Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Ringraziamo l'impianto per animali CSIR-IICB. G. D. ringrazia ICMR, J. K. e V. G. ringraziano DST Inspire, e D. M. ringrazia NOT, India per le loro borse di studio. S. G. riconosce gentilmente seRB (EMR/2015/002230) India per fornire sostegno finanziario.

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono animali sono state approvate dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali del CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1. Preparazione del reagente e dei supporti
<ol><li>Soluzione polid-lysina (PDL): preparare soluzioni PDL a concentrazioni di 0,1 mg/mL in acqua deionizzata e conservare in 4 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	<li>Mezzo di dissociazione: A 1 L di acqua sterile, filtrata deionizzata, combinare...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Questo protocollo descrive che come alterando la densità di placcatura cellulare dei neuroni primari, si ottengono due piattaforme neuronali variabili. Anche se questo è un metodo semplice, ogni passo deve essere eseguita meticolosamente per ottenere i risultati desiderati. Altri metodi precedenti hanno segnalato colture di neuroni primari a lungo termine o culture della neurosfera. La maggior parte dei protocolli di coltura neuronale primaria hanno coinvolto la coltura dei neuroni ippocampali per 3-5 settimane, ma la ...

Il cervello è un intricato circuito delle cellule neuronali e non neuronali. Per anni, gli scienziati hanno cercato di ottenere informazioni su questo complesso meccanismo. Per farlo, i neuroscienziati inizialmente hanno fatto ricorso a varie linee cellulari basate sui nervi trasformate per le indagini. Tuttavia, l'incapacità di queste linee cellulari clonali di formare forti connessioni sinaptiche e assoni o dendriti adeguati ha spostato l'interesse scientifico alle colture neuronali primarie1,2. L'aspetto più eccitante della cultura neuronale primaria è che crea l'opportunità di osservare e manipolare i neuroni viventi3. Inoltre, è meno complesso rispetto al tessuto neurale, che lo rende un candidato ideale per studiare la funzione e il trasporto di varie proteine neuronali. Recentemente, diversi sviluppi nei campi della microscopia, genomica e proteomica hanno generato nuove opportunità per i neuroscienziati di sfruttare le colture neuronali4.
Le culture primarie hanno permesso ai neuroscienziati di esplorare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo neurale, analizzare vari percorsi di segnalazione neurale e sviluppare una comprensione più coerente della sinapsi. Anche se un certo numero di metodi hanno segnalato colture da neuroni primari (per lo più dall'origine ippocampale5,6,7), un protocollo unificato con un mezzo definito chimicamente che consente la coltura a lungo termine dei neuroni è ancora necessario. Tuttavia, neuroni placcati a bassa densità sono più spesso osservati, che non sopravvivono a lungo termine, probabilmente a causa della mancanza di supporto trofico8 che è fornito dai neuroni adiacenti e cellule gliali. Alcuni metodi hanno anche suggerito la cocoltura dei neuroni primari con cellule gliali, in cui le cellule gliali vengono utilizzate come strato di alimentazione9. Tuttavia, le cellule gliali pongono un sacco di problemi a causa della loro crescita eccessiva, che a volte sostituiscono la crescita neuronale10. Quindi, considerando i problemi di cui sopra, è necessario un protocollo di coltura neurale primaria più semplice e più conveniente, che può essere utilizzato sia dai neurobiologi che dai neurochimici per le indagini.
Una cultura neuronale primaria è essenzialmente una forma di cultura 2D e non rappresenta la plasticità, l'integrità spaziale o l'eterogeneità del cervello. Questo ha dato origine alla necessità di un modello 3D più credibile chiamato neurosfere11,12. Le neurosfere presentano una nuova piattaforma per i neuroscienziati, con una somiglianza più stretta con il vero cervello in vivo13. Le neurosfere sono cluster 3D non aderenti di cellule ricche di cellule staminali neurali (NSC), cellule progenitrici neurali (NPC), neuroni e astrociti. Sono un'ottima fonte per l'isolamento delle cellule staminali neurali e delle cellule progenitrici neurali, che possono essere utilizzate per studiare la differenziazione in varie linee neuronali e non neuronali. Ancora una volta, la variabilità all'interno delle culture della neurosfera prodotte utilizzando i protocolli precedentemente riportati presenta una barriera alla formulazione di un protocollo di coltura della neurosfera unificata14.
