirmek için geliştirilen, geçerli protokollerde aktif RAS gereksinimini ortadan kaldırarak ve böylece daha yüksek bir elde Duyarlılık. Son olarak, biz kantitatif bağıl dimer yakınlık ölçmek için benzersiz bir tamamlayıcı bölünmüş Lusiferaz tahlil oluşturulan/çeşitli raf mutantların istikrar, hangi daha güvenilir ve duyarlı geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil kıyasla. Özetle, bu yöntemlerin aşağıdaki avantajları vardır: (1) Kullanıcı dostu; (2) gelişmiş ekipman olmadan etkili bir şekilde yürütmek mümkün; (3) maliyet-etkili; (4) son derece hassas ve yeniden oluşturulabilir.

RAF ailesinin kinazları hem katalizör hem de allosterik faaliyetlere sahiptir, bu da hastalıkla ilgili mutantların farklı mekanizmalar üzerinden akış sinyallerini açmasını sağlar13,14,16,17 ,18. Kurucu aktif RAF mutantları doğrudan fosforylate onların substratlar, kinaz-ölü RAF mutantlar vahşi tip meslektaşları transaktive yoluyla işlevle...

Watch this Scientific Journal Video about Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods at JoVE.com

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Bu yöntem, hastalığa bağlı RAF kinaaz yöntemlerinin etkili karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu teknik son derece hassas ve tekrarlanabilir, uygun maliyetli, kullanıcı dostu ve herhangi bir gelişmiş ekipman gerektirmez. RAF mutantlarının katalitik aktivitesini ölçmek için, standart protokollere göre uygun vektöre tüm dizileri eklemeden önce PCR tarafından RAF kodlama dizisine bayrak teknolojisi mutasyonları getirin.Raf mutant kodlama dizilerinin transferaz kodlama dizisi olarak glutatyon ekleyin, transferaz erimiş RAF mutantlar olarak glutatyon kodlama vektörler oluşturmak için, aynı şekilde. Standart protokollerine göre RAF kinazlarını veya mutantlarını etiketledibayrağı kodlayan vektörlerle %80 ila %90'lık confluent 293T hücre kültürlerini transvect. Kültür 24 saat sonra, her kültürde orta değiştirin.Kültür 48 saat sonra, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenen lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin, buz her kuyuya. 5-10 dakika sonra hücre enkaz ını tortulamak için santrifüj için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Her numunenin 300 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.Aşağı doğru toptan fosil ekstra hücresel sinyal düzenlenmiş kizaz bir ve iki ekspresyon ve aktivite amino leke analizi için örnek başına 40 mikrolitre ayırın. Her tüpe 20 mikrolitre anti-FLAG afinite boncuk ekleyin, dört derece santigrat soğuk odada rotasyon ile bir saatlik kuluçka için. Kuluçka sonunda hızlı ve yavaşça soğuk odada lysis tampon ve kizaz reaksiyon uğrama tampon ile bir kez kisaz reaksiyon karışımı 20 mikrolitre eklemeden önce anti bayrak boncuklar bir kez yıkayın.Düşük Dima afinitesi olan Grafik Mutantlar Dima dissociation nedeniyle in vitro katalitik aktivite kaybedebilir. Bu nedenle, hızlı ve nazik yıkama önemlidir. Her dakika çevirme ile oda sıcaklığında 10 dakika sonra, örnek başına beş mikrolitre beş XSDS örnek tampon ile kizaz reaksiyonları durdurmak ve beş dakika boyunca 90 derece santigrat derecede örnekleri kaynatın.Kuluçka sonunda, %0.1 SDS ile %9-12 poliakrilamid elektroforez jeli üzerinde numuneleri çalıştırın, sonra proteinleri nitroselüloz membrana aktararak her numunedeki fosfo mitojen-aktive protein kiazaz ve RAF mutantlarının seviyelerinin immün blotting ile algılanmasını sağlar. Kiaz ölü RAF mutantların Allosteric aktivitesini değerlendirmek için, RAF alıcı veya kiaz ölü RAF aktivatörleri kodlama vektörler inşa. Transvect 293 T hücreleri iki vektör ile hem RAF alıcı ve kinaz ölü RAF aktivatör, ya da tek bir vektör gösterildiği gibi proteinlerin birini kodlama kodlama kodlama.Gösterildiği gibi 48 saatlik kültürden sonra tüm hücreli sıvıları hasat edin ve temiz hücre lisatını oda sıcaklığında beş XSDS numune tamponuyla hızlı bir şekilde karıştırın, lysates'i 