Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

نشكر مرفق الحيوانات CSIR-IICB. G. D. شكرا ICMR، J. K. و V. G. أشكر DST إلهام، وD. M. شكرا DBT، الهند على زمالاتهم. س. غ. تتكرم بـ "الصرب" (EMR/2015/002230) الهند لتقديمها الدعم المالي.

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لأخلاقيات الحيوان التابعة للمعهد الهندي للبيولوجيا الكيميائية على جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بالحيوان (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1- الكاشف وإعداد وسائل الإعلام
<ol><li>بولي-د-يسين (PDL) الحل: إعداد حلول PDL بتركيزات 0.1 ملغ / مل في الماء منزوع الأيونات وتخز?...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول كيف يتم الحصول على اثنين من المنصات العصبية المتغيرة عن طريق تغيير كثافات طلاء الخلايا من الخلايا العصبية الأولية. على الرغم من أن هذا هو أسلوب بسيط، يجب تنفيذ كل خطوة بدقة لتحقيق النتائج المرجوة. وقد أبلغت طرق سابقة أخرى إما على المدى الطويل الثقافات العصبية الأولية أو...

الدماغ هو دوائر معقدة من الخلايا العصبية وغير العصبية. لسنوات، يحاول العلماء الحصول على نظرة ثاقبة في هذه الآلية المعقدة. وللقيام بذلك، لجأ علماء الأعصاب في البداية إلى مختلف خطوط الخلايا القائمة على الأعصاب المحولة لإجراء التحقيقات. ومع ذلك، فإن عدم قدرة هذه الخطوط الخلية clonal لتشكيل اتصالات متشابكة قوية والمحاور المناسبة أو dendrites قد تحولت الاهتمام العلمي إلى الثقافات العصبية الأولية1،2. الجانب الأكثر إثارة من ثقافة الخلايا العصبية الأولية هو أنه يخلق فرصة لمراقبة والتلاعب الخلايا العصبية الحية3. وعلاوة على ذلك، فإنه أقل تعقيدا بالمقارنة مع الأنسجة العصبية، مما يجعلها مرشحا مثاليا لدراسة وظيفة ونقل البروتينات العصبية المختلفة. في الآونة الأخيرة، ولدت العديد من التطورات في مجالات الفحص المجهري، وعلم الجينوم، والبروتيوميات فرصا جديدة لعلماء الأعصاب لاستغلال الثقافات العصبية4.
وقد سمحت الثقافات الأولية لعلماء الأعصاب باستكشاف الآليات الجزيئية وراء التطور العصبي، وتحليل مختلف مسارات الإشارات العصبية، وتطوير فهم أكثر تماسكا لنقاط الاشتباك العصبي. على الرغم من أن عددا من الأساليب قد ذكرت الثقافات من الخلايا العصبية الأولية (معظمها من أصل فرس النهر5و6و7)،بروتوكول موحد مع وسيلة محددة كيميائيا التي تمكن ثقافة طويلة الأجل من الخلايا العصبية هو لا تزال هناك حاجة. ومع ذلك، لوحظت الخلايا العصبية مطلية في كثافة منخفضة في معظم الأحيان، والتي لا البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، على الأرجح بسبب عدم وجود الدعم الغذائي8 التي يتم توفيرها من قبل الخلايا العصبية المجاورة والخلايا الغليفية. وقد اقترحت بعض الأساليب حتى المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الأولية مع الخلايا الدبقية، حيث يتم استخدام الخلايا الدبقية كطبقة مغذية9. ومع ذلك، فإن الخلايا الغليفية تشكل الكثير من المشاكل بسبب فرط نموها، والتي تتجاوز في بعض الأحيان نمو الخلايا العصبية10. وبالتالي، وبالنظر إلى المشاكل المذكورة أعلاه، مطلوب بروتوكول أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة للثقافة العصبية الأولية، والتي يمكن استخدامها من قبل كل من علماء الأحياء العصبية والكيميائيين العصبيين للتحقيقات.
ثقافة الخلايا العصبية الأولية هي أساسا شكل من أشكال الثقافة 2D ولا تمثل اللدونة، والسلامة المكانية، أو عدم تجانس الدماغ. وقد أدى هذا إلى الحاجة إلى نموذج 3D أكثر تصديقا يسمى neurospheres11,12. المجالات العصبية تقدم منصة جديدة لعلماء الأعصاب، مع تشابه أقرب إلى الحقيقي، في الدماغ في الجسم الحي13. المجالات العصبية هي مجموعات ثلاثية الجوانب غير ملتصقة من الخلايا الغنية بالخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، والخلايا السلف العصبية (NPCs)، والخلايا العصبية، والخلايا النجمية. فهي مصدر ممتاز لعزل الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف العصبية، والتي يمكن استخدامها لدراسة التمايز في مختلف السلالات العصبية وغير العصبية. ومرة أخرى، يشكل التغير داخل ثقافات الغلاف العصبي المنتجة باستخدام البروتوكولات المبلغ عنها سابقا عائقا أمام صياغة بروتوكول موحد لثقافة الغلاف العصبي14.
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا يمكن فيه توليد منصات ثلاثية المدة وثلاثية المدة بالتناوب مع كثافات طلاء الخلايا من ثقافة القشرية وفرس النهر المختلطة. ويلاحظ أنه في غضون 7 أيام يتم الحصول على المجالات العصبية العائمة الحرة من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة معزولة عن E14-E16 Sprague Dawley الفئران الجنين، والتي على مزيد من الثقافة، وتشكيل الجسور والترابط من خلال ملحقات شعاعي مثل glial. وبالمثل، في الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة، يتم الحصول على ثقافة الخلايا العصبية الأولية التي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 30 يوما عن طريق تغيير وسط الصيانة مرتين في الأسبوع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