Questo manoscritto presenta un protocollo in cui è possibile generare piattaforme 2D e 3D alternando densità di placcatura cellulare da una coltura misa corticale e ippocampale. Si osserva che entro 7 giorni le neurosfere fluttuanti sono ottenute da neuroni placcati ad alta densità isolati dall'embrione di ratto E14-E16 Sprague Dawley, che su ulteriore cultura, formano ponti e interconnessioni attraverso estensioni radiali simili agli gliali. Allo stesso modo, nei neuroni placcati a bassa densità, una coltura neuronale primaria che può essere mantenuta fino a 30 giorni si ottiene cambiando il mezzo di manutenzione due volte alla settimana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

La cultura primaria dei neuroni è una tecnica essenziale nel campo delle neuroscienze. Per ottenere approfondimenti meccanicistici nel cervello, è essenziale avere un robusto modello in vitro che può essere sfruttato per vari studi di neurobiologia. Anche se le colture neuronali primarie (cioè le colture ippocampali a lungo termine) hanno fornito agli scienziati modelli, non rappresentano ancora completamente la complessità della rete cerebrale. Sulla scia di queste limitazioni, è emerso un nuovo modello usando le neurosfere, che assomiglia più in sé al tessuto cerebrale. Il presente protocollo descrive la placcatura di densità alte e basse di neuroni corticali e ippocampali misti isolati dall'embrione dei ratti Sprague Dawley del giorno embrionale 14-16. Questo permette per la generazione di neurosfere e la cultura dei neuroni primari a lungo termine come due piattaforme indipendenti per condurre ulteriori studi. Questo processo è estremamente semplice e conveniente, in quanto riduce al minimo diversi passaggi e reagenti precedentemente ritenuti essenziali per la coltura dei neuroni. Questo è un protocollo robusto con requisiti minimi che possono essere eseguiti con risultati raggiungibili e ulteriormente utilizzati per una varietà di studi relativi alle neuroscienze.

In questo protocollo, è stata chiarita una semplice strategia in cui si ottengono densità di placcatura a cellule variabili da due diverse piattaforme di screening neurale. La figura 1A,B illustra l'aderenza delle cellule dopo 4 h di placcatura dei neuroni in cellule placcate ad alta e bassa densità, rispettivamente. Osservando la corretta aderenza dei neuroni, come mostrato nella Figura1, il mezzo di placcatu...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare lo sviluppo di neurosfere da neuroni ippocampali e corticali primari misti isolati dall'embrione di ratto E14-E16 Sprague Dawley, al fine di offrire una piattaforma robusta e a basso costo per studiare l'effetto di vari cavi neuroterapici. Come sapete, quel cervello è una complessa rete di neuroni associati a un gran numero di cellule di supporto. Per comprendere la funzione cerebrale, spesso la maggior parte della ricerca viene riavvolta da esperimenti in vitro, che coinvolgono linee cellulari derivate dal lignaggio neurale disponibili in commercio.Tuttavia, queste linee cellulari sono linee cellulari trasformate che soffrono di variazioni genotipiche e fenotipiche. Per affrontare questi problemi, la cultura primaria dei neuroni è l'approccio adatto. Qui, abbiamo illustrato un protocollo semplice ed economico per la cultura dei neuroni primari e costruito una solida piattaforma di screening per varie terapie neurali.Il vantaggio principale di questo protocollo è che semplicemente modulando le densità di placcatura cellulare, possiamo mostrare due piattaforme di coltura neuronale contrastanti in cui la bassa densità porta a una prolungata coltura primaria dei neuroni, e l'alta densità genera neurosfere spontanee. Prendi due piatti da 24 pozzi. Uno per l'alta densità e l'altro per la