Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Nous remercions l'installation animale du CSIR-IICB. G. D. remercie ICMR, J. K. et V. G. remercient DST Inspire, et D. M. remercie DBT, India pour leurs bourses. S. G. reconnaît avec bienveillance serb (EMR/2015/002230) inde pour fournir un soutien financier.

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique animale institutionnelle du CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1. Réagent et préparation des médias
<ol><li>Solution de poly-d-lysine (PDL) : préparer des solutions PDL à des concentrations de 0,1 mg/mL dans de l'eau déionisée et stocker à 4 oC jusqu'à utilisation.</li>
	<li>Moyen de dissociation : À 1 L d'eau déionisée stérile et fi...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Ce protocole décrit comment en modifiant les densités de placage cellulaire des neurones primaires, deux plates-formes neuronales variables sont obtenues. Bien qu'il s'agisse d'une méthode simple, chaque étape doit être méticuleusement effectuée pour obtenir les résultats souhaités. D'autres méthodes précédentes ont rapporté des cultures primaires à long terme de neurone ou des cultures de neurosphère. La plupart des protocoles de culture neuronale primaire ont impliqué la culture des neurones hippocampiq...

Le cerveau est un circuit complexe de cellules neuronales et non neuronales. Pendant des années, les scientifiques ont essayé d'obtenir un aperçu de cette machinerie complexe. Pour ce faire, les neuroscientifiques ont d'abord eu recours à diverses lignées cellulaires à base de nerfs transformées pour des enquêtes. Cependant, l'incapacité de ces lignées cellulaires clonales à former de fortes connexions synaptiques et des axones ou dendrites appropriés ont déplacé l'intérêt scientifique vers les cultures neuronales primaires1,2. L'aspect le plus excitant de la culture neuronale primaire est qu'il crée une occasion d'observer et de manipuler les neurones vivants3. En outre, il est moins complexe par rapport au tissu neural, ce qui en fait un candidat idéal pour étudier la fonction et le transport de diverses protéines neuronales. Récemment, plusieurs développements dans les domaines de la microscopie, de la génomique et de la protéomique ont généré de nouvelles opportunités pour les neuroscientifiques d'exploiter les cultures neuronales4.
Les cultures primaires ont permis aux neuroscientifiques d'explorer les mécanismes moléculaires derrière le développement neuronal, d'analyser diverses voies de signalisation neuronale et de développer une compréhension plus cohérente de la synapse. Bien qu'un certain nombre de méthodes aient rapporté des cultures des neurones primaires (principalement de l'origine hippocampique5,6,7), un protocole unifié avec un milieu chimiquement défini qui permet la culture à long terme des neurones est encore nécessaire. Cependant, les neurones plaqués à une faible densité sont le plus souvent observés, qui ne survivent pas à long terme, probablement en raison du manque de soutien trophique8 qui est fourni par les neurones adjacents et les cellules gliales. Certaines méthodes ont même suggéré la co-culture des neurones primaires avec des cellules gliales, dans laquelle les cellules gliales sont utilisées comme couche d'alimentation9. Cependant, les cellules gliales posent beaucoup de problèmes en raison de leur surcroissance, qui l'emportent parfois sur la croissance neuronale10. Par conséquent, compte tenu des problèmes ci-dessus, un protocole de culture neuronale primaire plus simple et plus rentable est nécessaire, qui peut être utilisé par les neurobiologistes et les neurochimistes pour les enquêtes.
Une culture neuronale primaire est essentiellement une forme de culture 2D et ne représente pas la plasticité, l'intégrité spatiale ou l'hétérogénéité du cerveau. Cela a donné lieu à la nécessité d'un modèle 3D plus crédible appelé neurosphères11,12. Les neurosphères présentent une nouvelle plate-forme aux neuroscientifiques, avec une ressemblance plus étroite avec le cerveau réel, in vivo13. Les neurosphères sont des grappes 3D non adhérentes de cellules riches en cellules souches neurales (NSC), en cellules progénitrices neurales (NPC), neurones et astrocytes. Ils sont une excellente source pour l'isolement des cellules souches neurales et des cellules progénitrices neurales, qui peuvent être utilisées pour étudier la différenciation en diverses lignées neuronales et non neuronales. Encore une fois, la variabilité au sein des cultures de neurosphère produite à l'aide des protocoles précédemment rapportés présente un obstacle à la formulation d'un protocole unifié de culture de neurosphère14.
Ce manuscrit présente un protocole dans lequel il est possible de générer des plates-formes 2D et 3D en alternant les densités de placage cellulaire à partir d'une culture corticale et hippocampal mixte. On observe que dans un délai de 7 jours, des neurosphères flottantes sont obtenues à partir de neurones plaqués à haute densité isolés de l'embryon de rat E14-E16 Sprague Dawley, qui, sur une autre culture, forment des ponts et des interconnexions par des extensions gliales radiaux. De même, dans les neurones plaqués de faible densité, une culture neuronale primaire qui peut être maintenue jusqu'à 30 jours est obtenue en changeant le milieu d'entretien deux fois par semaine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