ثقافة الخلايا العصبية الأولية هي تقنية أساسية في مجال علم الأعصاب. للحصول على رؤى ميكانيكية أعمق في الدماغ، فمن الضروري أن يكون لديك نموذج قوي في المختبر التي يمكن استغلالها لمختلف دراسات علم الأحياء العصبية. على الرغم من أن الثقافات العصبية الأولية (أي، الثقافات فرس النهر على المدى الطويل) قدمت العلماء مع النماذج، فإنه لا يمثل حتى الآن تعقيد شبكة الدماغ تماما. في أعقاب هذه القيود، ظهر نموذج جديد باستخدام المجالات العصبية، والتي تحمل تشابها أوثق إلى أنسجة الدماغ. يصف هذا البروتوكول طلاء الكثافات العالية والمنخفضة من الخلايا العصبية القشرية وفرس النهر المختلطة المعزولة من جنين اليوم الجنيني 14-16 الفئران سبراغ داولي. وهذا يسمح لتوليد المجالات العصبية وثقافة الخلايا العصبية الأولية على المدى الطويل كمنصتين مستقلتين لإجراء مزيد من الدراسات. هذه العملية بسيطة للغاية وفعالة من حيث التكلفة, كما أنه يقلل من عدة خطوات والكواشف تعتبر سابقا ضرورية لثقافة الخلايا العصبية. هذا هو بروتوكول قوي مع الحد الأدنى من المتطلبات التي يمكن تنفيذها مع نتائج قابلة للتحقيق ومزيد من الاستخدام لتنوع الدراسات المتعلقة بعلم الأعصاب.

في هذا البروتوكول، تم توضيح استراتيجية بسيطة يتم فيها الحصول على كثافات طلاء الخلايا المتغيرة من اثنين من منصات الفحص العصبي المختلفة. الشكل 1A،B يوضح التزام الخلايا بعد 4 ساعة من طلاء الخلايا العصبية في الخلايا المطلي عالية ومنخفضة الكثافة ، على...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

يقدم هنا بروتوكول للجيل التلقائي من المجالات العصبية المخصب في الخلايا السلف العصبية من الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة. خلال نفس التجربة، عندما يتم طلاء الخلايا العصبية في كثافة أقل، والبروتوكول يؤدي أيضا في الثقافات العصبية الفئران الأولية لفترات طويلة.

جيل من المجالات العصبية من الخلايا العصبية خلية فرس النهر الأولية المختلطة والقشرية معزولة عن E14-E16 سبراغ دولي الفئران الجنين

