Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

우리는 CSIR-IICB 동물 시설에 감사드립니다. G. D. 감사 ICMR, J. K. 및 V. G. DST 영감 감사, D. M. 그들의 동료에 대 한 인도 DBT 감사. S. G. 친절 하게 SERB (EMR/2015/002230) 재정 지원을 제공 하는 인도를 인정 합니다.

동물과 관련된 모든 실험 절차는 CSIR-인도 화학 생물학 연구소의 기관 동물 윤리위원회 (IICB / AEC / 회의 / 4 월 / 2018 / 1)에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 미디어 준비
<ol><li>폴리-D-리신(PDL) 용액: 탈이온수에서 0.1 mg/mL의 농도로 PDL 용액을 준비하고 사용할 때까지 4°C에 보관하십시오.</li>
	<li>해리 매체: 멸균, 여과 된 탈이온수 1 L에 염화 나트륨 (8 mg / mL), 염화 칼륨 (0.4 mg / mL)...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

이 프로토콜은 1차 뉴런의 세포 도금 밀도를 변경함으로써, 2개의 가변 뉴런 플랫폼이 수득되는 방법을 설명한다. 이것은 간단한 방법이지만 원하는 결과를 얻으려면 각 단계를 세심하게 수행해야합니다. 다른 이전 방법 중 장기 기본 신경 문화 또는 신경 구 배양 보고. 대부분의 기본 신경 문화 프로토콜에 대 한 해 마 뉴런의 배양을 포함 했다 3-5 주, 하지만 대부분 실패, 뉴런 죽고 연결의 손실로...

뇌는 신경 세포와 비 신경 세포의 복잡 한 회로. 수년 동안 과학자들은 이 복잡한 기계에 대한 통찰력을 얻기 위해 노력해 왔습니다. 이렇게 하기 위하여는, 신경 과학자는 처음에 조사를 위한 각종 변형된 신경 기지를 둔 세포주에 의지했습니다. 그러나, 이러한 클론 세포주무능력은 강한 시냅스 연결과 적절한 축산 또는 모수석을 형성하는 데 1차뉴런 배양에 대한 과학적 관심을 1,2로이동시켰다. 1 차적인 신경 문화의 가장 흥미로운 양상은 살아있는 신경세포를 관찰하고 조작할 수 있는 기회를 만든다는 것입니다3. 또한, 그것은 신경 조직에 비해 덜 복잡 한, 기능 및 다양 한 신경 단백질의 전송을 공부 하기 위한 이상적인 후보. 최근, 현미경 검사법, 유전체학 및 프로테오믹스 분야의 여러 발전은 신경 과학자들이 신경 문화를 악용할 수 있는 새로운 기회를 창출했습니다4.
1 차적인 문화는 신경 발달의 뒤에 분자 기계장치를 탐구하고, 각종 신경 신호 통로를 분석하고, 시냅스의 더 일관된 이해를 개발하는 신경과학자를 허용했습니다. 여러 가지 방법이 1차 뉴런으로부터의 배양을 보고했지만(대부분 해마기원5,6,7),뉴런의 장기 배양을 가능하게 하는 화학적으로 정의된 배지를 가진 통합 프로토콜은 여전히 필요합니다. 그러나, 저밀도에서 도금된 뉴런은 인접 한 뉴런 및 신경교 세포에 의해 제공되는 영양 지지부 8의 부족으로 인해 장기적으로 생존하지 못하는 가장 자주 관찰된다. 일부 방법은 심지어 신경교 세포를 가진 1 차적인 신경세포의 공동 배양제안했습니다, 여기서 신경교세포는 피더 층 9로 이용됩니다. 그러나, 신경교 세포는 때때로 신경 성장10을재정의하는 그들의 자라난 때문에 많은 문제를 제기합니다. 따라서, 위의 문제를 고려, 간단 하 고 더 비용 효율적인 기본 신경 문화 프로토콜 필요, 조사에 대 한 신경 생물학자와 신경 화학자 모두에 의해 사용할 수 있는.
1 차적인 신경 문화는 본질적으로 2D 문화의 한 형태이고 두뇌의 가소성, 공간 무결성, 또는 이질성을 나타내지 않습니다. 이것은 신경구11,12에게불린 더 믿을 수 있는 3D 모형을 위한 필요를 초래했습니다. 신경구는 신경 과학자에게 새로운 플랫폼을 제시, 실제에 가까운 유사, 생체 내 뇌13. 신경구는 신경 줄기 세포 (NSC), 신경 전구 세포 (NPC), 뉴런 및 성상 세포가 풍부한 세포의 비 부착 3D 클러스터입니다. 그들은 신경 줄기 세포와 신경 전구 세포의 격리에 대 한 훌륭한 소스, 다양 한 신경 및 비 신경 계보로 분화를 공부 하는 데 사용할 수 있는. 다시, 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 생성된 신경구 배양 내의 가변성은 통합된신경구 배양 프로토콜(14)의 제형에 장벽을 제시한다.
이 원고는 혼합 된 피질 및 해마 배양으로부터 세포 도금 밀도를 번갈아 가며 2D 및 3D 플랫폼을 모두 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 그것은 이내 7 일 자유 부동 신경구는 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 고밀도 도금 뉴런에서 얻어진다는 것을 관찰됩니다, 이는 추가 문화에 따라, 방사형 신경교와 같은 확장을 통해 다리와 상호 연결을 형성합니다. 유사하게, 저밀도 도금 뉴런에서, 최대 30일 동안 유지될 수 있는 1차 뉴런 배양은 일주일에 두 번 유지 배지를 변경함으로써 수득된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

