Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Vi takker CSIR-IICB dyr anlegget. G. D. takk ICMR, J. K. og V. G. takker DST Inspire, og D. M. takk DBT, India for deres stipend. S. G. vennlig erkjenner SERBISKE (EPJ/2015/002230) India for å gi økonomisk støtte.

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av den institusjonelle dyreetikk komité CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/møte/APR/2018/1).
1. forberedelse av reagens og medier
<ol><li>Løsning for Poly-D-lysin (PDL): klargjør PDL-løsninger ved konsentrasjoner av 0,1 mg/mL i deionisert vann og oppbevares i 4 ° c til bruk.</li>
	<li>Dissosiasjon medium: til 1 L sterilt, filtrert deionisert vann, Kombiner følgende komponenter i de respektive konsentrasjo...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Denne protokollen beskriver at hvordan ved å endre celle plating tettheten av primære neurons, to variable neuronal plattformer er innhentet. Selv om dette er en enkel metode, må hvert trinn utføres omhyggelig for å oppnå de ønskede resultatene. Andre tidligere metoder har enten rapportert langsiktige primære Nevron kulturer eller neurosphere kulturer. Mest primære Nevron kultur protokoller har involvert dyrking av hippocampus neurons for 3-5 uker, men de fleste har sviktet, som neurons dø og visne bort på gru...

Hjernen er en intrikat krets av neuronal og ikke-neuronal celler. I årevis har forskere blitt prøver å få innsikt i dette komplekse maskiner. For å gjøre dette, nevrologer i utgangspunktet til ulike forvandlet nerve-baserte cellelinjer for undersøkelser. Imidlertid har manglende evne til disse klonal cellelinjer til å danne sterke Synaptic tilkoblinger og riktig axons eller dendrites skiftet vitenskapelig interesse for primær Nevron kulturer1,2. Det mest spennende aspektet ved primær Nevron kultur er at det skaper en mulighet til å observere og manipulere levende neurons3. Videre er det mindre komplekst i forhold til nevrale vev, som gjør det til en ideell kandidat for å studere funksjon og transport av ulike neuronal proteiner. Nylig har flere utbygginger innen mikroskopi, Genomics og Proteomikk generert nye muligheter for nevrologer å utnytte Nevron kulturer4.
Primær kulturer har tillatt nevrologer å utforske den molekylære mekanismer bak neural utvikling, analysere ulike nevrale signalering trasé, og utvikle en mer helhetlig forståelse av synapsis. Selv om en rekke metoder har rapportert kulturer fra primære neurons (hovedsakelig fra hippocampus opprinnelse5,6,7), en enhetlig protokoll med et kjemisk definert medium som muliggjør langsiktig kultur neurons er fortsatt nødvendig. Men, neurons belagt på en lav tetthet er oftest observert, som ikke overlever langsiktig, sannsynligvis på grunn av mangel på trofiske støtte8 som er gitt av tilstøtende neurons og gliacellene celler. Noen metoder har selv antydet co-dyrking av de primære neurons med gliacellene celler, karakterisert ved at de gliacellene cellene brukes som en mater lag9. Men gliacellene celler utgjør en masse problemer på grunn av deres overvekst, som noen ganger overstyre neuronal vekst10. Derfor, med tanke på problemene ovenfor, en enklere og mer kostnadseffektiv primære neural kultur protokollen er nødvendig, som kan brukes av både neurobiologists og neurochemists for undersøkelser.
En primær Nevron kulturen er egentlig en form for 2D kultur og representerer ikke plastisitet, romlig integritet, eller heterogenitet av hjernen. Dette har gitt opphav til behovet for en mer troverdig 3D-modell som heter neurospheres11,12. Neurospheres presentere en ny plattform til nevrologer, med en nærmere likhet med den virkelige, in vivo hjernen13. Neurospheres er ikke-tilhenger 3D-klynger av celler som er rike på nevrale stamceller (NSCs), nevrale stamceller (NPCer), neurons, og astrocytter. De er en utmerket kilde for isolering av nevrale stamceller og nevrale stamceller, som kan brukes til å studere differensiering inn i ulike neuronal og ikke-neuronal linjene. Igjen, variasjoner innen neurosphere kulturer produsert ved hjelp av tidligere rapporterte protokoller presenterer en barriere for utformingen av en enhetlig neurosphere kultur protokoll14.
Dette manuskriptet presenterer en protokoll der det er mulig å generere både 2D-og 3D-plattformer av vekslende celle plating tetthet fra en blandet kortikale og hippocampus kultur. Det er observert at innen 7 dager fritt flytende neurospheres er innhentet fra høy tetthet belagt neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo, som ved videre kultur, danner broer og sammenkoblinger gjennom radial gliacellene-lignende utvidelser. Tilsvarende i lav tetthet belagt neurons, en primær Nevron kultur som kan opprettholdes i opptil 30 dager oppnås ved å endre vedlikehold medium to ganger per uke.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

