Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Мы благодарим животноводческий объект CSIR-IICB. Г.Д. благодарит ICMR, J. K. и V. G. thank DST Inspire, и D. M. благодарит DBT, Индия за их стипендии. S. G. любезно признает SERB (EMR/2015/002230) Индия для оказания финансовой поддержки.

Все экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1. Подготовка реагентов и средств массовой информации
<ol><li>Поли-D-лизина (PDL) раствор: подготовить PDL растворы в концен...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Этот протокол описывает, что, изменяя плотность клеточного покрытия первичных нейронов, получаются две переменные нейронные платформы. Хотя это простой метод, каждый шаг должен быть тщательно выполнен для достижения желаемых результатов. Другие предыдущие методы либо сообщили долгос...

Мозг представляет собой сложную схему нейрональных и ненейрональных клеток. В течение многих лет ученые пытались получить представление об этом сложном механизме. Для этого нейробиологи первоначально прибегали к различным преобразованиям нервных клеточных линий для исследований. Тем не менее, неспособность этих клональных клеточных линий, чтобы сформировать сильные синаптические связи и надлежащие аксоны или дендриты сместили научный интерес к первичным культурам нейронов1,2. Наиболее захватывающим аспектом первичной культуры нейронов является то, что она создает возможность наблюдать и манипулировать живыми нейронами3. Кроме того, он менее сложен по сравнению с нервной тканью, что делает его идеальным кандидатом для изучения функции и транспортировки различных нейрональных белков. В последнее время несколько разработок в области микроскопии, геномики и протеомики создали новые возможности для нейробиологов, чтобы использовать нейронных культур4.
Первичные культуры позволили нейробиологам исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе нейронного развития, анализировать различные нервные сигнальные пути и развивать более последовательное понимание синапсиса. Хотя ряд методов сообщили культур из первичных нейронов (в основном из гиппокампа происхождения5,6,7), единый протокол с химически определенной среде, которая позволяет долгосрочной культуры нейронов по-прежнему необходимо. Тем не менее, нейроны покрытием при низкой плотности чаще всего наблюдаются, которые не выживают в долгосрочной перспективе, вероятно, из-за отсутствия трофической поддержки 8, которая обеспечивается соседних нейронов и глиальных клеток. Некоторые методы даже предложили совместного культивирования первичных нейронов с глиальными клетками,в которых глиальные клетки используются в качестве фидерного слоя 9. Тем не менее, глиальные клетки создают много проблем из-за их разрастания, которые иногда переопределить роста нейронов10. Таким образом, учитывая проблемы выше, более простой и экономичный протокол первичной нейронной культуры не требуется, который может быть использован как нейробиологов и нейрохимиков для исследований.
Первичная культура нейронов по существу является формой 2D-культуры и не представляет пластичность, пространственную целостность или неоднородность мозга. Это привело к необходимости более правдоподобной 3D-модели под названием нейросферы11,12. Нейросферы представляют новую платформу для нейробиологов, с более близким сходством с реальным, in vivo мозга13. Нейросферы являются неадекторными 3D-кластерами клеток, богатых нервными стволовыми клетками (НСК), нервными клетками-прародителями (НпК), нейронами и астроцитами. Они являются отличным источником для изоляции нервных стволовых клеток и нервных клеток-прародителей, которые могут быть использованы для изучения дифференциации в различные нейронные и ненейронные линии. Опять же, изменчивость в нейросферных культурах, производимых с использованием ранее сообщенных протоколов, представляет собой барьер для разработки единого протокола культуры нейросферы14.
Данная рукопись представляет собой протокол, в котором можно генерировать как 2D, так и 3D платформы путем чередования плотности клеточного покрытия от смешанной корковой и гиппокампальной культуры. Отмечается, что в течение 7 дней свободно плавающие нейросферы получаются из высокой плотности покрытых нейронов, изолированных от E14-E16 Sprague Dawley крысы эмбриона, которые на дальнейшее культуры, образуют мосты и взаимосвязи через радиальные глиально-подобные расширения. Аналогичным образом, в низкой плотности покрывало нейронов, первичной культуры нейронов, которые могут быть сохранены до 30 дней, получается путем изменения среднего обслуживания два раза в неделю.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

Первичная культура нейронов является важным методом в области неврологии. Чтобы получить более глубокие механистические идеи в мозг, важно иметь надежную модель in vitro, которая может быть использована для различных исследований нейробиологии. Хотя первичные культуры нейронов (т.е. долгосрочные гиппокампа культур) предоставили ученым модели, он еще не представляет сложность сети мозга полностью. В результате этих ограничений, новая модель возникла с использованием нейросфер, которые имеют более близкое сходство с тканью мозга. Настоящий протокол описывает покрытие высокой и низкой плотности смешанных корковых и гиппокампальных нейронов, изолированных от эмбриона эмбрионального дня 14-16 Sprague Dawley крыс. Это позволяет для генерации нейросфер и долгосрочной первичной культуры нейронов в качестве двух независимых платформ для проведения дальнейших исследований. Этот процесс чрезвычайно прост и рентабельен, так как сводит к минимуму несколько шагов и реагентов, которые ранее считались необходимыми для культуры нейронов. Это надежный протокол с минимальными требованиями, которые могут быть выполнены с достижимыми результатами и далее использоваться для разнообразия исследований, связанных с неврологией.