1 차적인 신경 문화는 신경 과학의 필드에 있는 필수적인 기술입니다. 두뇌에 더 깊은 기계론적 통찰력을 얻으려면, 각종 신경생물학 연구 결과를 위해 이용될 수 있는 강력한 시험관내 모형이 필수적입니다. 비록 기본 신경 문화 (즉, 장기 해 마 문화) 모델 과학자를 제공 했습니다., 그것은 아직 완전히 뇌 네트워크의 복잡성을 대표 하지 않습니다. 이러한 한계의 여파로, 새로운 모델은 신경 구를 사용하여 등장했다, 이는 뇌 조직에 가까운 유사성을 곰. 본 프로토콜은 배아일 14-16 스프라그 다울리 래트의 배아로부터 분리된 혼합 된 피질 및 해마 뉴런의 높고 낮은 밀도의 도금을 기술한다. 이것은 추가 연구를 수행하기 위하여 2개의 독립적인 적인 단자로 신경구 및 장기 1 차적인 신경 문화의 생성을 허용합니다. 이 과정은 매우 간단 하 고 비용 효율적인, 그것은 여러 단계를 최소화 하 고 시약 이전에 신경 문화에 대 한 필수적인 것으로 간주. 이것은 달성 가능한 결과로 수행 될 수 있고 신경 과학과 관련된 다양한 연구에 더 많이 사용될 수있는 최소한의 요구 사항을 가진 강력한 프로토콜입니다.

