Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Wir danken CSIR-IICB Tieranlage. G. D. dankt ICMR, J. K. und V. G. danken DST Inspire und D. M. bei DBT, Indien für ihre Stipendien. S. G. würdigt SERB (EMR/2015/002230) Indien für die finanzielle Unterstützung.

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden von der Institutional Animal Ethics Committee of CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1) genehmigt.
1. Reagenz- und Medienzubereitung
<ol><li>Poly-D-Lysin(PDL)-Lösung: Bereiten Sie PDL-Lösungen in Konzentrationen von 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor und lagern Sie sie in 4 °C bis zur Anwendung.</li>
	<li>Dissoziationsmedium: Bis 1 L steriles, gefiltertes entionisiertes Wasser, kombinieren Sie die folgen...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. 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A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. 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A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt, dass durch die Änderung der Zellbeschichtungdichten von primären Neuronen zwei variable neuronale Plattformen erhalten werden. Obwohl dies eine einfache Methode ist, muss jeder Schritt sorgfältig ausgeführt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Andere frühere Methoden haben entweder langfristige primäre Neuronenkulturen oder Neurosphärenkulturen berichtet. Die meisten primären NeuronenkulturProtokolle haben die Kultivierung von Hippocampus-Neuronen für 3-5 Wochen beteil...

Das Gehirn ist eine komplizierte Schaltung von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen. Seit Jahren versuchen Wissenschaftler, Einblicke in diese komplexe Maschinerie zu gewinnen. Dazu griffen Neurowissenschaftler zunächst zu verschiedenen transformierten nervenbasierten Zelllinien für Untersuchungen. Jedoch, die Unfähigkeit dieser klonalen Zelllinien starke synaptische Verbindungen und richtige Axone oder Dendriten haben wissenschaftliches Interesse an primären Neuronenkulturen verschoben1,2. Der aufregendste Aspekt der primären Neuronenkultur ist, dass es eine Gelegenheit schafft, lebende Neuronen zu beobachten und zu manipulieren3. Darüber hinaus ist es weniger komplex im Vergleich zu Neuronengewebe, was es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung der Funktion und des Transports von verschiedenen neuronalen Proteinen macht. In jüngster Zeit haben mehrere Entwicklungen in den Bereichen Mikroskopie, Genomik und Proteomik neue Möglichkeiten für Neurowissenschaftler geschaffen, Neuronenkulturen auszunutzen4.
Primäre Kulturen haben es Neurowissenschaftlern ermöglicht, die molekularen Mechanismen hinter der neuronalen Entwicklung zu erforschen, verschiedene neuronale Signalwege zu analysieren und ein kohärenteres Verständnis der Synapse zu entwickeln. Obwohl eine Reihe von Methoden Kulturen aus primären Neuronen berichtet haben (meist aus dem hippocampalen Ursprung5,6,7), ist ein einheitliches Protokoll mit einem chemisch definierten Medium, das eine langfristige Kultur von Neuronen ermöglicht, noch benötigt werden. Jedoch, Neuronen mit geringer Dichte plattiert werden am häufigsten beobachtet, die nicht langfristig überleben, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an trophischen Unterstützung 8, die von den benachbarten Neuronen und Gliazellen zur Verfügung gestellt wird. Einige Methoden haben sogar vorgeschlagen, die primären Neuronen mit Gliazellen zu kultivieren, wobei die Gliazellen als Feederschicht9verwendet werden. Jedoch, Gliazellen stellen eine Menge Probleme aufgrund ihrer Überwucherung, die manchmal das neuronale Wachstum überschreiben10. Unter Berücksichtigung der oben genannten Probleme ist daher ein einfacheres und kostengünstigeres primäres neuronales Kulturprotokoll erforderlich, das sowohl von Neurobiologen als auch von Neurochemikern für Untersuchungen verwendet werden kann.
Eine primäre Neuronenkultur ist im Wesentlichen eine Form der 2D-Kultur und stellt nicht die Plastizität, räumliche Integrität oder Heterogenität des Gehirns dar. Dies hat dazu geführt, dass ein glaubwürdigeres 3D-Modell namens Neurosphären11,12benötigt wird. Neurosphären stellen Neurowissenschaftlern eine neue Plattform dar, mit einer engeren Ähnlichkeit mit dem realen, in vivo Gehirn13. Neurosphären sind nicht anhaftende 3D-Cluster von Zellen, die reich an neuronalen Stammzellen (NSCs), neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), Neuronen und Astrozyten sind. Sie sind eine ausgezeichnete Quelle für die Isolierung von neuronalen Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen, die verwendet werden können, um Die Differenzierung in verschiedene neuronale und nicht-neuronale Linien zu untersuchen. Auch hier stellt die Variabilität innerhalb der Neurosphärenkulturen, die mit den zuvor gemeldeten Protokollen erzeugt werden, ein Hindernis für die Formulierung eines einheitlichen Neurosphärenkulturprotokolls14dar.