La culture neuronale primaire est une technique essentielle dans le domaine des neurosciences. Pour obtenir des connaissances mécanistes plus approfondies dans le cerveau, il est essentiel d'avoir un modèle in vitro robuste qui peut être exploité pour diverses études de neurobiologie. Bien que les cultures neuronales primaires (c.-à-d., les cultures hippocampales à long terme) aient fourni aux scientifiques des modèles, il ne représente pas encore complètement la complexité du réseau cérébral. Dans le sillage de ces limitations, un nouveau modèle a émergé en utilisant des neurosphères, qui ressemble plus étroitement au tissu cérébral. Le protocole actuel décrit le placage des densités élevées et basses des neurones corticaux et hippocampal mélangés isolés de l'embryon des rats embryonnaires de jour 14-16 de Sprague Dawley. Cela permet la génération de neurosphères et la culture neuronale primaire à long terme comme deux plates-formes indépendantes pour mener d'autres études. Ce processus est extrêmement simple et rentable, car il minimise plusieurs étapes et réactifs précédemment jugés essentiels pour la culture neuronale. Il s'agit d'un protocole robuste avec des exigences minimales qui peuvent être effectuées avec des résultats réalisables et encore utilisé pour une diversité d'études liées aux neurosciences.

Dans ce protocole, une stratégie simple a été élucidée dans laquelle des densités variables de placage cellulaire de deux plates-formes différentes de criblage neural sont obtenues. Figure 1A,B illustre l'adhérence des cellules après 4 h de placage des neurones dans les cellules plaquées à haute et faible densité, respectivement. En observant la bonne adhérence des neurones comme indiqué à la figure 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Présenté ici est un protocole pour la génération spontanée de neurosphères enrichies dans les cellules progénitrices neurales des neurones plaqués de haute densité. Au cours de la même expérience, lorsque les neurones sont plaqués à une densité plus faible, le protocole entraîne également des cultures de neurones de rat primaire prolongées.

Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer le développement des neurosphères à partir de neurones hippocampaux et corticals primaires mixtes isolés de l’embryon de rat Sprague Dawley E14-E16, afin d’offrir une plate-forme robuste et peu coûteuse pour étudier l’effet de diverses pistes neurothérapeutiques. Comme vous le savez, ce cerveau est un réseau complexe de neurones associés à un grand nombre de cellules de soutien. Pour comprendre la fonction cérébrale, la plupart des recherches sont souvent rééditées à partir d’expériences in vitro, qui impliquent des lignées cellulaires dérivées de lignées neurales disponibles dans le commerce.Cependant, ces lignées cellulaires sont des lignées cellulaires transformées qui souffrent de variations génotypiques et phénotypiques. Pour résoudre ce problème, la culture des neurones primaires est l’approche appropriée. Ici, nous avons illustré un protocole simple et rentable pour la culture des neurones primaires et construit une plate-forme de dépistage robuste pour diverses thérapeutiques neuronales.Le principal avantage de ce protocole est que juste en modulant les densités de placage cellulaire, nous pouvons présenter deux plates-formes contrastantes de culture de neurones où la basse densité mène à la culture primaire prolongée de neurone, et la haute densité génère des neurosphères spontanées. Prenez deux assiettes de 24 puits. L’un pour la haute densité, et l’autre pour le placage à faible densité.Transférer 12 mm de couvertures stériles en verre dans les plaques de 24 puits. Versez 300 microlitres de solution PDL dans chacun des puits d’une manière qu’il couvre entièrement la surface de l’ensemble du coverslip. Préparer la solution PDL à une concentration de 0,1 mg/mL dans l’eau déionisée.Envelopper les assiettes de feuilles d’aluminium pour éviter le séchage et les conserver dans l’incubateur de CO2 pendant la nuit. Le lendemain, avant le placage, aspirer la solution PDL. Laver correctement avec de l’eau stérile pendant deux à trois fois.Ajouter ensuite les supports de placage et remettre les assiettes à l’incubateur jusqu’au placage. Sacrifiez un rat Sprague-Dawley enceinte de temps E14-E16, faites une coupe en forme de V dans la région abdominale à l’aide de forceps stériles et d’une paire de ciseaux émoussés. Retirez tous les fœtus et placez-les soigneusement sur la plaque de Pétri avec la solution HBSS froide.Sortez les embryons des sacs embryonnaires et lavez-les soigneusement dans une boîte de Pétri séparée dans du HBSS frais et froid. Décapiter la tête à l’aide de ciseaux stériles. Transférer les têtes dans les plaques de Pétri stériles de 90 mm avec du HBSS froid.Sous le microscope stéréo, tenez la tête de la région du museau avec les forceps dentelés stériles, et sortez le cerveau en coupant la peau et le crâne ouverts. Enlevez toutes les méninges des hémisphères et du cerveau moyen en tenant le tronc cérébral. Retirez soigneusement les hémisphères intacts, ressemblant à des chapeaux de champignons qui contiennent l’hippocampe et le cortex.Recueillir les hémisphères contenant le cortex et l’hippocampe intact dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de médias de dissociation. Permettre aux tissus recueillis de s’installer, et aspirer le milieu de dissociation, laissant cinq à dix pour cent de milieu en elle. Encore une fois, ajouter 10 mL de dissociation fraîche moyenne à elle, et répéter cette étape deux fois.Ajouter 4,5 mL de milieu de dissociation et 0,5 mL de solution trypsine-EDTA. Gardez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour que la digestion se poursuive. Aspirer le milieu et laver avec 10 mL de milieu de dissociation et de placage moyen, consécutivement.Resuspendez-les en 2,5 mL de support de placage. Conserver un plat stérile de 90 mm sur le couvercle inversé du plat et le verser à la base d’un plat stérile de 90 mm. Titrer les tissus digérés dans la base d’angle du plat, en utilisant 1000 pointe de pipette microliter, afin d’occuper le moins de volume.Passez la suspension cellulaire obtenue à travers la passoire cellulaire de 70 micromètres, à l’exclusion de tout morceau de tissu. Déterminez la densité des cellules viables à l’aide de l’exclusion du colorant bleu trypan et comptez le nombre de cellules dans un compteur de cellules automatisé. Diluer le nombre de cellules obtenues de manière à plaquer 1,5 en 10 à la puissance de 5 cellules par mL pour le placage à haute densité, et 20 000 cellules par mL pour le placage de basse densité dans deux tubes séparés contenant 30 mL de milieu de placage.Aspirer le milieu de placage précédemment ajouté et plaque 500 microlitres de cellules dispersées dans le milieu de placage dans chaque puits. Après cela, retourner les assiettes à l’incubateur pendant quatre heures. Quatre heures après le placage, examiner les cellules