Primær Nevron kultur er en viktig teknikk innen nevrovitenskap. For å få dypere mekanistisk innsikt i hjernen, er det viktig å ha en robust in vitro-modell som kan utnyttes til ulike nevrobiologi studier. Selv om primære Nevron kulturer (dvs. langsiktige hippocampus kulturer) har gitt forskere med modeller, betyr det ennå ikke representerer kompleksiteten i hjernen nettverket helt. I kjølvannet av disse begrensningene, har en ny modell dukket opp ved hjelp av neurospheres, som bærer en nærmere likhet med hjernevevet. Den nåværende protokollen beskriver plating av høy og lav tetthet av blandede kortikale og hippocampus neurons isolert fra fosteret av embryonale dagen 14-16 Sprague Dawley rotter. Dette gjør det mulig for generering av neurospheres og langsiktige primære Nevron kultur som to uavhengige plattformer for å gjennomføre videre studier. Denne prosessen er svært enkel og kostnadseffektiv, da det minimerer flere trinn og reagenser tidligere anses avgjørende for Nevron kultur. Dette er en robust protokoll med minimale krav som kan utføres med oppnåelige resultater og videre brukes til et mangfold av studier knyttet til nevrovitenskap.

I denne protokollen, en enkel strategi har vært belyst der variabel celle plating tettheten fra to forskjellige nevrale screening plattformer er innhentet. Figur 1a,B illustrerer overholdelse av celler etter 4 h av plating neurons i høy og lav tetthet belagt celler, henholdsvis. På observere riktig overholdelse av neurons som vist i figur 1, ble plating medium erstattet av vedlikeholds medium i hver av brønne...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Presentert her er en protokoll for den spontane generasjonen av neurospheres beriket i nevrale stamceller fra høy tetthet belagt neurons. Under samme eksperiment, når neurons er belagt med en lavere tetthet, resulterer protokollen også i forlenget primære rotte Nevron kulturer.

