Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

אנו מודים CSIR-IICB מתקן בעלי חיים. ד. נ. תודה ICMR, J. K. ו-V. G תודה שעון השראה, ו D. M. תודה DBT, הודו עבור המלגות שלהם. ס. ג. באדיבות מודה סרבית (EMR/2015/002230) הודו למתן תמיכה כספית.

כל ההליכים הניסיוניים הכרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים של CSIR-הודי מכון לביולוגיה כימית (IICB/AEC/פגישה/אפריל/2018/1).
1. הכנה מגיב ומדיה
<ol><li>פתרון ליזין-D (PDL): להכין פתרונות PDL בריכוזים של 0.1 mg/mL במים מוכי ובחנות ב 4 ° צ' עד השימוש.</li>
	<li>מדיום דיסוציאצי...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר כיצד על ידי שינוי צפיפויות הציפוי של תאים של נוירונים ראשוניים, שני פלטפורמות עצבי משתנה מתקבלים. למרות זאת היא שיטה פשוטה, כל צעד צריך להתבצע בקפדנות כדי להשיג את התוצאות הרצויות. שיטות קודמות אחרות דיווחו על תרביות נוירונים בטווח הארוך או בתרבויות נוירוספירה. רוב הפרוטו...

המוח הוא מעגל מורכב של תאים עצביים ולא עצביים. במשך שנים, מדענים מנסים. להשיג תובנה במכונות המורכבות האלה כדי לעשות זאת, מדענים נוירו, בתחילה נקטו בקווים שונים של תאי עצב מבוססי העצבים לחקירות. עם זאת, חוסר היכולת של הקווים האלה תא שבטים ליצור קשרים סינפטית חזקים ואקסונים הנכון או דנדטים העבירו עניין מדעי לתרבויות תא העצב העיקרי1,2. ההיבט המרגש ביותר של תרבות תא העצב העיקרי הוא שזה יוצר הזדמנות להתבונן ולתפעל נוירונים חיים3. כמו-כן, היא מורכבת פחות לעומת רקמת העצבים, מה שהופך אותו למועמד אידיאלי לחקר התפקוד וההובלה של חלבונים עצביים שונים. לאחרונה, מספר התפתחויות בתחומים של מיקרוסקופ, גנומיקה, ו פרוטאומניקס יצרו הזדמנויות חדשות עבור נוירומדענים לנצל את תרבויות תא העצב4.
התרבויות הראשיות הרשו לנוירומדענים לחקור את המנגנונים המולקולריים שמאחורי ההתפתחות העצבית, לנתח מסלולים שונים של אותות עצביים, ולפתח הבנה ברורה יותר של synapsis. למרות שמספר שיטות דיווחו על תרבויות מפני הנוירונים הראשוניים (בעיקר ממקור ההיפוקמאל5,6,7), פרוטוקול אחיד עם מדיום מוגדר כימית המאפשר תרבות ארוכת טווח של נוירונים הוא עדיין צריכים עם זאת, נוירונים מצופה בצפיפות נמוכה מתבוננים בדרך כלל, אשר לא לשרוד לטווח ארוך, כנראה בשל חוסר תמיכה הזנה8 כי הוא סיפק את הנוירונים הסמוכים תאים גליה. שיטות מסוימות אפילו הציע co-culturing של הנוירונים העיקריים עם תאים גליה, שבו התאים גליה משמשים כשכבת ממזין9. עם זאת, תאים גליה להוות הרבה בעיות עקב צמיחת יתר שלהם, אשר לפעמים לעקוף את הצמיחה עצבי10. מכאן, בהתחשב בבעיות לעיל, חובה פשוטה וחסכונית יותר הפרוטוקול העיקרי התרבות העצבית נדרשת, אשר ניתן להשתמש הן נוירוביולוגים והן נוירוכימאים לחקירות.
תרבות תא העצב העיקרית היא למעשה צורה של תרבות דו-ממדית ואינה מייצגת את הפלסטיות, השלמות המרחבית, או הטרוגניות של המוח. זה נתן את הצורך במודל תלת-ממד אמין יותר בשם נוירוספירות11,12. נוירוספירות להציג פלטפורמה רומן מדענים נוירו, עם דמיון קרוב יותר למציאות, במוח vivo13. נוירוספירות הם לא מחסיד אשכולות תלת-ממד של תאים עשירים בתאי גזע עצביים (NSCs), בתאי מחולל קדמון (NPCs), נוירונים, ו astrocytes. הם מקור מצוין עבור בידוד של תאי גזע עצביים ותאים מחולל קדמון, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד בידול לתוך שונים עצביים ושאינם עצביים. שוב, השונות בתוך תרבויות נוירוספירה המיוצר באמצעות הפרוטוקולים שדווחו קודם לכן מציג מחסום לניסוח של פרוטוקול נוירוספירה מאוחדת התרבות14.
