Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Agradecemos a instalação animal da CSIR-IICB. G. D. graças ICMR, J. K. e V. G. agradecer DST Inspire, e D. M. obrigado DBT, Índia para suas bolsas. S. G. gentilmente reconhece SERB (EMR/2015/002230) Índia para fornecer apoio financeiro.

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal institucional do CSIR-Instituto indiano de biologia química (IICB/AEC/reunião/abr/2018/1).
1. reagente e preparação dos meios
<ol><li>Solução de poli-D-lisina (PDL): Preparar soluções PDL em concentrações de 0,1 mg/mL em água desionizada e armazenar em 4 ° c até o uso.</li>
	<li>Meio de dissociação: para 1 L de água desionizada estéril e filtrada, combine os seguintes compon...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Este protocolo descreve que como alterando as densidades do chapeamento de pilha de neurônios preliminares, duas plataformas neuronal variáveis são obtidas. Embora este seja um método simples, cada etapa deve ser meticulosamente realizada para alcançar os resultados desejados. Outros métodos anteriores relataram culturas de neurônio primários de longo prazo ou culturas de neurofera. A maioria de protocolos preliminares da cultura do neurônio envolveram o cultivo de neurônios hippocampal por 3-5 semanas, mas a m...

O cérebro é um circuito intrincado de células neuronais e não-neuronais. Durante anos, os cientistas têm tentado obter informações sobre esta maquinaria complexa. Para isso, os neurocientistas recorreram inicialmente a várias linhagens celulares transformadas em nervo para investigações. No entanto, a incapacidade dessas linhagens de células clonais de formar conexões sinápticas fortes e axônios ou dendritos adequados mudaram o interesse científico para as culturas primárias do neurão1,2. O aspecto mais excitante da cultura do neurônio primário é que ele cria uma oportunidade para observar e manipular os neurônios vivos3. Além disso, é menos complexa em comparação com o tecido neural, o que o torna um candidato ideal para estudar a função e o transporte de várias proteínas neuronais. Recentemente, vários desenvolvimentos nas áreas de microscopia, genômica e proteômica têm gerado novas oportunidades para os neurocientistas explorarem as culturas neurais4.
As culturas primárias permitiram que os neurocientistas explorem os mecanismos moleculares por trás do desenvolvimento neural, analisem várias vias de sinalização neural e desenvolvam uma compreensão mais coerente da sinsicose. Embora uma série de métodos relataram culturas de neurônios primários (principalmente a partir da origem hipocampal5,6,7),um protocolo unificado com um meio quimicamente definido que permite a cultura de longo prazo de neurônios é ainda necessário. Entretanto, os neurônios chapeados em uma baixa densidade são observados o mais frequentemente, que não sobrevivem a longo prazo, provavelmente devido à falta do apoio trófico8 que é fornecido pelos neurônios adjacentes e pelas pilhas glial. Alguns métodos sugeriram até mesmo a coculturação dos neurônios primários com células gliais, onde as células gliais são usadas como uma camada de alimentador9. Entretanto, as pilhas glial levantam muitos problemas devido a seu overgrowth, que substituem às vezes o crescimento neuronal10. Assim, considerando os problemas acima, é necessário um protocolo de cultura neural primária mais simples e rentável, que pode ser usado tanto por neurobiólogos quanto por neuroquímicos para investigações.
Uma cultura primária de neurónios é essencialmente uma forma de cultura 2D e não representa a plasticidade, a integridade espacial ou a heterogeneidade do cérebro. Isso tem dado origem à necessidade de um modelo 3D mais crível chamado neuroesferas11,12. As neuroesferas apresentam uma nova plataforma para os neurocientistas, com uma semelhança mais estreita com o cérebro real, in vivo13. As neuroesferas são aglomerados 3D não aderentes de células que são ricas em células-tronco neurais (NSCs), células progenitoras neurais (NPCs), neurônios e astrócitos. Eles são uma excelente fonte para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras neurais, que podem ser usadas para estudar a diferenciação em várias linhagens neuronais e não-neuronais. Outra vez, a variabilidade dentro das culturas da neurofera produzidas usando os protocolos previamente relatados apresenta uma barreira à formulação de um protocolo unificado da cultura da neurofera14.
Este manuscrito apresenta um protocolo em que é possível gerar ambas as plataformas 2D e 3D alternando densidades do chapeamento de pilha de uma cultura cortical e hippocampal misturada. Observa-se que dentro de 7 dias as neuroesferas livres-flutuantes são obtidas dos neurônios chapeados high-density isolados do embrião do rato de E14-E16 Sprague Dawley, que em cima da cultura mais adicional, formam pontes e interconexões através das extensões glial-como radiais. Similarmente, nos neurônios chapeados da baixa densidade, uma cultura preliminar do neurônio que possa ser mantida por até 30 dias é obtida mudando o meio da manutenção duas vezes por a semana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

