Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

我们感谢CSIR-IICB动物设施。G. D. 感谢ICMR、J.K.和V.G.感谢DST Inspire，D.M.感谢印度DBT的奖学金。S. G. 请确认 SERB （EMR/2015/002230） 印度提供财政支持。

涉及动物的所有实验程序都经印度化学生物学研究所的机构动物伦理委员会（IICB/AEC/会议/2018/1年4月）批准。
1. 试剂和介质制备
<ol><li>聚D-莱辛（PDL）溶液：在去离子水中以0.1mg/mL的浓度制备PDL溶液，并储存在4°C中，直到使用。</li>
	<li>分离介质：至1 L的无菌、过滤脱离子水，在相应浓度中结合以下组分：氯化钠（8毫克/升）、氯化钾（0.4毫克/升L）、磷酸钾单基（0.06毫克/升...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

该协议描述了如何通过改变主神经元的细胞电镀密度，获得两个可变神经元平台。虽然这是一个简单的方法，但必须仔细执行每个步骤才能达到预期的结果。其他以前的方法要么报告长期原发神经元培养或神经圈培养。大多数主要神经元培养协议都涉及海马神经元的培养3-5周，但大多数已经失败，因为神经元死亡和枯萎，由于失去连接。该协议的另一个优点是，神经元可以培养，而无需任何胶质?...

大脑是神经元和非神经元细胞的复杂回路。多年来，科学家们一直试图深入了解这种复杂的机器。为此，神经科学家最初利用各种转化的神经基细胞系进行调查。然而，这些克隆细胞系无法形成强突触连接和适当的斧子或树突，转移了科学兴趣的主要神经元培养1，2。原始神经元文化最令人兴奋的方面是，它创造了观察和操纵活神经元的机会3。此外，与神经组织相比，它不太复杂，因此成为研究各种神经元蛋白质的功能和传输的理想候选者。最近，显微镜、基因组学和蛋白质组学领域的一些发展为神经科学家创造了利用神经元培养的新机会。
初级文化使神经科学家能够探索神经发育背后的分子机制，分析各种神经信号通路，并发展对突触的更连贯的理解。虽然许多方法已经报告了来自主神经元的培养物（主要来自海马起源5，6，7），但具有化学定义的介质的统一协议是，使神经元的长期培养仍然需要。然而，在低密度下镀层的神经元最常被观察到，这些神经元不能长期存活，这可能是由于缺乏营养支持8，而营养支持是由相邻的神经元和胶质细胞提供的。一些方法甚至建议与胶质细胞共同培养主神经元，其中胶质细胞用作第9层的供料层。然而，胶质细胞由于过度生长而引起许多问题，有时会覆盖神经元的生长。因此，考虑到上述问题，需要一种更简单、更具成本效益的初级神经培养方案，神经生物学家和神经化学家都可以用于研究。
初级神经元文化本质上是一种二维文化形式，并不代表大脑的可塑性、空间完整性或异质性。这就产生了一个更可信的3D模型，称为神经球11，12的需要。神经球为神经科学家提供一个新颖的平台，与真正的、体内的大脑更相似。神经球是富含神经干细胞（NSC）、神经祖细胞（NPC）、神经元和星形细胞的非粘附性3D细胞簇。它们是神经干细胞和神经祖细胞分离的极好来源，可用于研究各种神经元和非神经元谱系的分化。同样，使用先前报告的协议产生的神经圈培养物的变异性对制定统一的神经圈培养方案14构成了障碍。
本手稿提出了一个协议，通过从混合皮质和海马培养中交替细胞电镀密度，可以生成 2D 和 3D 平台。据观察，在7天内，自由浮动的神经球是从从E14-E16斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的高密度镀层神经元中获得的，这些神经元在进一步培养后，通过径向胶质状的延伸形成桥梁和互连。同样，在低密度镀层神经元中，通过每周两次改变维持介质，可以维持长达30天的主要神经元培养。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