Generering av Neurospheres fra Mixed Primary hippocampus og kortikale neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å demonstrere utviklingen av nevrosfærer fra blandede primære hippocampal og kortikale nevroner isolert fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo, for å tilby en robust og rimelig plattform for å studere effekten av ulike nevroterapeutiske fører. Som du vet, er den hjernen et komplekst nettverk av nevroner forbundet med et stort antall støtteceller. For å forstå hjernefunksjonen, er ofte det meste av forskningen re-initiert fra in vitro eksperimenter, som innebærer kommersielt tilgjengelig neural avstamning avledede cellelinjer.Denne cellelinjene er imidlertid forvandlet cellelinjer som lider av genotypiske og fenotypiske variasjoner. For å løse disse problemene er primær nevronkultur den passende tilnærmingen. Her illustrerte vi en enkel og kostnadseffektiv protokoll til kultur primære nevroner og bygget en robust screeningplattform for ulike nevrale terapeutiske midler.Den største fordelen med denne protokollen er at bare ved å modulere celleplating tettheter, kan vi vise frem to kontrasterende neuron kultur plattformer der lav tetthet fører til langvarig primær neuron kultur, og høy tetthet genererer spontane nevrosfærer. Ta to 24-brønnsplater. En for høy tetthet, og en annen for lav tetthet plating.Overfør 12 mm sterile glassdeksler i 24-brønnplatene. Hell 300 mikroliter PDL-oppløsning i hver av brønnene på en måte som dekker overflaten av hele dekkglasset fullt ut. Forbered PDL-oppløsningen med en konsentrasjon på 0,1 mg/ml i deionisert vann.Pakk platene med aluminiumsfolie for å hindre tørking, og hold den i CO2-inkubatoren over natten. Neste dag, før plating, aspirere PDL-løsningen. Vask riktig med sterilt vann i to til tre ganger.Tilsett deretter plating media, og returner platene til inkubatoren til plating. Ofre en E14-E16 tidsforskårne gravid Sprague-Dawley rotte, Lag en V-formet kutt i bukområdet ved hjelp av sterile tang og et par stumpe saks. Fjern alle fostrene og legg dem forsiktig på petriskålen med kald HBSS-løsning.Ta embryoene ut av embryonale sacs og vask dem forsiktig i en egen petriskål i frisk, kald HBSS. Decapitate hodet ved hjelp av steril saks. Overfør hodene i de sterile 90 mm petrisplatene med kald HBSS.Under stereomikroskopet holder du hodet fra snuteområdet med de sterile taggete tangene, og ta ut hjernen ved å kutte huden og skallen åpen. Fjern alle meningene fra halvkulene og midbrainen ved å holde hjernestammen. Fjern forsiktig de intakte halvkulene, som ligner soppcaps som inneholder hippocampus og cortex.Samle halvkuler som inneholder cortex og intakt hippocampus i en 15 ml konisk rør som inneholder 10 ml dissosiasjon media. La det oppsamlede vevet slå seg ned, og aspirere dissosiasjonsmediet, og la fem til ti prosent av mediet i den. Igjen, legg til 10 ml friskdissosiasjonsmedium til det, og gjenta dette trinnet to ganger.Tilsett 4,5 ml dissosiasjonsmedium og 0,5 ml trypsin-EDTA-løsning. Hold den i inkubatoren ved 37 grader Celsius i 20 minutter for fordøyelsen å fortsette. Aspirer mediet og vask med 10 ml dissosiasjonsmedium og plating medium, fortløpende.Resuspend dem i 2,5 ml plating medium. Hold en 90 mm steril tallerken over det inverterte dekselet på fatet og hell den i bunnen av 90 mm steril tallerken. Titrer det fordøyde vevet i hjørnebasen av parabolen, ved hjelp av 1000 mikroliter pipettespiss, slik som å okkupere minst volum.Pass den oppnådde cellesuspensjonen gjennom 70 mikrometercellesilen, unntatt noen biter av vev. Bestem tettheten av levedyktige celler ved hjelp av trypan blå fargestoff utelukkelse, og telle antall celler i en automatisert celleteller. Fortynn antall celler oppnådd på en måte for å plate 1,5 i 10 til kraften av 5 celler per ml for plating med høy tetthet, og 20 000 celler per ml for plating med lav tetthet i to separate rør som inneholder 30 ml plating medium.Aspirer det tidligere tilsatt plating medium og plate 500 mikroliter av celler dispergert i plating medium i hver brønn. Deretter returnerer platene til inkubatoren i fire timer. Fire timer