A cultura primária do neurão é uma técnica essencial no campo da neurociência. Para obter insights mecanísticos mais profundos sobre o cérebro, é essencial ter um modelo in vitro robusto que pode ser explorado para vários estudos de neurobiologia. Embora as culturas preliminares do neurônio (isto é, culturas hippocampal a longo prazo) forneceram cientistas com modelos, não representa ainda a complexidade da rede do cérebro completamente. Na esteira dessas limitações, um novo modelo surgiu usando neuroesferas, que tem uma semelhança mais estreita com o tecido cerebral. O protocolo atual descreve o chapeamento de densidades elevadas e baixas de neurônios corticais e hippocampal misturados isolados do embrião do dia embrionário 14-16 ratos de Sprague Dawley. Isto permite a geração de neuroesferas e a cultura preliminar a longo prazo do neurônio como duas plataformas independentes para conduzir uns estudos mais adicionais. Este processo é extremamente simples e rentável, pois minimiza várias etapas e reagentes anteriormente considerados essenciais para a cultura do neurônio. Este é um protocolo robusto com requisitos mínimos que podem ser realizados com resultados alcançáveis e mais utilizados para uma diversidade de estudos relacionados à neurociência.

Neste protocolo, uma estratégia simples foi elucidada em que as densidades variáveis do chapeamento de pilha de duas plataformas de seleção neural diferentes são obtidas. A Figura 1a,B ilustra a aderência das células após 4 h de chapeamento dos neurônios em células de alta e baixa densidade, respectivamente. Ao observar a aderência adequada dos neurônios como mostrado na Figura 1, o meio de revestimen...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o desenvolvimento de neuroferas a partir de neurônios hipocampais primários mistos e corticais isolados do embrião de ratos E14-E16 Sprague Dawley, a fim de oferecer uma plataforma robusta e de baixo custo para estudar o efeito de vários leads neuroterapêuticos. Como você sabe, esse cérebro é uma complexa rede de neurônios associados com um grande número de células de suporte. Para entender a função cerebral, muitas vezes a maioria das pesquisas é reintratada a partir de experimentos in vitro, que envolve linhas celulares derivadas de linhagem neural comercialmente disponíveis.No entanto, essas linhas celulares são linhas celulares transformadas que sofrem de variações genotipípicas e fenotípicas. Para resolver essas questões, a cultura primária dos neurônios é a abordagem adequada. Aqui, ilustramos um protocolo simples e econômico para cultivar neurônios primários e construímos uma plataforma de triagem robusta para várias terapêuticas neurais.A principal vantagem deste protocolo é que apenas modulando as densidades de revestimento celular, podemos mostrar duas plataformas de cultura de neurônios contrastantes onde a baixa densidade leva à cultura de neurônios primários prolongada, e a alta densidade gera neuroesferas espontâneas. Pegue duas placas de 24 poços. Um para alta densidade, e outro para revestimento de baixa densidade.Transfira 12 mm de tampas de vidro estéreis nas placas de 24 poços. Despeje 300 microliters de solução PDL em cada um dos poços de uma forma que cubra totalmente a superfície de toda a mancha de cobertura. Prepare a solução PDL com uma concentração de 0,1 mg/mL em água deionizada.Enrole as placas com folhas de alumínio para evitar a secagem e mantenha-as na incubadora de CO2 durante a noite. No dia seguinte, antes de emplacamento, aspire a solução PDL. Lave corretamente com água estéril por duas a três vezes.Em seguida, adicione a mídia de chapeamento e devolva as placas à incubadora até chapeamento. Sacrifique um rato Sprague-Dawley grávida E14-E16 cronometrado, faça um corte em forma de V na área abdominal usando fórceps estéreis e um par de tesouras sem corte. Remova todos os fetos e coloque-os cuidadosamente na placa de petri com solução HBSS fria.Retire os embriões dos sacos embrionários e lave-os cuidadosamente em uma placa de petri separada em HBSS fresco e frio. Decapite a cabeça com a ajuda de uma tesoura estéril. Transfira as cabeças nas placas estéreis de 90 mm de petri com HBSS frio.Sob o microscópio estéreo, segure a cabeça da região do focinho com as fórceps serrilhadas estéreis, e retire o cérebro cortando a pele e o crânio abertos. Remova todas as meninges dos hemisférios e do cérebro médio segurando o tronco cerebral. Remova cuidadosamente os hemisférios intactos, assemelhando-se a tampas de cogumelo que contém o hipocampo e o córtex.Colete os hemisférios contendo córtex e hipocampo intacto em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de mídia de dissociação. Permita que os tecidos coletados se acalmem e aspirem o meio de dissociação, deixando de 5 a 10% do meio nele. Novamente, adicione 10 mL de meio de dissociação fresco a ele, e repita esta etapa duas vezes.Adicione 4,5 mL de meio de dissociação e 0,5 mL de solução trypsin-EDTA. Mantenha-o na incubadora a 37 graus Celsius por 20 minutos para que a digestão prossiga. Aspire o médio e lave com 10 mL de meio de dissociação e meio de revestimento, consecutivamente.Resuspensá-los em 2,5 mL de meio de revestimento. Mantenha um prato estéril de 90 mm sobre a tampa