初级神经元培养是神经科学领域必不可少的技术。为了获得对大脑的更深层次的机械洞察力，必须有一个强大的体外模型，可用于各种神经生物学研究。虽然原始神经元培养（即长期海马文化）为科学家提供了模型，但它还不能完全代表大脑网络的复杂性。在这些限制之后，一个新的模型出现了使用神经球，这与脑组织有更密切的相似之处。本协议描述了从胚胎第14-16天斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的混合皮质和海马神经元的高密度和低密度的电镀。这允许产生神经球和长期初级神经元培养作为两个独立的平台进行进一步研究。这个过程非常简单且经济高效，因为它最大限度地减少了以前被认为对神经元培养至关重要的几个步骤和试剂。这是一个强大的协议，具有最低要求，可以执行与可实现的结果，并进一步用于与神经科学相关的各种研究。

在该协议中，阐明了一种简单的策略，即从两个不同的神经筛选平台获得可变细胞电镀密度。图1A，B分别说明了高密度和低密度电镀细胞中神经元电镀4小时后细胞的依从性。在观察如图1所示的神经元的正确附着性时，电镀介质被每个井中的维护介质所取代，从而在37°C时返回到培养箱。在高密度镀层神经元中观察?...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

这里介绍的是一个协议，用于从高密度镀电神经元中神经祖细胞中富集的神经球的自发生成。在同一实验中，当神经元以较低的密度被镀层时，该协议也会导致长期原发性大鼠神经元培养。