etter plating, undersøke cellene for etterlevelse under mikroskopet.Etter fire timer med plating, i både høye og lave tetthetsplater, viser nevronene god overholdelse av platene. Bytt medium i hver brønn med 500 mikroliter friskt vedlikeholdsmedium, og inkuber det i en inkubator ved 37 grader Celsius. Vi må dyrke disse nevronene belagt for ved høy og lav tetthet.Mens de lavtetthetsbelagte nevronene kan brukes til langvarige kulturer, opptil 30 dager, ved å endre vedlikeholdsmediet to ganger i uken, begynner de belagte nevronene med høy tetthet å spontant generere nevrosfærer, som kom dagen etter at vi opprettholdt i ultra-lav festeplate. Etter 24 timer med plating observeres både høyt- og lavtetthetsbelagte nevroner for å vise sunn morfologi. Et fasekontrastbilde av de lavtetthetsbelagte nevronene, dyrket i omtrent syv dager, vises her.Nevronene viser sunn morfologi, og kan opprettholdes opptil 30 dager med kraftigere ruting og forbindelser. Stolpediagrammet her viser rundt 90 prosent levedyktighet for de lavtetthetsbelagte nevronene selv etter 30 kulturdager, som bestemt av MTT-analysen. De primære nevronene her har vært preget av immunstaining med Tuj 1, en markør for differensierte nevroner, og tau, en markør for nevronale aksoner.Renheten av nevronene er bekreftet av fravær av farging i ikke-nevronale markører GFAP for astrocytter og O4 for oligodendrocytes. I alle karakteriseringsstudiene har kjerner blitt farget med Hoechst 33258. Her har de lavtetthetsseedede cellene blitt farget med astrocytisk markør GFAP og nevronal markør Tuj 1 for å sjekke renheten av kulturen opptil syv dager.Det observeres at denne protokollen støtter fortrinnsrett vekst av nevroner over astrocytter som indikert gjennom kvantitativ analyse. Kjerner har blitt farget med Hoechst 33258. Tilsvarende, i høy tetthet seeded celler, astrocytter har blitt farget med GFAP og nevroner av Tuj 1.Her, i den kvantitative analysen, observeres rundt 17 prosent astrocytter sammenlignet med 83 prosent nevroner. Kjernene har blitt farget med Hoechst 33258. Etter syv dager observeres spontant flere nevrosfærer i nevronene med høy tetthet.Rundt åttende til tiende dag av kultur, i høy tetthet belagt nevroner, begynner nevrosfærene å danne store projeksjoner og broer bestående av radiale gliallignende utvidelser. De svarte pilene indikerer broen mellom to nydannede nevrosfærer. Levende og døde celleanalyser har blitt utført på nevrosfærene i 15 dager.I tett Calcein AM farging, med absolutt ingen propidiumjodid farging, indikerer nesten 100 prosent levedyktighet av neurosfærer i kultur. Linjegrafen her indikerer en utvidelse i størrelsen på nevrosfærene med passering av antall dager. Dette altfor beisede bildet av neurosphere indikerer en rik populasjon av nevrale stamceller gjennom økt uttrykk for NPC-markører Nestin og Tuj 1.Nevrosfærene her viser store mengder astrocytter preget av det sterke uttrykket av GFAP, ledsaget av et enda høyere uttrykk for nevronal markør Tuj 1. Kjernene har blitt farget med Hoechst 33258. Så jeg tror vår protokoll er ganske spennende og interessant, med tanke på at fra en enkelt strategi er vi i stand til å få to plattformer: en 2-D og en 3D.Og dette vil være en flott plattform for screening av ulike nevroterapeutiske spor. Så jeg antar det er veldig nyttig for alle nevrologer. Også et annet viktig aspekt er at nevrosfærene vi velger er ekstremt rike på nevrale stamceller, NPCene.Og de kan brukes til å differensiere dem til nevroner og ikke-nevronale avstamninger. Så jeg føler at hvis folk virkelig kan mestre denne teknikken ved å ta hjelp fra denne videoen, vil det være veldig nyttig for alle. Takk.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat kortikale nevroner og gliaceller

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering og kultur hippocampus Nerveceller fra Prenatal Mus

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

En Måte Nodose ganglia Injeksjon i Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Kvantifisering av Trådformede Actin (F-aktin) puncta i Rat kortikale nevroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...