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو إثبات تطور الخلايا العصبية من فرس النهر والخلايا العصبية القشرية الأولية المختلطة المعزولة من جنين الفئران E14-E16 Sprague Doley ، من أجل تقديم منصة قوية ومنخفضة التكلفة لدراسة تأثير مختلف خيوط العلاج العصبي. كما تعلمون، أن الدماغ هو شبكة معقدة من الخلايا العصبية المرتبطة بعدد كبير من الخلايا الداعمة. لفهم وظيفة الدماغ، وغالبا ما يتم إعادة بدء معظم البحوث من التجارب في المختبر، والتي تنطوي على خطوط الخلايا المشتقة من النسب العصبي المتاحة تجاريا.ومع ذلك، يتم تحويل خطوط الخلية هذه خطوط الخلايا التي تعاني من الاختلافات genotypic وphenotypic. لمعالجة هذه القضايا، وثقافة الخلايا العصبية الأولية هو النهج المناسب. هنا، أوضحنا بروتوكول بسيط وفعال من حيث التكلفة لثقافة الخلايا العصبية الأولية وبنينا منصة فحص قوية لمختلف العلاجات العصبية.الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه فقط عن طريق تحوير كثافات طلاء الخلايا، يمكننا عرض اثنين من منصات ثقافة الخلايا العصبية المتناقضة حيث يؤدي انخفاض الكثافة إلى ثقافة الخلايا العصبية الأولية لفترات طويلة، وتولد عالية الكثافة الخلايا العصبية العفوية. خذ 24-صحن جيدا. واحدة للكثافة العالية، وأخرى للطلاء منخفض الكثافة.نقل 12 مم من أغطية الزجاج المعقمة في لوحات 24-جيدا. صب 300 ميكرولترات من محلول PDL في كل من الآبار بطريقة تغطي بالكامل سطح الغطاء بأكمله. تحضير محلول PDL بتركيز 0.1 ملغ/مل في المياه الأيونية.لف الألواح مع رقائق الألومنيوم لمنع التجفيف، والاحتفاظ بها في حاضنة CO2 بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قبل الطلاء، الطامح حل PDL. يُغسل بشكل صحيح بالماء المعقم لمدة مرتين إلى ثلاث مرات.ثم إضافة وسائل الاعلام الطلاء، والعودة لوحات إلى الحاضنة حتى الطلاء. التضحية A14-E16 توقيت الحوامل Sprague-Dawley الفئران, جعل قطع على شكل حرف V في منطقة البطن باستخدام ملقط العقيمة وزوج من مقص نهاية حادة. إزالة جميع الأجنة ووضعها بعناية على لوحة بتري مع حل HBSS الباردة.أخرج الأجنة من الـ"الاحتياز الجنيني" واغسلها بعناية في طبق بتري منفصل في هجنس طازج وبارد. قطع رأس مع مساعدة من مقص معقمة. نقل رؤساء في لوحات معقمة 90 مم بتري مع HBSS الباردة.تحت المجهر ستيريو، عقد الرأس من منطقة خطم مع ملقط مسننة معقمة، والخروج من الدماغ عن طريق قطع الجلد والجمجمة مفتوحة. إزالة جميع السحايات من نصفي الكرة الأرضية و midbrain من خلال عقد جذع الدماغ. إزالة بعناية نصفي الكرة الأرضية سليمة، تشبه قبعات الفطر الذي يحتوي على قرن آمون والقشرة.جمع نصفي الكرة الأرضية التي تحتوي على القشرة والحصون سليمة في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام الانفصام. السماح للأنسجة التي تم جمعها ليستقر، ويتبخر وسيط تفكك، وترك خمسة إلى عشرة في المئة من المتوسطة في ذلك. مرة أخرى، إضافة 10 مل من فصاية جديدة إلى ذلك، وتكرار هذه الخطوة مرتين.إضافة 4.5 مل من منتصف التفكك و 0.5 مل من محلول التربسين-EDTA. يبقيه في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لعملية الهضم للمضي قدما. التعرق المتوسطة وغسل مع 10 مل من تفكك المتوسطة والطلاء المتوسطة، على التوالي.resuspend لهم في 2.5 مل من وسط الطلاء. حافظ على طبق معقمة 90 مم فوق الغطاء المقلوب للطبق واسكبه في قاعدة طبق معقمة مقاس 90 مم. تثليت الأنسجة المهضوجة في قاعدة الزاوية من الطبق، وذلك باستخدام 1000 طرف ماصة ميكرولتر، وذلك لاحتلال أقل حجم.تمرير تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر، باستثناء أي قطع من الأنسجة. تحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد الصبغة الزرقاء trypan، وعد عدد الخلايا في عداد الخلايا الآلي. تخفيف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها بطريقة بحيث لوحة 1.5 في 10 إلى قوة 5 خلايا لكل مل للطلاء عالية الكثافة، و 20،000 خلية لكل مل للطلاء منخفضة الكثافة في أنبوبين منفصلين تحتوي على 30 مل من المتوسط الطلاء.التعرق وأضاف سابقا طلاء المتوسطة وطبقة 500 ميكرولترات من الخلايا المنتشرة في وسط الطلاء في كل بئر. بعد ذلك، إعادة لوحات إلى الحاضنة لمدة أربع ساعات. بعد أربع ساعات من الطلاء، فحص الخلايا للتمسك تحت المجهر.