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll dar, in dem es möglich ist, sowohl 2D- als auch 3D-Plattformen zu erzeugen, indem Zellverdichtungen aus einer gemischten kortikalen und hippocampalen Kultur abwechselnd werden. Es wird beobachtet, dass innerhalb von 7 Tagen frei schwebende Neurosphären aus hochdichten, plattierten Neuronen gewonnen werden, die aus dem E14-E16 Sprague Dawley Ratte Embryo isoliert sind, die nach weiterer Kultur Brücken und Verbindungen durch radiale glialartige Erweiterungen bilden. In ähnlicher Weise wird in den niedrigdichten, plattierten Neuronen eine primäre Neuronenkultur erhalten, die bis zu 30 Tage lang aufrechterhalten werden kann, indem das Pflegemedium zweimal pro Woche gewechselt wird.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

Primäre Neuronenkultur ist eine wesentliche Technik auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Um tiefere mechanistische Einblicke in das Gehirn zu gewinnen, ist es wichtig, ein robustes In-vitro-Modell zu haben, das für verschiedene neurobiologische Studien genutzt werden kann. Obwohl primäre Neuronenkulturen (d.h. langfristige Hippocampuskulturen) Wissenschaftlern Modelle geliefert haben, stellt sie die Komplexität des Gehirnnetzwerks noch nicht vollständig dar. Im Gefolge dieser Einschränkungen ist ein neues Modell entstanden, das Neurosphären verwendet, die eine engere Ähnlichkeit mit dem Gehirngewebe aufweisen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Beschichtung von hohen und niedrigen Dichten gemischter kortikaler und hippocampaler Neuronen, die aus dem Embryo des embryonalen Tages 14-16 Sprague Dawley Ratten isoliert wurden. Dies ermöglicht die Erzeugung von Neurosphären und langfristige primäre Neuronenkultur als zwei unabhängige Plattformen, um weitere Studien durchzuführen. Dieser Prozess ist extrem einfach und kostengünstig, da er mehrere Schritte und Reagenzien minimiert, die bisher als wesentlich für die Neuronenkultur galten. Dies ist ein robustes Protokoll mit minimalen Anforderungen, das mit erreichbaren Ergebnissen durchgeführt und weiter für eine Vielzahl von Studien im Zusammenhang mit Neurowissenschaften verwendet werden kann.

In diesem Protokoll wurde eine einfache Strategie erläutert, bei der variable Zellbeschichtungsdichten von zwei verschiedenen neuronalen Screening-Plattformen erhalten werden. Abbildung 1A,B zeigt die Adhärenz von Zellen nach 4 h Der Beschichtung der Neuronen in hoch- bzw. niedrigdichten plattierten Zellen. Bei Der Beobachtung der korrekten Einhaltung der Neuronen gemäß Abbildung 1wurde das Beschichtungsmediu...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entwicklung von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen zu demonstrieren, die aus Dem E14-E16 Sprague Dawley Rattenembryon isoliert sind, um eine robuste und kostengünstige Plattform für die Untersuchung der Wirkung verschiedener neurotherapeutischer Leads zu bieten. Wie Sie wissen, ist dieses Gehirn ein komplexes Netzwerk von Neuronen mit einer großen Anzahl von unterstützenden Zellen verbunden. Um die Gehirnfunktion zu verstehen, wird oft der größte Teil der Forschung aus In-vitro-Experimenten neu initiiert, die kommerziell erhältliche neuronale Linien abgeleitete Zelllinien beinhalten.Diese Zelllinien sind jedoch transformierte Zelllinien, die unter genottypischen und phäotypischen Variationen leiden. Um dieses Problem anzugehen, ist die primäre Neuronenkultur der geeignete Ansatz. Hier haben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Kultur primärer Neuronen illustriert und eine robuste Screening-Plattform für verschiedene neuronale Therapeutika aufgebaut.Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass wir nur durch modulationsierende Zellbeschichtungsdichten zwei kontrastierende Neuronenkulturplattformen präsentieren können, bei denen niedrige Dichte zu einer längeren primären Neuronenkultur führt und hohe Dichte spontane Neurosphären erzeugt. Nehmen Sie zwei 24-Well-Platten. Eine für hochdichte, eine für die Beschichtung mit geringer Dichte.12 mm sterile Glasabdeckungen in die 24-Well-Platten geben. Gießen Sie 300 Mikroliter PDL-Lösung in jede der Brunnen so, dass sie die Oberfläche des gesamten Deckslip vollständig abdeckt. Bereiten Sie die PDL-Lösung in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor.Wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolien, um eine Trocknung zu verhindern, und bewahren Sie sie über Nacht im CO2-Inkubator auf. Am nächsten Tag, bevor Sie die PDL-Lösung beschichten. Zwei- bis dreimal richtig mit sterilem Wasser waschen.Fügen Sie dann Beschichtungsmedien hinzu, und geben Sie die Platten bis zur Beschichtung an den Inkubator zurück. Opfern Sie eine E14-E16 getimte schwangere Sprague-Dawley Ratte, machen Sie einen V-förmigen Schnitt im Bauchbereich mit sterilen Zangen und einem Paar stumpfe Stirnschere. Entfernen Sie alle Föten und legen Sie sie vorsichtig auf die Petriplatte mit kalter HBSS-Lösung.Nehmen Sie die Embryonen aus den embryonalen Säcken und waschen Sie sie sorgfältig in einer separaten Petrischale in frischen, kalten HBSS. Enthaupten Sie den Kopf mit Hilfe einer sterilen Schere. Die Köpfe in die sterilen 90 mm Petriplatten mit kaltem HBSS übertragen.Halten Sie unter dem Stereomikroskop den Kopf aus dem Schnauchbereich mit den sterilen gezackten Zangen und nehmen Sie das Gehirn heraus, indem Sie die Haut und den Schädel öffnen. Entfernen Sie alle Meningen aus den Hemisphären und dem Mittelhirn, indem Sie den Hirnstamm halten. Entfernen Sie vorsichtig die intakten Hemisphären, die Pilzkappen ähneln, die den Hippocampus und den Kortex enthalten.Sammeln Sie die Hemisphären, die Kortex und intakten Hippocampus enthalten, in einem 15 ml konischen Röhrchen, das 10 ml Dissoziationsmedien enthält. Lassen Sie die gesammelten Gewebe sich absetzen, und saugen Sie das Dissoziationsmedium an, so dass fünf bis zehn Prozent des Mediums darin bleiben. Fügen Sie noch mal 10 ml frisches Dissoziationsmedium hinzu, und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.Fügen Sie 4,5 ml Dissoziationsmedium und 0,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Halten Sie es im Inkubator bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten für die Verdauung zu fortfahren. Das Medium ansaugen und mit 10 ml Dissoziationsmedium und Beschichtungsmedium nacheinander waschen.Setzen Sie sie in 2,5 ml Beschichtungsmedium aus. Halten Sie eine 90 mm sterile Schale über die umgekehrte Abdeckung der Schale und gießen Sie sie in die Basis der 90 mm sterilen Schale. Tittieren Sie das verdaute Gewebe in der Eckbasis der Schale, mit 1000 Mikroliter Pipettenspitze, um das geringste Volumen zu besetzen.Passieren Sie die erhaltene Zellsuspension durch das 70 Mikrometer zellgleiche Sieb, mit Ausnahme von Gewebestücken. Bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen mithilfe des Trypan-Blaufarbstoffausschlusses, und zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem automatisierten Zellzähler. Verdünnen Sie die Anzahl der Zellen, die in einer Weise erhalten wurden, um 1,5 in 10 auf die Leistung von 5 Zellen pro ml für die Beschichtung mit hoher Dichte und 20 000 Zellen pro ml für die Beschichtung mit geringer Dichte in zwei getrennten Rohren mit 30 ml Beschichtungsmedium zu verschichten.Aspirieren Sie das zuvor hinzugefügte Beschichtungsmedium und Platte 500 Mikroliter der Zellen in Beschichtungsmedium in jedem Brunnen dispergiert. Danach kehren Sie die Platten für vier Stunden zum Inkubator zurück. Untersuchen Sie die Zellen vier Stunden nach der Beschichtung unter dem Mikroskop auf Die Haftung.Nach vier Stunden Beschichtung, sowohl in hohen als auch in niedrigen Dichte Platten, zeigen die Neuronen eine gute Haftung an den Platten. Ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 Mikroliter frisches Pflegemedium, und inkubieren Sie es in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Wir müssen diese Neuronen mit hoher und niedriger Dichte bevölkern.Während die niedrigdichten plattierten Neuronen für längere Kulturen verwendet werden können, bis zu 30 Tage, indem das Pflegemedium zweimal pro Woche gewechselt wird, beginnen die hochdichten plattierten Neuronen spontan Neurosphären zu erzeugen, die einen Tag nach dem Erhalt in ultra-niedriger Anbauplatte kamen. Nach 24 Stunden Beschichtung werden sowohl hoch- als auch wenig dichte plattierte Neuronen beobachtet, um eine gesunde Morphologie zu zeigen. Hier wird ein Phasenkontrastbild der plattierten Neuronen mit geringer Dichte dargestellt, das etwa sieben Tage lang kultiviert wurde.Die Neuronen zeigen eine gesunde Morphologie und können mit einem kräftigeren Routing und Verbindungen bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden. Das Balkendiagramm zeigt hier rund 90 Prozent Lebensfähigkeit der niederdichten transplantierten Neuronen auch nach 30 Tagen Kultur, wie der MTT-Assay bestimmt. Die primären Neuronen hier wurden durch Immunfärbung mit Tuj 1, einem Marker von differenzierten Neuronen, und Tau, einem Marker neuronaler Axone, charakterisiert.Die Reinheit der Neuronen wird durch das Fehlen von Färbung in nicht-neuronalen Markern GFAP für Astrozyten und O4 für Oligodendrozyten bestätigt. In allen Charakterisierungsstudien wurden Kerne mit Hoechst 33258 befleckt. Hier wurden die samenarmen Zellen mit dem astrozytischen Marker GFAP und dem neuronalen Marker Tuj 1 befleckt, um die Reinheit der Kultur bis zu sieben Tage zu überprüfen.Es wird beobachtet, dass dieses Protokoll das bevorzugte Wachstum von Neuronen gegenüber Astrozyten unterstützt, wie durch die quantitative Analyse angegeben. Nuclei wurden mit Hoechst 33258 befleckt. In ähnlicher Weise wurden in den hochdichten Samenzellen die Astrozyten mit GFAP und Neuronen von Tuj 1 gefärbt.Hier werden in der quantitativen Analyse rund 17 Prozent Der Astrozyten beobachtet, verglichen mit 83 Prozent Neuronen. Die Kerne sind mit Hoechst 33258 befleckt. Nach sieben Tagen werden spontan mehrere Neurosphären in den hochdichten Neuronen beobachtet.Etwa acht- bis zehnter Tag der Kultur, in den hochdichten, verdichteten Neuronen, beginnen die Neurosphären große Projektionen und Brücken zu bilden, die aus radialen glialartigen Erweiterungen bestehen. Die schwarzen Pfeile zeigen die Brücke zwischen zwei neu gebildeten Neurosphären an. Seit 15 Tagen werden an den Neurosphären Lebend- und Totzellen-Assay durchgeführt.In der dichten Calcein AM Färbung, mit absolut keine Propidium iodid Färbung, zeigt fast 100 Prozent Lebensfähigkeit der Neurosphären in der Kultur. Das Liniendiagramm zeigt hier eine Ausdehnung der Größe der Neurosphären mit dem Durchgang der Anzahl der Tage an. Dieses übermäßig gefärbte Bild der Neurosphäre zeigt eine reiche Population von neuronalen Vorläuferzellen durch erhöhte Expression der NPC-Marker Nestin und Tuj 1.Die Neurosphären hier zeigen hohe Mengen an Astrozyten, die durch die starke Expression von GFAP gekennzeichnet sind, begleitet von einer noch höheren Expression des neuronalen Markers Tuj 1. Die Kerne sind mit Hoechst 33258 befleckt. Daher denke ich, dass unser Protokoll ziemlich spannend und interessant ist, wenn man bedenkt, dass wir aus einer einzigen Strategie zwei Plattformen bekommen können: eine 2-D und eine 3D.Und dies wird eine großartige Plattform für das Screening verschiedener neurotherapeutischer Spuren sein. Also ich denke, es ist wirklich wirklich nützlich für alle Neurowissenschaftler. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass die Neurosphären, für die wir uns entscheiden, extrem reich an neuronalen Vorläuferzellen sind, den NPCs.Und sie können verwendet werden, um sie in Neuronen und nicht-neuronale Linien zu unterscheiden. Also, ich habe das Gefühl, wenn, wirklich, Menschen diese Technik meistern können, indem sie Hilfe aus diesem Video nehmen, wird es wirklich wirklich nützlich für alle sein. Vielen Dank.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Eine Methode der Ganglien nodosum Injection in Sprague-Dawley-Ratte

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...