invertida do prato e despeje-o na base de 90 mm prato estéril. Titular os tecidos digeridos na base do canto do prato, utilizando 1000 ponta de pipeta microliter, de modo a ocupar o menor volume.Passe a suspensão celular obtida através do coador de células de 70 micrômetros, excluindo quaisquer pedaços de tecido. Determine a densidade de células viáveis usando a exclusão de corante azul trypan, e conte o número de células em um contador celular automatizado. Diluir o número de células obtidas de forma aplacar 1,5 em 10 para a potência de 5 células por mL para chapeamento de alta densidade, e 20.000 células por mL para chapeamento de baixa densidade em dois tubos separados contendo 30 mL de meio de revestimento.Aspire o meio de revestimento previamente adicionado e a placa 500 microliters de células dispersas em meio de revestimento em cada poço. Depois disso, devolva as placas à incubadora por quatro horas. Quatro horas após o revestimento, examine as células para adesão sob o microscópio.Após quatro horas de revestimento, tanto em placas de alta e baixa densidade, os neurônios mostram boa aderência às placas. Substitua o meio em cada poço por 500 microliters de meio de manutenção fresco, e incuba-o em uma incubadora a 37 graus Celsius. Temos que cultivar esses neurônios banhados em alta e baixa densidade.Enquanto os neurônios banhados de baixa densidade podem ser usados para culturas prolongadas, até 30 dias, alterando o meio de manutenção duas vezes por semana, os neurônios banhados de alta densidade começam a gerar espontaneamente neuroesferas, que vieram um dia depois que mantivemos em placa de fixação ultra-baixa. Após 24 horas de revestimento, tanto neurônios banhados de alta e baixa densidade são observados para apresentar morfologia saudável. Uma imagem de contraste de fase dos neurônios banhados de baixa densidade, cultivados por cerca de sete dias, é exibida aqui.Os neurônios apresentam morfologia saudável, podendo ser mantidos até 30 dias com roteamentos mais vigorosos e interconexões. O diagrama da barra aqui mostra cerca de 90% de viabilidade dos neurônios banhados de baixa densidade mesmo após 30 dias de cultura, conforme determinado pelo ensaio MTT. Os neurônios primários aqui foram caracterizados pela imunostenção com Tuj 1, um marcador de neurônios diferenciados, e tau, um marcador de axônios neuronais.A pureza dos neurônios é confirmada pela ausência de manchas em marcadores não neuronais GFAP para astrócitos e O4 para oligodendrócitos. Em todos os estudos de caracterização, núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Aqui, as células semeadas de baixa densidade foram manchadas com o marcador astrócito GFAP e o marcador neuronal Tuj 1 para verificar a pureza da cultura até sete dias.Observa-se que este protocolo suporta o crescimento preferencial dos neurônios sobre os astrócitos, conforme indicado através da análise quantitativa. Núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Da mesma forma, nas células semeadas de alta densidade, os astrócitos foram manchados com GFAP e neurônios por Tuj 1.Aqui, na análise quantitativa, cerca de 17% de astrócitos são observados em comparação com 83% dos neurônios. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Após sete dias, formam espontaneamente múltiplas neurosferas nos neurônios de alta densidade.Por volta do oitavo ao décimo dia de cultura, nos neurônios banhados de alta densidade, as neurosferas começam a formar grandes projeções e pontes consistindo de extensões gliais radiais. As flechas negras indicam a ponte entre duas neurosferas recém-formadas. Ensaios de células vivas e mortas foram realizados nas neurosferas por 15 dias.Na densa mancha de Calcein AM, sem absolutamente nenhuma coloração de iodeto propidium, indica quase 100% de viabilidade das neurosferas na cultura. O gráfico de linha aqui indica uma expansão no tamanho das neurosferas com a passagem de número de dias. Esta imagem excessivamente manchada da neurosfera indica uma rica população de células progenitoras neurais através do aumento da expressão dos marcadores NPC Nestin e Tuj 1.As neuroesferas aqui mostram altas quantidades de astrócitos marcadas pela forte expressão de GFAP, acompanhadas por uma expressão ainda maior do marcador neuronal Tuj 1. Os núcleos foram manchados com Hoechst 33258. Então eu acho que nosso protocolo é bastante emocionante e interessante, considerando o fato de que a partir de uma única estratégia somos capazes de obter duas plataformas: uma 2-D e outra 3D.E esta será uma ótima plataforma para triagem de diferentes trilhas neuroterapêuticas. Então eu acho que é realmente muito útil para todos os neurocientistas. Outro aspecto importante é que as neurosferas em que optamos são extremamente ricas em células progenitoras neurais, os NPCs.E eles podem ser usados para diferenciá-los em neurônios e linhagens não neuronais. Então, eu sinto que se, realmente, as pessoas podem dominar essa técnica tirando ajuda deste vídeo, vai ser realmente útil para todos. Obrigado.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neurociência

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Um método de Nodoso Gânglios Injecção em ratos Sprague-Dawley

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...