90 derecede beş dakika kaynatmadan önce. Daha sonra haşlanmış tüm hücre lizat örneklerini %0,1 SDS olan 9-12% poliakrilamid elektroforez jeli üzerinde çalıştırın ve proteinleri nitroselüloz membrana aktarın. Göreceli dimer yakınlık ve RAF mutantların istikrarı ölçmek için firefly luciferase veya C Terminus bir ateş böceği luciferase terminus erimiş bayrak teknoloji taslak mutantlar kodlama vektörler inşa.Transvect 293 T hücreleri vektörleri farklı ve Terminus firefly luciferase RAF mutantlar ve C Terminus bir firefly luciferase RAF mutantlar kodlayan bir çift gösterildiği gibi. Transveksiyon replate iki kez 10 sonra 24 saat 5 293 T hücre işlemleri iyi başına renk siz ortamda kristal siyah görüntü plakaları içine. Transvesyondan 48 saat sonra luciferini 293 T hücre travestilerine ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.Çok algılama sistemindeluciferase sinyalleri ölçmeden önce. Ölçüm sonunda supernatents aspirate ve blice 293 T hücreleri lysas tampon ile gösterildiği gibi. Tüm hücre lizat örnekleri% 0.1 SDS ile 9-12% poliakrilamid elektroforez jel üzerinde çalıştırın.Firefly luciferase RAF mutantların son terminus ifade düzeylerini algıla, ya da firefly luciferase RAF mutantların C terminus anti bayrak amino leke tarafından gösterildiği gibi. Daha sonra Firefly luciferase ve Firefly luciferase RAF mutantların C terminus son terminus ifade düzeylerine göre 293 T hücre transvectants luciferase sinyalleri normalleştirmek. In vitro kinasa asa etkili bazı kurucu olarak aktif R-omurga mutantların katalitik aktivitesini araştırmak için kullanılabilir, ama bir erimiş C-omurga ile kimyaz ölü mutantlar değil.Ancak zayıf bir dimer yakınlık veya istikrar ile kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesi, onların dimers arıtma işlemi sırasında kırık olarak bu ASA kullanılarak probed olmayabilir. Zayıf dimer yakınlık veya istikrar ile RAF mutantların katalitik aktivite kaybını önlemek için, bu mutantlar mutantların katalitik aktivitesikurtarmak için glutothionas transferaz ile erimiş olabilir. RAF co-aktivasyon ASA kinaz ölü RAF Mutantlar allosteric aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.Asidik son terminal motifi ve C omurga füzyonu ile resimli kinaaz ölü mutantlar gibi, allosteric aktivatörler olarak non fosfor göreceli asidik uç terminal motifi ile mutantların katalitik aktivitesini tetiklemek için işlev, co 293T hücreleri ifade zaman. Ayrıca ücretsiz bir bölünmüş luciferase SA göreceli dimer yakınlık veya RAF aile kinazları ve mutantların istikrarı ölçmek için kullanılabilir. Düşük oranda deterjan içeren lysas tamponu kullanmak ve numune saflaştırması sırasında hızlı bir yıkama işlemi, başarılı bir in vitro kinaaz SA için gereklidir. Bu teknik araştırmacılar ın, hastalığın RAF mutantlarını nasıl ileteceğini tam olarak belirlemelerine, aşağı akım yolunu etkinleştirmelerine ve hastalık tedavisi için uygun tedavi stratejilerinin seçilmesini kolaylaştırmalarına yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

Bir mikro-irradiator kullanarak Glioblastoma fare modeli ışınlama güdümlü evde beslenen hayvan ve MRI

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

A Practical Guide for the Production and PET/CT Imaging of 68Ga-DOTATATE for Neuroendocrine Tumors in Daily Clinical Practice

Üretim ve 68Ga-DOTATATE PET/BT görüntüleme için günlük klinik pratikte nöroendokrin tümör için pratik bir rehber

Neuroendocrine tumors are a rare form of cancer that arise from neuroendocrine cells and can be present at almost any location throughout the body. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

4T1 Meme Kanseri Modelinde Akciğer Metastazının Nicelleştirilmesini Geliştirmek Için Bilgisayar Tabanlı Görüntü Analizinin Kullanılması

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA Dizilimi için Üç Diferansiyel İfade Analizi Yöntemi: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...