placcatura a bassa densità.Trasferire 12 mm di coverlips in vetro sterile nelle piastre da 24 pozzi. Versare 300 microlitri di soluzione PDL in ciascuno dei pozzi in modo che copra completamente la superficie dell'intero coverslip. Preparare la soluzione PDL ad una concentrazione di 0,1 mg/mL in acqua deionizzata.Avvolgere le piastre con fogli di alluminio per evitare l'asciugatura e tenerlo nell'incubatore di CO2 durante la notte. Il giorno dopo, prima della placcatura, aspirare la soluzione PDL. Lavare correttamente con acqua sterile per due o tre volte.Quindi aggiungere i supporti di placcatura e riportare le piastre all'incubatrice fino alla placcatura. Sacrifica un topo Sprague-Dawley incinta a tempo E14-E16, fai un taglio a forma di V nella zona addominale usando forcep sterili e un paio di forbici contundenti. Rimuovere tutti i feti e posizionarli con cura sulla piastra di petri con soluzione HBSS fredda.Eseminare gli embrioni dalle sacche embrionali e lavarli accuratamente in una piastra di Petri separata in HBSS fresco e freddo. Decapitare la testa con l'aiuto di forbici sterili. Trasferire le teste nelle piastre di petri sterili da 90 mm con HBSS freddo.Al microscopio stereo, tenere la testa dalla regione del muso con le forcep seghettate sterili e eserti il cervello tagliando la pelle e il cranio aperti. Rimuovere tutte le meningi dagli emisferi e dal cervello intermedio tenendo il tronco encefalico. Rimuovere con cura gli emisferi intatti, simili a tappi di funghi che contengono l'ippocampo e la corteccia.Raccogliere gli emisferi contenenti corteccia e ippocampo intatto in un tubo conico da 15 ml contenente 10 ml di mezzi di dissociazione. Permettere ai tessuti raccolti di depositarsi e aspirare il mezzo di dissociazione, lasciando in esso dal 5 al 10% del mezzo. Ancora una volta, aggiungere 10 mL di mezzo di dissociazione fresco e ripetere questo passaggio due volte.Aggiungere 4,5 mL di mezzo di dissociazione e 0,5 mL di soluzione di tripina-EDTA. Tienilo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 20 minuti affinché la digestione proceda. Aspirare il mezzo e lavare con 10 mL di mezzo di dissociazione e mezzo di placcatura, consecutivamente.Resuspend loro in 2,5 mL di mezzo di placcatura. Conservare un piatto sterile da 90 mm sul coperchio invertito del piatto e versarlo nella base di un piatto sterile da 90 mm. Titolare i tessuti digeriti nella base d'angolo del piatto, utilizzando la punta della pipetta da 1000 microlitri, in modo da occupare il minor volume.Passare la sospensione cellulare ottenuta attraverso il filtro cellulare da 70 micrometri, esclusi eventuali pezzi di tessuto. Determinare la densità delle celle vitali utilizzando l'esclusione del colorante blu trypan e contare il numero di celle in un contatore di celle automatizzato. Diluire il numero di cellule ottenute in modo da 1,5 a 10 alla potenza di 5 celle per ml per la placcatura ad alta densità e di 20.000 celle per ml per la placcatura a bassa densità in due tubi separati contenenti 30 ml di mezzo di placcatura.Aspirare il mezzo di placcatura precedentemente aggiunto e la piastra 500 microlitri di cellule disperse in mezzo di placcatura in ogni pozzo. Successivamente, riportare le piastre nell'incubatrice per quattro ore. Quattro ore dopo la placcatura, esaminare le cellule per l'aderenza al microscopio.Dopo quattro ore di placcatura, sia nelle placche ad alta che in bassa densità, i neuroni mostrano una buona aderenza alle placche. Sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di manutenzione fresco e incubarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dobbiamo colturare questi neuroni placcati ad alta e bassa densità.Mentre i neuroni placcati a bassa densità possono essere utilizzati per