Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

CSIR-IICB動物施設に感謝します。G. D. 感謝 ICMR, J. K. と V. G. DST インスパイアに感謝し、D. M. 彼らのフェローシップのために DBT に感謝します。S.G.は、インドのSERB(EMR/2015/002230)が財政支援を行った場合に認める。

動物に関するすべての実験手順は、CSIR-インド化学生物学研究所の機関動物倫理委員会(IICB/AEC/ミーティング/2018/1)によって承認されました。
1. 試薬およびメディアの準備
<ol><li>ポリD-リジン(PDL)溶液:脱イオン水中で0.1mg/mLの濃度でPDL溶液を調製し、使用するまで4°Cに保存します。</li>
	<li>解離培地:無菌、濾過脱イオン水の1Lに、塩化ナトリウム(8mg/mL)、塩化カリウム(0.4mg/...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

このプロトコルは、一次ニューロンの細胞めっき密度を変化させ、2つの可変ニューロンプラットフォームが得られる方法を説明する。これは簡単な方法ですが、目的の結果を得るには、各ステップを細心の注意を払って実行する必要があります。他の以前の方法は、長期の一次ニューロン培養または神経球培養を報告しています。.ほとんどの一次ニューロン培養プロトコルは、3〜5週間海馬...

脳は、神経細胞と非神経細胞の複雑な回路です。何年もの間、科学者たちはこの複雑な機械に関する洞察を得ようとしてきた。そのために、神経科学者は当初、調査のために様々な形質転換神経系細胞株に頼った。しかし、これらのクローン細胞株が強いシナプス結合および適切な軸線またはデンドライトを形成できないことは、科学的関心を一次ニューロン培養1、2にシフトさせた。一次ニューロン培養の最もエキサイティングな側面は、生きているニューロン3を観察し、操作する機会を作り出すことです。また、神経組織に比べて複雑性が低いため、様々な神経タンパク質の機能や輸送を研究するのに理想的な候補です。近年、顕微鏡、ゲノミクス、プロテオミクスの分野でいくつかの発展が起きており、神経科学者がニューロン培養を利用する新たな機会を生み出しています4。
一次培養により、神経科学者は神経発達の背後にある分子機構を探索し、様々な神経シグナル伝達経路を解析し、シナプスのより一貫した理解を開発することができました。多くの方法が一次ニューロン(主に海馬起源5、6、7から)からの培養を報告しているが、ニューロンの長期培養を可能にする化学的に定義された媒体を持つ統一プロトコルは、まだ必要です。しかし、低密度でめっきされたニューロンは、最も頻繁に観察され、これは長期的に生き残るものではなく、隣接するニューロンおよびグリア細胞によって提供される栄養支持体8の欠如に起因する可能性が高い。いくつかの方法は、グリア細胞とグリア細胞との一次ニューロンの共培養を示唆しています, ここでグリア細胞は、フィーダー層9として使用されています.しかし、グリア細胞は過剰増殖に起因する多くの問題を提起し、時には神経成長10を上書きする。したがって、上記の問題を考慮すると、より簡単で費用対効果の高い一次神経培養プロトコルが必要であり、これは神経生物学者と神経化学者の両方が調査に使用することができる。
一次ニューロン培養は本質的に2D培養の一形態であり、脳の可塑性、空間的完全性、または不均一性を表すものではありません。これは、神経球11、12と呼ばれるより信じられる3Dモデルの必要性を生み出しました。神経球は、生体内脳13において、実際に類似した新しいプラットフォームを神経科学者に提示する。神経球は、神経幹細胞(NSC)、神経前駆細胞(NPC)、ニューロン、および星状細胞が豊富な細胞の非付着性3Dクラスターです。それらは神経幹細胞および神経前駆細胞の単離のための優秀な源であり、様々な神経系および非神経系統への分化を研究するために使用することができる。繰り返しになりますが、以前に報告されたプロトコルを用いて産生される神経球培養内の変動性は、統一された神経球培養プロトコル14の定式化に対する障壁を提示する。
この原稿は、混合皮質および海馬培養から細胞めっき密度を交互にすることによって、2Dおよび3Dプラットフォームの両方を生成することができるプロトコルを提示する。自由浮遊神経球は、E14-E16スプラーグドーリーラット胚から単離された高密度めっきニューロンから7日以内に得られ、さらなる培養時に、放射状グリア状の拡張を介してブリッジと相互接続を形成する。同様に、低密度めっきニューロンでは、週2回維持培地を変更して最大30日間維持できる一次ニューロン培養が得られる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