pour l’adhérence sous le microscope.Après quatre heures de placage, dans les plaques de haute et basse densité, les neurones montrent une bonne adhérence aux plaques. Remplacez le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu d’entretien frais et incubez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Nous devons faire la culture de ces neurones plaqués à haute et basse densité.Alors que les neurones plaqués de faible densité peuvent être utilisés pour des cultures prolongées, jusqu’à 30 jours, en changeant le milieu d’entretien deux fois par semaine, les neurones plaqués haute densité commencent à générer spontanément des neurosphères, qui sont venues le lendemain de notre maintien dans une plaque d’attachement ultra-basse. Après 24 heures de placage, on observe des neurones plaqués haute et basse densité pour afficher une morphologie saine. Une image de contraste de phase des neurones plaqués de basse densité, cultivés pendant environ sept jours, est affichée ici.Les neurones affichent une morphologie saine, et peuvent être maintenus jusqu’à 30 jours avec un routage et des interconnexions plus vigoureux. Le diagramme de barre montre ici environ 90 pour cent de viabilité des neurones plaqués de basse densité, même après 30 jours de culture, tel que déterminé par l’analyse MTT. Les neurones primaires ici ont été caractérisés par l’immunostaining avec Tuj 1, un marqueur des neurones différenciés, et tau, un marqueur des axones neuronaux.La pureté des neurones est confirmée par l’absence de coloration dans les marqueurs non neuronaux GFAP pour les astrocytes et O4 pour les oligodendrocytes. Dans toutes les études de caractérisation, les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. Ici, les cellules ensemencées de basse densité ont été tachées avec le marqueur astrocytique GFAP et le marqueur neuronal Tuj 1 pour vérifier la pureté de la culture jusqu’à sept jours.Il est observé que ce protocole soutient la croissance préférentielle des neurones sur les astrocytes comme indiqué par l’analyse quantitative. Les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. De même, dans les cellules ensemencées à haute densité, les astrocytes ont été tachés de GFAP et de neurones par Tuj 1.Ici, dans l’analyse quantitative, environ 17 pour cent des astrocytes sont observés contre 83 pour cent de neurones. Les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. Après sept jours, on observe des neurosphères multiples formées spontanément dans les neurones à haute densité.Vers le huitième au dixième jour de culture, dans les neurones plaqués haute densité, les neurosphères commencent à former de grandes projections et des ponts composés d’extensions radiales en forme de glial. Les flèches noires indiquent le pont entre deux neurosphères nouvellement formées. Des analyses de cellules vivantes et mortes ont été effectuées sur les neurosphères pendant 15 jours.Dans la coloration dense de Calcein AM, sans tache d’iodure de propidium, indique presque 100 pour cent de viabilité des neurosphères dans la culture. Le graphique linéaire indique ici une expansion de la taille des neurosphères avec le passage du nombre de jours. Cette image trop tachée de la neurosphère indique une riche population de cellules progénitrices neurales grâce à l’expression accrue des marqueurs NPC Nestin et Tuj 1.Les neurosphères montrent ici de grandes quantités d’astrocytes marquées par la forte expression du GFAP, accompagnées d’une expression encore plus élevée du marqueur neuronal Tuj 1. Les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. Donc, je pense que notre protocole est très excitant et intéressant, compte tenu du fait que d’une seule stratégie, nous sommes en mesure d’obtenir deux plates-formes: un 2-D et un 3-D.Et ce sera une excellente plate-forme pour le dépistage de différentes pistes neurothérapeutiques. Donc je suppose que c’est vraiment très utile à tous les neuroscientifiques. Un autre aspect important est que les neurosphères dans laquelle nous optons sont extrêmement riches en cellules progénitrices neurales, les PNJ.Et ils peuvent être utilisés pour les différencier en neurones et lignées non neuronales. Donc, je pense que si, vraiment, les gens peuvent maîtriser cette technique en prenant l’aide de cette vidéo, il sera vraiment très utile pour tout le monde. Merci.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Recherche

Neurosciences

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Détermination des espèces d&#39;oxygène Potentiel membrane mitochondriale et réactive dans les neurones corticaux de rat en direct

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagerie épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Une méthode d&#39;injection dans les ganglions noueux rat Sprague-Dawley

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...