כתב יד זה מציג פרוטוקול שבו ניתן ליצור הן 2D ו-3D פלטפורמות על ידי הציפוי תאים מתחלפים משולב של קליפת המוח מעורב היפוקמאל. הוא ציין כי בתוך 7 ימים חופשי-צפה נוירוספירות מתקבלים מפני נוירונים בצפיפות גבוהה מצופה מבודדים מ-E14-E16 ספראג העובר עכברוש דטרלי, אשר על תרבות נוספת, גשרים טופס והתקשרויות באמצעות הרחבות מדומה glial-. באופן דומה, בצפיפות נמוכה מצופה נוירונים, תרבות תא העצב העיקרי שניתן לשמור עד 30 ימים מושגת על ידי שינוי המדיום תחזוקה פעמיים בשבוע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

תרבות תא העצב העיקרי היא טכניקה חיונית בתחום המוח. כדי לזכות בתובנות מכניסטיות עמוקות יותר במוח, חיוני להיות בעלי מודל מתורבת שניתן לנצל למחקרים שונים בנוירוביולוגיה. למרות התרבויות הראשיות של תא העצב (כלומר, לטווח ארוך בתרבויות ההיפוקמפוס) סיפקו מדענים עם דגמים, הוא עדיין לא מייצג את המורכבות של רשת המוח לחלוטין. בעקבות מגבלות אלה, מודל חדש התפתחה באמצעות נוירוספירות, אשר נושא דמיון קרוב יותר לרקמת המוח. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ציפוי של צפיפות גבוהה ונמוכה של קליפת המוח המעורב ואת הנוירונים היפוקמאל מבודדים מן העובר של היום העובריים 14-16 החולדות של הג דאוד. זה מאפשר את הדור של נוירוספירות ותרבות תא העצב העיקרי לטווח ארוך כמו שתי פלטפורמות עצמאיות לבצע מחקרים נוספים. תהליך זה הוא פשוט מאוד חסכוני, כפי שהוא ממזער מספר שלבים וריאגנטים שנחשבו בעבר חיוני לתרבות העצב. זהו פרוטוקול יציב עם דרישות מינימליות שניתן לבצע עם תוצאות השגה ושימוש נוסף עבור מגוון של מחקרים הקשורים למדעי המוח.

בפרוטוקול זה הובהר אסטרטגיה פשוטה שבה מתקבלים צפיפות תאים משתנה משתי פלטפורמות שונות של הקרנה עצבית. איור 1A,B ממחיש את הדבקות של תאים לאחר 4 h של ציפוי הנוירונים בתאים גבוהים ומצופים צפיפות נמוכה, בהתאמה. על התבוננות נכונה של הנוירונים כפי שמוצג <st...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את התפתחותם של נוירוספרות מתאי עצב מעורבים בהיפוקמפוס ראשי וקליפת המוח המבודדים מעובר עכברוש E14-E16 Sprague Dawley, על מנת להציע פלטפורמה חזקה וזולה לחקר ההשפעה של מוביל נוירותרפיסטיים שונים. כפי שאתה יודע, המוח הזה הוא רשת מורכבת של נוירונים הקשורים למספר גדול של תאים תומכים. כדי להבין את תפקוד המוח, לעתים קרובות רוב המחקר הוא מחדש יזם מניסויים במבחנה, אשר כרוך מסחרי זמין שושלת עצבית נגזר קווי תאים.עם זאת, קווי תא זה הם קווי תאים משתנים הסובלים וריאציות גנוטיפיות פנוטיפיות. כדי לטפל בבעיות אלה, תרבות הנוירונים העיקרית היא הגישה המתאימה. כאן, המחישנו פרוטוקול פשוט וחסכוני לתרבות נוירונים ראשוניים ובנינו פלטפורמת סינון חזקה לטיפולים עצביים שונים.היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שרק על ידי אפנון צפיפות ציפוי התא, אנו יכולים להציג שתי פלטפורמות תרבות נוירונים מנוגדות שבהן צפיפות נמוכה מובילה לתרבות נוירונים ראשונית ממושכת, וצפיפות גבוהה מייצרת נוירוספרות ספונטניות. קח שתי צלחות 24 בארות. אחד לצפיפות גבוהה, ועוד עבור ציפוי בצפיפות נמוכה.מעבירים 12 מ"מ של כיסויי זכוכית סטרילית בצלחות 24 בארות. יוצקים 300 microliters של פתרון PDL בכל אחת מה בארות באופן שהוא מכסה באופן מלא את פני השטח של כיסוי כולו. הכן פתרון PDL בריכוז של 0.1 מ"ג /מ"ל במים deionized.