从E14-E16斯普拉格·道利大鼠胚胎分离的混合原发希马和皮质神经元生成神经球

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

该程序的总体目标是演示从E14-E16 Sprague Dawley大鼠胚胎分离出的混合原生海马和皮质神经元中神经球的发展，以便为研究各种神经治疗引线的影响提供一个稳健且低成本的平台。如您了解，大脑是一个复杂的神经元网络，与大量的支持细胞相关。为了理解大脑功能，大多数研究通常是从体外实验中重新发起的，其中涉及商业上可用的神经谱系衍生细胞系。然而，这种细胞系是转化的细胞系，它们患有基因和表型变异。要解决这个问题，初级神经元培养是合适的方法。在这里，我们演示了一个简单且经济高效的培养初级神经元的协议，并构建了一个强大的筛选平台，用于各种神经治疗。该协议的主要优点是，只要调节细胞电镀密度，我们就可以展示两个对比鲜明的神经元培养平台，其中低密度导致长时间的原发神经元培养，而高密度产生自发的神经球。拿两个24孔板。一个用于高密度，另一个用于低密度电镀。在 24 孔板中转移 12 mm 的无菌玻璃盖玻片。将 300 微升的 PDL 溶液倒入每个孔中，使其完全覆盖整个盖玻片的表面。在去压水中以0.1毫克/mL的浓度准备PDL溶液。用铝箔包裹板，防止干燥，并将其放在 CO2 培养箱中过夜。第二天，在电镀之前，先吸进 PDL 解决方案。用无菌水正确清洗两到三次。然后添加电镀介质，并将板返回到培养箱，直到电镀。牺牲一只E14-E16正时怀孕的Sprague-Dawley大鼠，用无菌钳子和一双钝端剪刀在腹部区域做一个V形切口。取出所有胎儿，用冷的HSS溶液小心地将它们放在培养盘上。将胚胎从胚胎囊中拿出来，在新鲜、寒冷的HBVS中，在单独的培养皿中仔细清洗。用无菌剪刀斩首头部。用冷 HBSS 转移无菌 90 mm 培养板中的头。在立体显微镜下，用无菌锯齿钳将头部从鼻子区域握住，然后通过切开皮肤和头骨来将大脑切开。通过持有脑干，从半球和中脑中去除所有的脑筋。小心地去除完整的半球，类似于包含海马和皮层的蘑菇帽。在含有10 mL分离介质的15 mL锥形管中收集含有皮层和完整海马的半球。让收集的组织安定下来，吸气分离介质，留下百分之五到百分之十的介质。再次，添加 10 mL 的新鲜分离介质，并重复此步骤两次。添加 4.5 mL 分离介质和 0.5 mL 的 trypsin-EDTA 溶液。在37摄氏度的培养箱中保持20分钟，以便进行消化。连续吸气介质，用10 mL的分离介质和电镀介质进行洗涤。在2.5 mL的电镀介质中重新暂停。将 90 mm 无菌盘放在盘子的倒置盖上，倒入 90 mm 无菌盘的底座中。使用1000微升移液器尖端将消化的组织放在菜的角底，以占用最少的体积。通过70微米细胞过滤器，通过获得的细胞悬浮液，不包括任何组织块。使用 trypan 蓝色染料排除确定可行细胞的密度，并计算自动细胞计数器中的细胞数。将获得的电池数量稀释，使1.5至10的功率为每mL5个细胞，用于高密度电镀，将每mL20，000个细胞用于在含有30 mL电镀介质的两个独立管中进行低密度电镀。吸气先前添加的电镀介质和板500微升的细胞分散在每一个井的电镀介质。之后，将盘子返回孵化器四小时。电镀后四小时，检查细胞在显微镜下粘附。经过四个小时的电镀后，在高密度和低密度板中，神经元表现出良好的粘附性。用500微升的新鲜维护介质代替每井的培养剂，并在37摄氏度的培养箱中孵化。我们必须培养这些在高密度和低密度下镀的神经元。虽然低密度镀层神经元可用于长期培养，长达30天，通过改变维持介质每周两次，高密度镀层神经元开始自发产生神经球，这一天后，我们保持在超低附着板。经过24小时的电镀后，观察到高密度和低密度镀层神经元都表现出健康的形态。此处显示低密度镀层神经元的相位对比度图像，培养约七天。神经元显示健康的形态，可以保持长达30天与更有力的路由和互连。这里的条形图显示了低密度镀层神经元的大约 90% 的生存能力，即使经过 30 天的培养，由 MTT 测定确定。这里的初级神经元的特点是免疫，用Tuj 1，分化神经元的标记，和tau，神经元轴突的标记。非神经元标记GFAP中无染色证实神经元的纯度，而84中对利戈多细胞没有染色。在所有表征研究中，核都沾染了霍赫斯特33258。在这里，低密度种子细胞已经染色的天体细胞标记GFAP和神经元标记Tuj 1，以检查培养物的纯度长达7天。据观察，该协议支持神经元比星细胞的优待生长，通过定量分析表明。核已经沾染了霍赫斯特 33258 。同样，在高密度种子细胞中，星细胞被Tuj 1染色与GFAP和神经元。在这里，在定量分析中，观察到约17%的星细胞，而83%的神经元。核已经沾满了霍赫斯特 33258 。七天后，在高密度神经元中自发形成多个神经球。在培养的第八天到第十天左右，在高密度镀层神经元中，神经球开始形成由径向胶质线延伸组成的大投影和桥梁。黑色箭头表示两个新形成的神经球之间的桥梁。活细胞和死细胞测定在神经球上进行了15天。在密集的钙素 AM 染色中，绝对没有碘化染色，表明神经球在培养中几乎 100% 的生存能力。这里的线图表示神经球大小的扩展，天数的流逝。这种过度染色的神经球图像表明，通过NPC标记内丁和Tuj 1的表达增加，神经祖细胞的丰富种群。这里的神经球显示大量的星形细胞，以GFAP的强烈表达为标志，伴随着神经元标记Tuj 1的更高表达。核已经沾满了霍赫斯特 33258 。因此，我认为我们的协议是相当令人兴奋和有趣的，考虑到一个事实，即从一个单一的策略，我们能够得到两个平台：一个二D和一个3-D。这将是一个很好的平台，筛选不同的神经治疗轨道。所以我想它真的对所有神经科学家都很有用。另一个重要方面是，我们选择的神经球是非常丰富的神经祖细胞，NPC。它们可以用来将它们区分成神经元和非神经元血统。所以，我觉得如果，真的，人们可以掌握这个技术，从这个视频的帮助，这将是真正有用的每个人。谢谢。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection和胚胎小鼠海马和皮层神经元的原代培养

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

科研

神经科学

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

从废弃的人类胎儿大脑皮质组织神经干细胞的生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

活大鼠皮层神经元线粒体膜电位和活性氧的测定

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

二层共培养小学的大鼠皮层神经元和神经胶质

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

从产前小鼠海马神经元的分离和培养

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

原代海马神经元的磷酸钙转染

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

成像大鼠原代海马神经元树突棘使用结构照明显微镜

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

结状神经节注射液只SD大鼠的方法

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

大鼠皮层神经元丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）泪点的量化

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...