一次ニューロン培養は神経科学の分野で不可欠な技術です。脳に深い機械的洞察を得るためには、様々な神経生物学の研究に利用できる堅牢なインビトロモデルを持つことが不可欠です。一次ニューロン培養(すなわち、長期的な海馬培養)は、科学者にモデルを提供してきましたが、脳ネットワークの複雑さを完全に表しているわけではありません。これらの制限をきっかけに、脳組織に近い神経球を用いた新しいモデルが出現した。本プロトコルは、胚の胚から分離された皮質ニューロンと海馬ニューロンの高密度および低密度のめっきを記述する14-16スプラーグドーリーラットである。これにより、神経圏および長期の一次ニューロン培養の生成を2つの独立したプラットフォームとして、さらなる研究を行うことが可能となる。このプロセスは、ニューロン培養に不可欠と考えられていたいくつかのステップと試薬を最小限に抑えるため、非常にシンプルで費用対効果が高い。これは達成可能な結果で行うことができ、さらに神経科学に関連する研究の多様性のために使用することができる最小限の要件で堅牢なプロトコルです。

このプロトコルでは、2つの異なる神経スクリーニングプラットフォームから可変細胞めっき密度が得られるという簡単な戦略が解明されている。図1Aは、Bがそれぞれ高密度及び低密度メッキ細胞におけるニューロンをめっきした4時間後の細胞の付着を示す。図1に示すようにニューロンの適切な付着を観察す?...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

ここに提示されるのは、高密度めっきニューロンから神経前駆細胞に濃縮された神経球の自発的生成のためのプロトコルである。同じ実験の間に、ニューロンが低密度でめっきされるとき、プロトコルはまた、長期の一次ラットニューロン培養をもたらす。