עוטפים את הצלחות בנייר אלומיניום למניעת ייבוש, ולשמור אותו באינקובטור CO2 למשך הלילה. למחרת, לפני הציפוי, שאפו את פתרון ה-PDL. לשטוף כראוי עם מים סטריליים במשך פעמיים עד שלוש פעמים.לאחר מכן מוסיפים ציפוי מדיה, ומחזירים את הצלחות לאנקובטור עד ציפוי. להקריב E14-E16 מתוזמן בהריון Sprague-Dawley עכברוש, לעשות חתך בצורת V באזור הבטן באמצעות מטחנים סטריליים וזוג מספריים קהה סוף. הסר את כל העוברים בזהירות למקם אותם על צלחת פטרי עם פתרון HBSS קר.מוציאים את העוברים מהסקים העובריים ושוטפים אותם בזהירות בצלחת פטרי נפרדת ב- HBSS טרי וקר. לערוף את הראש בעזרת מספריים סטריליים. מעבירים את הראשים בצלחות פטרי סטריליות 90 מ"מ עם HBSS קר.מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, החזק את הראש מאזור האף עם המדפים הסטריליים משונן, והסר את המוח על ידי חיתוך העור והגולגולת פתוחים. הסר את כל קרום המוח מההמיספרות ואת עמוד האמצע על ידי החזקת גזע המוח. בזהירות להסיר את ההמיספרות שלמות, דומה כובעי פטריות המכיל את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח.לאסוף את ההמיספרות המכילות קליפת המוח והיפוקמפוס שלם בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיה דיסוציאציה. אפשר לרקמות שנאספו להתיישב, ושוכך את מדיום הדיסוציאציה, והשאיר בו חמישה עד עשרה אחוזים מהמדיום. שוב, להוסיף 10 מ"ל של מדיום דיסוציאציה טרי אליו, ולחזור על שלב זה פעמיים.הוסף 4.5 מ"ל של דיסוציאציה בינונית ו- 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA. שמור אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לעיכול להמשיך. שאפו את המדיום ושטפו עם 10 מ"ל של דיסוציאציה בינונית וציפוי בינוני, ברציפות.תן להם 2.5 מ"ל של ציפוי בינוני. שומרים צלחת סטרילית 90 מ"מ מעל הכיסוי ההפוך של המנה ויוצקים אותה בבסיס של צלחת סטרילית 90 מ"מ. titrate את הרקמות מתעכל בבסיס הפינתי של המנה, באמצעות 1000 טיפ פיפטה microliter, כדי לתפוס את הנפח לפחות.להעביר את ההשעיה התא המתקבלת דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, למעט כל גושים של רקמה. קבע את הצפיפות של תאים בני קיימא באמצעות אי-הכללת צבע כחול trypan, וספיר את מספר התאים ב מונה תאים אוטומטי. לדלל את מספר התאים המתקבלים באופן כדי צלחת 1.5 לתוך 10 לעוצמה של 5 תאים לכל מ"ל עבור ציפוי בצפיפות גבוהה, ו 20, 000 תאים לכל mL עבור ציפוי בצפיפות נמוכה בשני צינורות נפרדים המכילים 30 מ"ל של ציפוי בינוני.שאפו את הציפוי שנוסף בעבר בינוני וצלחת 500 מיקרוליטרים של תאים מפוזרים במדיום ציפוי בכל באר. לאחר מכן, להחזיר את הצלחות לאנקובטור במשך ארבע שעות. ארבע שעות לאחר ציפוי, לבדוק את התאים לדבקות מתחת למיקרוסקופ.לאחר ארבע שעות של ציפוי, הן בצלחות בצפיפות גבוהה והן בצפיפות נמוכה, הנוירונים מראים דבקות טובה בצלחות. החלף את המדיום בכל באר ב-500 מיקרוליטרים של מדיום תחזוקה טרי, והמדגר אותו באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. אנחנו צריכים לתרבת את הנוירונים האלה מצופים בצפיפות גבוהה ונמוכה.