بعد أربع ساعات من الطلاء، في كل من لوحات عالية ومنخفضة الكثافة، وتظهر الخلايا العصبية الالتزام جيدة لوحات. استبدل الوسط في كل بئر بـ 500 ميكرولترات من وسط الصيانة الطازجة، وحضنها في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. علينا أن نزرع هذه الخلايا العصبية المطلية لها في الكثافة العالية والمنخفضة.في حين أن الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة يمكن استخدامها للثقافات لفترات طويلة، تصل إلى 30 يوما، عن طريق تغيير متوسط الصيانة مرتين في الأسبوع، والخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة يبدأ لتوليد تلقائيا neurospheres، والتي جاءت بعد يوم من الحفاظ على في لوحة منخفضة جدا. بعد 24 ساعة من الطلاء ، لوحظ أن كلا من الخلايا العصبية ذات الكثافة العالية والمنخفضة مطلي لعرض مورفولوجيا صحية. يتم عرض صورة على النقيض من المرحلة من الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة، المستزرعة لمدة سبعة أيام تقريبا، هنا.الخلايا العصبية عرض مورفولوجيا صحية، ويمكن الحفاظ على ما يصل إلى 30 يوما مع توجيه أكثر قوة والترابط. الرسم البياني شريط هنا يظهر حوالي 90 في المئة جدوى الخلايا العصبية مطلي منخفضة الكثافة حتى بعد 30 يوما من الثقافة، كما يحددها مقايسة MTT. وقد تميزت الخلايا العصبية الأولية هنا من خلال المناعة مع تو 1، علامة على الخلايا العصبية المتباينة، وتاو، علامة على المحاور العصبية.يتم تأكيد نقاء الخلايا العصبية من خلال عدم وجود تلطيخ في علامات غير الخلايا العصبية GFAP للسيبات الفلكية و O4 ل oligodendrocytes. في جميع دراسات التوصيف، وقد لطخت النوى مع Hoechst 33258. هنا ، تم لطخ الخلايا المصنفة منخفضة الكثافة بعلامة GFAP الفلكية وعلامة الخلايا العصبية Tuj 1 للتحقق من نقاء الثقافة حتى سبعة أيام.ويلاحظ أن هذا البروتوكول يدعم النمو التفضيلي للخلايا العصبية على الخلايا الفلكية كما هو مبين من خلال التحليل الكمي. وقد لطخت Nuclei مع Hoechst 33258. وبالمثل ، في الخلايا المصنفة عالية الكثافة ، وقد لطخت الخلايا الفلكية مع GFAP والخلايا العصبية من قبل Tuj 1.هنا، في التحليل الكمي، لوحظ حوالي 17 في المئة من الخلايا الفلكية بالمقارنة مع 83 في المئة من الخلايا العصبية. وقد لطخت نوى مع Hoechst 33258. بعد سبعة أيام ، يتم ملاحظة عدة خلايا عصبية تشكلت بشكل عفوي في الخلايا العصبية عالية الكثافة.حول اليوم الثامن إلى العاشر من الثقافة، في الخلايا العصبية مطلي عالية الكثافة، يبدأ الخلايا العصبية لتشكيل الإسقاطات الكبيرة والجسور التي تتكون من امتدادات تشبه الزبقية شعاعي. تشير الأسهم السوداء إلى الجسر بين اثنين من الاعصاب المشكلة حديثا. تم إجراء فحص الخلايا الحية والميتة على الخلايا العصبية لمدة 15 يومًا.في كثيفة صبغ الكالسين AM، مع أي أي بوديد البروديوم على الإطلاق تلطيخ، يشير إلى ما يقرب من 100 في المئة صلاحية من neurospheres في الثقافة. يشير الرسم البياني الخطي هنا إلى توسع في حجم الـ neurospheres مع مرور عدد الأيام. هذه الصورة الملطخة بشكل مفرط من الغلاف العصبي يشير إلى عدد كبير من الخلايا السلف العصبي من خلال زيادة التعبير عن علامات NPC نستين و Tuj 1.تظهر الخلايا العصبية هنا كميات عالية من الخلايا الفلكية التي تميزت بالتعبير القوي عن GFAP ، مصحوبة بتعبير أعلى من علامة الخلايا العصبية Tuj 1. وقد لطخت نوى مع Hoechst 33258. لذلك أعتقد أن بروتوكولنا مثير ومثير للاهتمام، بالنظر إلى حقيقة أنه من خلال استراتيجية واحدة، يمكننا الحصول على منصتين: واحدة 2-D و 3-D.وهذا سيكون منصة كبيرة لفحص المسارات العلاجية العصبية المختلفة. لذا أعتقد أنه مفيد حقاً لجميع علماء الأعصاب. أيضا جانب آخر مهم هو أن neurospheres نختار في غنية للغاية في الخلايا السلف العصبية، وNPCS.ويمكن استخدامها لتمييزها إلى الخلايا العصبية و النسب غير العصبية. لذلك ، أشعر أنه إذا كان ، حقا ، يمكن للناس السيطرة على هذه التقنية من خلال أخذ المساعدة من هذا الفيديو ، سيكون من المفيد حقا للجميع. شكرًا لك.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

جيل من الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة الجنينية البشرية المهملة القشرية

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

وهناك طريقة العقداء العقد حقن في سبراغ داولي الفئران

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...