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

この手順の全体的な目標は、E14-E16スプレイグドーレーラット胚から分離された混合一次海馬および皮質ニューロンからの神経球の発達を実証し、様々な神経治療リードの効果を研究するための堅牢で低コストのプラットフォームを提供することです。ご存知のように、その脳は多数の支持細胞に関連するニューロンの複雑なネットワークです。脳機能を理解するために、多くの場合、研究のほとんどは、市販の神経系統由来細胞株を含むin vitro実験から再開始されます。しかし、この細胞株は、遺伝子質および形質変化に苦しむ形質転換細胞株である。この問題に対処するために、一次ニューロン培養が適切なアプローチである。ここでは、一次ニューロンを培養するためのシンプルで費用対効果の高いプロトコルを示し、様々な神経治療のための堅牢なスクリーニングプラットフォームを構築した。このプロトコルの主な利点は、細胞めっき密度を調節するだけで、低密度が一次ニューロン培養を長引き、高密度が自発的な神経球を生成する2つの対照的なニューロン培養プラットフォームを紹介できることです。24ウェルプレートを2枚取ります。1つは高密度、もう1つは低密度めっき用です。24ウェルプレートに12mmの無菌ガラスカバーリップを移します。カバースリップ全体の表面を完全に覆う方法で、各ウェルに300マイクロリットルのPDL溶液を注ぎます。イオン化水中の濃度0.1mg/mLでPDL溶液を調製します。乾燥を防ぐためにアルミニウムホイルでプレートを包み、一晩CO2インキュベーターに保管してください。翌日、めっきする前に、PDL溶液を吸引する。滅菌水で2~3回きちんと洗います。次いでメッキ媒体を加え、プレートをめっきするまでインキュベーターに戻す。E14-E16時の妊娠中のスプレイグ・ドーリーラットを犠牲にし、無菌鉗子と鈍い端のはさみを使用して腹部にV字型のカットを行います。すべての胎児を取り除き、慎重に冷たいHBSS溶液でシャートリプレートの上に置きます。胚嚢から胚を取り出し、新鮮で冷たいHBSSで別のシャーレで慎重に洗います。無菌はさみの助けを借りて頭を切断します。冷たいHBSSと滅菌90ミリメートルのシャートリプレートにヘッドを転送します。ステレオ顕微鏡の下で、無菌鋸歯状鉗子でスナット領域から頭部を保持し、皮膚と頭蓋骨を切り開いて脳を取り出す。脳幹を保持することにより、半球と中脳からすべての髄を除去します。海馬と皮質を含むキノコの帽子に似た無傷の半球を慎重に取り除きます。10 mLの解離媒体を含む15 mL円錐形管に皮質と無傷の海馬を含む半球を集める。採取した組織が落ち着き、解離培地を吸引し、培地の5~10%を残す。再び、10 mLの新鮮な解離媒体を加え、このステップを2回繰り返します。解離媒体4.5mLと0.5mLのトリプシン-EDTA溶液を加えます。消化が進むには、37°Cで20分間保育器に入れておいてください。培地を吸引し、10mLの解離媒体とめっき培地で連続して洗浄する。2.5mLのめっき培地で再懸濁します。皿の逆蓋の上に90ミリメートルの無菌皿を保ち、90ミリメートルの滅菌皿のベースに注ぎます。消化した組織を皿の隅の基部に、1000マイクロリットルピペットチップを使用して、最も少ない体積を占めるようにする。得られた細胞懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して、組織の任意の塊を除く。トリパンブルー色素排除を使用して生存細胞の密度を決定し、自動化されたセルカウンター内のセル数をカウントします。得られた細胞の数を1.5を10に10にして高密度めっきの場合はmL当たり5細胞のパワー、30mLのめっき媒体を含む2つの別々のチューブで低密度めっきの場合は20,000細胞/mLを希釈する。前に添加しためっき媒体とプレート500マイクロリットルの細胞を各ウェルにめっき培地に分散させた吸引する。その後、プレートをインキュベーターに4時間戻します。めっきの4時間後、顕微鏡下で接着する細胞を調べる。4時間のめっきの後、高密度および低密度プレートの両方で、ニューロンはプレートに良好な付着を示す。各井戸の培地を500マイクロリットルの新鮮なメンテナンス培地に交換し、37°Cのインキュベーターでインキュベーターに入れ替えます。私たちは、これらのニューロンを高密度と低密度でメッキ培養する必要があります。低密度めっきニューロンは、週に2回維持媒体を交換することによって、最大30日間、長期培養に使用することができますが、高密度メッキニューロンは、超低添付着プレートで維持した翌日に来た神経球を自発的に生成し始めます。24時間のめっきの後、高密度および低密度めっきニューロンの両方が健康な形態を示すために観察される。低密度めっきニューロンの位相コントラスト画像を、約7日間培養して、ここに表示する。ニューロンは健康な形態を示し、より活発なルーティングおよび相互接続と30日まで維持することができる。ここでの棒図はMTTアッセイによって決定されるように、培養の30日後でさえ低密度めっきニューロンの約90%の生存率を示す。ここでの主要なニューロンは、区別されたニューロンのマーカーであるTuj 1と、ニューロン軸索のマーカーであるtauを用いて免疫染色することを特徴としている。ニューロンの純度は、アストロサイトのGFAPおよびオリゴデンドロサイトのO4の非ニューロンマーカーの染色がないことによって確認される。すべての特性評価研究において、核はHoechst 33258で染色されている。ここで、低密度シード細胞は、GFAPと神経マーカーTuj1のアストロサイトマーカーで染色され、培養の純度を7日間までチェックしている。このプロトコルは、定量分析によって示されるように、アストロサイト上のニューロンの優遇成長をサポートすることが観察される。核は、Hoechst 33258で染色されています。同様に、高密度播種細胞では、アストロサイトはTuj 1によってGFAPおよびニューロンで染色されている。ここで、定量分析では、83%のニューロンと比較して約17%のアストロサイトが観察される。核は、Hoechst 33258で染色されています。7日後、高密度ニューロンに自発的に形成された複数の神経球が観察される。培養の8日目から10日目頃、高密度めっきニューロンでは、神経球は大きな突起を形成し始め、放射状グリア様エクステンションからなる橋梁を形成し始める。黒い矢印は、2つの新しく形成された神経球間の橋を示す。生細胞および死細胞アッセイは、神経球上で15日間行われてきた。緻密なカルセインAM染色では、ヨウ化プロピジウム染色を全く有しないが、培養における神経球のほぼ100%の生存率を示す。ここでの折れ線グラフは、経過日数を伴う神経球の大きさの拡大を示しています。この過度に染色された神経球の画像は、NPCマーカーNestinおよびTuj 1の発現の増加を通じて神経前駆細胞の豊富な集団を示す。ここでの神経球は、GFAPの強い発現によって特徴づけられる多数のアストロサイトを示し、さらに高い神経マーカーTuj 1の発現を伴う。核は、Hoechst 33258で染色されています。だから私たちのプロトコルは、単一の戦略から2つのプラットフォームを得ることができるという事実を考えると、非常にエキサイティングで興味深いと思います:1つの2-Dと1つの3D。そして、これは異なる神経治療のトラックをスクリーニングするための素晴らしいプラットフォームになります。だから私はそれが本当にすべての神経科学者に本当に便利だと思います。また、もう一つの重要な側面は、私たちが選ぶ神経球が神経前駆細胞、NPCに非常に豊富であるということです。そして、それらはニューロンおよび非ニューロン系統にそれらを区別するために使用することができる。だから、私は本当に、人々がこのビデオから助けを取ることによって、この技術を習得することができるならば、それは本当に誰にとっても本当に有用であると感じています。ありがとうございました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

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Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

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