이 프로토콜에서는, 2개의 다른 신경 검열 단자에서 가변 세포 도금 밀도가 얻어지는 간단한 전략이 해명되었습니다. 도 1A,B는 각각 고밀도 및 저밀도 도금 세포에서 뉴런을 도금한 후 4시간 후에 세포의 순응도를 나타낸다. 도1에 도시된 바와 같이 뉴런의 적절한 순응도를 관찰함에 따라, 도금 배지는 각각의 웰에?...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 신경 치료 리드의 효과를 연구하기위한 견고하고 저렴한 플랫폼을 제공하기 위해 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리 된 혼합 1 차 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구체의 발달을 입증하는 것입니다. 아시다시피, 뇌는 많은 수의 지원 세포와 관련된 뉴런의 복잡한 네트워크입니다. 뇌 기능을 이해 하려면, 종종 연구의 대부분은 시험 관 실험에서 다시 시작, 시판 되 고 사용할 수 있는 신경 계보 파생 된 세포주를 포함.그러나, 이 세포주는 genotypic 및 phenotypic 변이로 손해를 입는 세포주를 변형합니다. 이 문제를 해결 하기 위해, 기본 신경 문화는 적합 한 접근. 여기에서, 우리는 1 차적인 신경세포를 배양하기 위하여 간단하고 비용 효과적인 프로토콜을 설명하고 각종 신경 치료단을 위한 강력한 검열 플랫폼을 구축했습니다.이 프로토콜의 주요 장점은 세포 도금 밀도를 조절하는 것만으로저밀도가 장기간 1차 신경 배양으로 이어지고 고밀도가 자발적인 신경구를 생성하는 두 개의 대조적인 뉴런 배양 플랫폼을 선보일 수 있다는 것입니다. 24웰 플레이트 두 개를 가져 가라. 하나는 고밀도, 저밀도 도금용.멸균 유리 커버립 12mm를 24웰 플레이트에 옮기. 전체 커버슬립의 표면을 완전히 덮는 방식으로 각 웰에 300 마이크로리터의 PDL 용액을 붓습니다. 탈온화 된 물에 0.1 mg / mL의 농도로 PDL 용액을 준비합니다.알루미늄 호일로 플레이트를 감싸서 건조를 방지하고 하룻밤 동안 CO2 인큐베이터에 보관하십시오. 다음 날, 도금 전에 PDL 솔루션을 흡인합니다. 멸균물로 2~3회 제대로 씻으시다.그런 다음 도금 매체를 추가하고 도금 될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다. E14-E16 시간 임신 한 Sprague-Dawley 쥐를 희생하고 멸균 집게와 무딘 끝 가위를 사용하여 복부 부위의 V 자형 컷을 만듭니다. 모든 태아를 제거하고 조심스럽게 차가운 HBSS 용액으로 페트리 플레이트에 놓습니다.배아 주머니에서 배아를 꺼내 서 신선한, 차가운 HBSS에서 별도 페트리 접시에 그들을 정중 하 게 세척. 멸균 가위의 도움으로 머리를 참수. 차가운 HBSS로 멸균 90mm 페트리 플레이트에 머리를 옮춥춥시다.스테레오 현미경의 밑에, 멸균 톱니모양의 집게로 주아웃 부위에서 머리를 잡고, 피부와 두개골을 잘라서 뇌를 꺼낸다. 뇌간을 잡고 반구와 중뇌에서 모든 수막을 제거합니다. 해마와 피질이 들어 있는 버섯 캡을 닮은 그대로 반구를 조심스럽게 제거하십시오.10mL의 해리 미디어를 포함하는 15mL 원심관에서 피질과 그대로 해마를 포함하는 반구를 수집합니다. 수집된 조직이 정착하고 해리 매체를 흡인하여 배지의 5~10%를 그대로 둡시합니다. 다시, 그것에 신선한 해리 매체의 10 mL을 추가하고 두 번이 단계를 반복합니다.4.5mL의 해리 매체와 트립신-EDTA 용액의 0.5mL를 추가합니다. 소화가 진행될 수 있도록 섭씨 37도에서 인큐베이터에 보관하십시오. 배지를 흡기하고 10mL의 해리 매체및 도금 매체로 연속적으로 세척한다.도금 매체의 2.5mL에서 다시 중단하십시오. 90mm 멸균 접시를 접시의 반전 커버 위에 보관하고 90mm 멸균 접시에 붓습니다. 1000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 접시의 모퉁이 베이스에 소화된 조직을 적티드하여 최소 볼륨을 차지합니다.70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 얻어진 세포 현탁액을 통과하여 조직의 덩어리를 제외합니다. trypan 블루 염료 제외를 사용하여 실행 가능한 세포의 밀도를 결정하고 자동화 된 세포 카운터에서 셀 수를 계산합니다. 고밀도 도금용 mL당 5세포의 전력으로 1.5~10을 플레이트로 플레이트할 수 있도록, 30mL의 도금을 함유한 2개의 별도 튜브에서 저밀도 도금에 대해 mL당 20, 000세포를 희석한다.이전에 첨가된 도금 매체및 플레이트 500 마이크로리터를 각각 웰에 도금 매체에 분산시흡시한다. 