colture prolungate, fino a 30 giorni, cambiando il mezzo di manutenzione due volte a settimana, i neuroni placcati ad alta densità iniziano a generare spontaneamente neurosfere, che sono arrivate il giorno dopo che abbiamo mantenuto in una piastra di attacco ultra-bassa. Dopo 24 ore di placcatura, si osservano sia neuroni placcati ad alta che a bassa densità per mostrare una morfologia sana. Qui viene visualizzata un'immagine a contrasto di fase dei neuroni placcati a bassa densità, coltivati per circa sette giorni.I neuroni mostrano una morfologia sana e possono essere mantenuti fino a 30 giorni con instradamenti e interconnessioni più vigorosi. Il diagramma a barre mostra circa il 90% di vitalità dei neuroni placcati a bassa densità anche dopo 30 giorni di coltura, come determinato dal saggio MTT. I neuroni primari qui sono stati caratterizzati dall'immunostaining con Tuj 1, un marcatore di neuroni differenziati, e tau, un marcatore di assoni neuronali.La purezza dei neuroni è confermata dall'assenza di colorazione nei marcatori non neuronali GFAP per gli astrociti e O4 per gli oligodendrociti. In tutti gli studi di caratterizzazione, i nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Qui, le cellule sementi a bassa densità sono state macchiate con marcatore astrocitico GFAP e marcatore neuronale Tuj 1 per controllare la purezza della coltura fino a sette giorni.Si osserva che questo protocollo supporta la crescita preferenziale dei neuroni rispetto agli astrociti come indicato attraverso l'analisi quantitativa. I nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Allo stesso modo, nelle cellule sementi ad alta densità, gli astrociti sono stati macchiati con GFAP e neuroni da Tuj 1.Qui, nell'analisi quantitativa, si osservano circa il 17% di astrociti rispetto all'83% dei neuroni. I nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Dopo sette giorni, si osservano neurosfere multiple formate spontaneamente nei neuroni ad alta densità.Intorno all'ottavo-decimo giorno di coltura, nei neuroni placcati ad alta densità, le neurosfere iniziano a formare grandi proiezioni e ponti costituiti da estensioni radiali simili a gliali. Le frecce nere indicano il ponte tra due nevrosfere di nuova formazione. Il test delle cellule vive e morte è stato eseguito sulle neurosfere per 15 giorni.Nella colorazione densa di Calcein AM, senza alcuna colorazione di ioduro propidio, indica quasi il 100% di vitalità delle neurosfere in coltura. Il grafico a linee qui indica un'espansione delle dimensioni delle neurosfere con il passare del numero di giorni. Questa immagine esentemente macchiata della neurosfera indica una ricca popolazione di cellule progenitrici neurali attraverso una maggiore espressione dei marcatori NPC Nestin e Tuj 1.Le neurosfere qui mostrano elevate quantità di astrociti segnati dalla forte espressione di GFAP, accompagnati da un'espressione ancora più alta del marcatore neuronale Tuj 1. I nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Quindi penso che il nostro protocollo sia piuttosto eccitante e interessante, considerando il fatto che da una singola strategia siamo in grado di ottenere due piattaforme: una 2D e una 3D.E questa sarà un'ottima piattaforma per lo screening di diverse tracce neuroterapeutiche. Quindi credo che sia davvero utile a tutti i neuroscienziati. Un altro aspetto importante è che le neurosfere in cui optiamo sono estremamente ricche di cellule progenitrici neurali, i PNG.E possono essere usati per differenziarli in neuroni e lignaggi non neuronali. Quindi, sento che se, davvero, le persone possono padroneggiare questa tecnica prendendo aiuto da questo video, sarà davvero utile per tutti. Grazie.

Research

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