בעוד הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יכולים לשמש לתרבויות ממושכות, עד 30 יום, על ידי שינוי מדיום התחזוקה פעמיים בשבוע, הנוירונים מצופים בצפיפות גבוהה מתחילים ליצור באופן ספונטני נוירוספרות, אשר הגיע יום לאחר ששמרנו על לוחית התקשרות אולטרה נמוכה. לאחר 24 שעות של ציפוי, הן נוירונים מצופים בצפיפות גבוהה ונמוכה נצפו כדי להציג מורפולוגיה בריאה. תמונת ניגודיות פאזה של נוירונים מצופים בצפיפות נמוכה, מתורבתים במשך כשבעה ימים, מוצגת כאן.הנוירונים מציגים מורפולוגיה בריאה, ו ניתן לשמור אותם עד 30 יום עם ניתוב וחיבורים נמרצים יותר. תרשים הבר כאן מראה סביב 90 אחוז הכדאיות של נוירונים מצופים בצפיפות נמוכה גם לאחר 30 ימים של תרבות, כפי שנקבע על ידי המשגיח MTT. הנוירונים העיקריים כאן התאפיינו בכשל חיסוני עם Tuj 1, סמן של נוירונים מובחנים, וטאו, סמן של אקסונים עצביים.הטוהר של הנוירונים מאושר על ידי היעדר כתמים סמנים שאינם עצביים GFAP עבור אסטרוציטים ו O4 עבור oligodendrocytes. בכל מחקרי האפיון, הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. כאן, תאים זרעים בצפיפות נמוכה כבר מוכתמים עם סמן אסטרוציטי GFAP ו סמן עצבי Tuj 1 כדי לבדוק את טוהר התרבות עד שבעה ימים.הוא ציין כי פרוטוקול זה תומך בצמיחה המועדפת של נוירונים על פני אסטרוציטים כפי שצוין באמצעות ניתוח כמותי. הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. באופן דומה, בתאי הזרעים בצפיפות גבוהה, האסטרוציטים כבר מוכתמים GFAP ותאי עצב על ידי Tuj 1.כאן, בניתוח כמותי, סביב 17 אחוז אסטרוציטים נצפו לעומת 83 אחוז נוירונים. הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. לאחר שבעה ימים, נוצר באופן ספונטני נוירוספרות מרובות נוירונים בצפיפות גבוהה נצפו.בסביבות היום השמיני עד העשירי של התרבות, בנוירונים מצופים בצפיפות גבוהה, הנוירוספרות מתחילות ליצור תחזיות וגשרים גדולים המורכבים מהרחבות רדיאליות דמויי גליה. החצים השחורים מצביעים על הגשר בין שני נוירוספרות שזה עתה נוצרו. בדיקה של תאים חיים ומתים בוצעה על הנוירוספרות במשך 15 יום.בכתמי Calcein AM צפופים, ללא כתמי יודיד פרופידיום לחלוטין, מציין כמעט 100 אחוז כדאיות של הנוירוספרות בתרבות. גרף הקו כאן מצביע על התרחבות בגודל של הנוירוספרות עם המעבר של מספר הימים. תמונה מוכתמת יתר על מדי של נוירוספרה מצביעה על אוכלוסייה עשירה של תאי גוף עצביים באמצעות ביטוי מוגבר של סמני NPC נסטין ו Tuj 1.הנוירוספרות כאן מראות כמויות גבוהות של אסטרוציטים המסומנים על ידי הביטוי החזק של GFAP, מלווה בביטוי גבוה עוד יותר של סמן עצבי Tuj 1. הגרעינים הוכתמים בהויכסט 33258. אז אני חושב שהפרוטוקול שלנו הוא די מרגש ומעניין, בהתחשב בעובדה כי מתוך אסטרטגיה אחת אנו מסוגלים לקבל שתי פלטפורמות: אחד 2-D ואחד 3-D.וזו תהיה פלטפורמה נהדרת להקרנת מסלולים נוירותרפיים שונים. אז אני מניחה שזה ממש מועיל לכל חוקרי המוח. היבט חשוב נוסף הוא שהנוירוספרות שאנו בוחרים בה עשירות מאוד בתאי ניוון עצביים, ה- NPCs.והם יכולים לשמש כדי להבדיל אותם לתוך נוירונים ושושלת לא עצבית. אז, אני מרגיש שאם, באמת, אנשים יכולים לשלוט בטכניקה זו על ידי לקיחת עזרה מהסרטון הזה, זה יהיה באמת באמת שימושי לכולם. תודה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

שיטה של ​​הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...