그 후, 4 시간 동안 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 도금 후 4 시간, 현미경에서 준수세포를 검사.4시간 동안 도금 후, 고밀도 플레이트와 저밀도 플레이트 모두에서 뉴런은 플레이트를 잘 준수합니다. 각 우물의 배지를 신선한 유지 보수 매체의 500 마이크로리터로 교체하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 인큐베이션합니다. 우리는 고밀도 및 저밀도에서 도금이러한 뉴런을 문화해야합니다.저밀도 도금 뉴런은 장기간 배양에 사용할 수 있지만, 최대 30일, 일주일에 두 번 유지 보수 매체를 변경하여 고밀도 도금 뉴런이 신경구를 자발적으로 생성하기 시작하며, 이는 초저부착 플레이트에서 유지한 지 하루 만에 나온 것입니다. 도금 24시간 후, 고밀도 및 저밀도 도금 뉴런 모두 건강한 형태를 나타내기 위해 관찰됩니다. 약 7일 동안 배양된 저밀도 도금 뉴런의 상 대비 이미지가 여기에 전시되어 있다.뉴런은 건강한 형태를 나타내며, 더 활발한 라우팅 및 상호 연결로 최대 30일까지 유지할 수 있습니다. 여기서 바 다이어그램은 MTT 분석에 의해 결정된 바와 같이 30일 간의 문화 후에도 저밀도 도금 뉴런의 약 90%의 생존력을 보여줍니다. 여기에서 1 차적인 뉴런은 Tuj 1, 분화한 뉴런의 마커, 및 타우, 신경 축축의 마커를 가진 면역 염색에 의해 특징지어졌습니다.뉴런의 순도는 성상세포에 대한 비신경 마커 GFAP및 올리고드로키테스에 대한 O4의 염색이 없는 것으로 확인된다. 모든 특성화 연구에서 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 여기서, 저밀도 종자 세포는 성상체 마커 GFAP 및 신경 마커 Tuj 1로 염색되어 최대 7일까지 배양의 순도를 확인하였다.이 프로토콜은 정량 분석을 통해 표시된 대로 성상세포에 대한 뉴런의 우대 성장을 지원하는 것으로 관찰된다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 유사 하 게, 고밀도 씨드 세포에서, 성상 세포는 Tuj에 의해 GFAP와 뉴런으로 염색 되었습니다 1.여기서, 정량 분석에서, 약 17% 성상세포는 83% 뉴런에 비해 관찰됩니다. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 7 일 후, 고밀도 뉴런에서 자발적으로 형성 된 여러 신경 구가 관찰된다.문화의 약 8~10일, 고밀도 도금 뉴런에서 신경권은 방사형 신경교와 같은 확장으로 구성된 큰 투영과 다리를 형성하기 시작합니다. 검은 화살은 새로 형성된 두 개의 신경구 사이의 다리를 나타냅니다. 살아 있는 죽은 세포 분석은 15 일 동안 신경구에 수행되었습니다.조밀한 Calcein AM 염색에서, 절대적으로 더 프로디듐 요오드 얼룩, 문화에서 신경 구체의 거의 100 % 생존력을 나타냅니다. 여기서 선 그래프는 일 수의 통과와 신경 구의 크기의 확장을 나타냅니다. 신경권의 이 지나치게 얼룩진 심상은 NPC 마커 네스테인과 Tuj 1의 증가한 발현을 통해 신경 전구 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다.여기에 신경구는 GFAP의 강한 발현에 의해 표시 된 성상세포의 높은 금액을 보여줍니다, 신경 마커 Tuj의 더 높은 발현과 함께 1. 핵은 Hoechst 33258로 염색되었습니다. 그래서 저는 단일 전략에서 2-D 와 3-D 라는 두 개의 플랫폼을 얻을 수 있다는 사실을 고려할 때 우리의 프로토콜이 매우 흥미롭고 흥미롭다고 생각합니다.그리고 이것은 다른 신경 치료 트랙을 선별하기위한 훌륭한 플랫폼이 될 것입니다. 그래서 모든 신경 과학자에게 정말 유용 할 것 같아요. 또 다른 중요한 측면은 우리가 선택하는 신경구가 신경 전구 세포, NPC가 매우 풍부하다는 것입니다.그리고 그들은 뉴런과 비 신경 혈통으로 그들을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 그래서, 정말, 사람들이이 비디오에서 도움을 복용하여이 기술을 마스터 할 수 있다면, 그것은 모든 사람에게 정말 유용 할 것입니다 생각합니다. 감사합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

연구

신경과학

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

스프 라그 - 돌리 쥐에 Nodose 신경절 주입하는 방법

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...