В этом протоколе была выяснена простая стратегия, в которой получается плотность с переменным покрытием клеток с двух различных платформ скрининга нейронов. Рисунок 1A,B иллюстрирует соблюдение клеток после 4 ч покрытия нейронов в высокой и ни?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Здесь представлен протокол для спонтанного поколения нейросфер, обогащенных в нервных клетках-прародителях из нейронов высокой плотности. Во время того же эксперимента, когда нейроны покрываются при более низкой плотности, протокол также приводит к длительным первичных культур нейронов крыс.

Поколение нейросфер из смешанных первичных гиппокампа и кортикальных нейронов изолированы от E14-E16 Sprague Даули Крыса эмбриона

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать развитие нейросфер из смешанных первичных гиппокампа и корковых нейронов, изолированных от эмбриона крысы E14-E16 Sprague Dawley, с тем чтобы предложить надежную и недорогой платформу для изучения эффекта различных нейротерапевтических приводит. Как вы знаете, этот мозг является сложной сетью нейронов, связанных с большим количеством поддерживающих клеток. Чтобы понять функцию мозга, часто большая часть исследований вновь инициируется из экспериментов in vitro, которая включает в себя коммерчески доступные нейронные линии производных клеточных линий.Тем не менее, это клеточные линии преобразованы клеточные линии, которые страдают от генотипических и фенотипических вариаций. Для решения этой проблемы, первичной культуры нейронов является подходящим подходом. Здесь мы проиллюстрировали простой и экономически эффективный протокол для культуры первичных нейронов и создали надежную платформу скрининга для различных нейронных терапевтических средств.Основным преимуществом этого протокола является то, что, просто модулируя плотность покрытия клеток, мы можем продемонстрировать две контрастные платформы культуры нейронов, где низкая плотность приводит к длительной культуре первичных нейронов, а высокая плотность генерирует спонтанные нейросферы. Возьмите две пластины из 24 колодец. Один для высокой плотности, а другой для покрытия низкой плотности.Передача 12 мм стерильных стеклянных крышек в 24-хорошо пластин. Налейте 300 микролитров раствора PDL в каждой из скважин таким образом, чтобы она полностью покрывает поверхность всей крышки. Приготовьте раствор PDL при концентрации 0,1 мг/мл в деионизированной воде.Оберните пластины алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить высыхание, и держать его в инкубаторе CO2 на ночь. На следующий день, перед покрытием, аспирировать решение PDL. Вымойте правильно стерильной водой в течение двух-трех раз.Затем добавьте покрытие мультимедиа и верните пластины в инкубатор до покрытия. Пожертвовать E14-E16 время беременности Sprague-Dawley крысы, Сделать V-образный разрез в брюшной области с помощью стерильных типсов и пару тупых ножниц. Удалите все плоды и аккуратно поместите их на пластину Петри с холодным раствором HBSS.Вынюйте эмбрионы из эмбриональных мешков и тщательно вымойте их в отдельной чашке Петри в свежем, холодном HBSS. Обезглавить голову с помощью стерильных ножниц. Перенесите головки в стерильные 90 мм плиты Петри с холодным HBSS.Под стерео микроскопом держите голову от области морды стерильными зубчатыми типсами и вынюхив мозг, разрезая кожу и череп открытым. Удалите все околивания из полушарий и среднего мозга, удерживая ствол мозга. Аккуратно удалите нетронутые полушария, напоминающие грибные шапки, которые содержат гиппокамп и кору.Соберите полушария, содержащие кору и нетронутый гиппокамп в конической трубке 15 мл, содержащей 10 мл диссоциации. Разрешить собранные ткани, чтобы успокоиться, и аспирировать диссоциации среды, оставляя пять-десять процентов среды в нем. Опять же, добавить 10 мл свежей среды диссоциации к нему, и повторить этот шаг в два раза.Добавьте 4,5 мл средства диссоциации и 0,5 мл раствора трипсин-ЭДТА. Держите его в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут для пищеварения, чтобы продолжить. Аспирировать средний и мыть с 10 мл диссоциации среды и покрытие среды, последовательно.Повторное их в 2,5 мл покрытия среды. Храните 90 мм стерильную тарелку над перевернутой крышкой блюда и вылейте ее в основание 90 мм стерильной тарелки. Титрат переваренных тканей в углу основания блюдо, используя 1000 микролитер пипетки наконечник, с тем чтобы занять наименьшее количество.Перейдите полученную клеточную суспензию через 70-метровый клеточный ситечко, исключая любые куски ткани. Определите плотность жизнеспособных клеток с помощью исключения трипана синего красителя и подсчитайте количество ячеек в автоматизированном счетчике клеток. Разбавить количество клеток, полученных таким образом, чтобы пластины 1,5 в 10 к власти 5 клеток на мл для высокой плотности покрытия, и 20000 клеток на мл для низкой плотности покрытие в двух отдельных труб, содержащих 30 мл покрытия среды.Аспирировать ранее добавленное покрытие среды и пластины 500 микролитров клеток, рассеянных в покрытие среды в каждой хорошо. После этого верните пластины в инкубатор на четыре часа. Через четыре часа после покрытия, изучить клетки для присоединения под микроскопом.После четырех часов покрытия, как в высокой, так и низкой плотности пластин, нейроны показывают хорошую приверженность пластин. Замените среду в каждой хорошо с 500 микролитров свежей среды обслуживания, и инкубировать его в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию. Мы должны культури эти нейроны покрытием для при высокой и низкой плотности.В то время как с покрытием нейронов низкой плотности могут быть использованы для длительных культур, до 30 дней, путем изменения обслуживания среды два раза в неделю, высокой плотности покрытием нейронов начинает спонтанно генерировать нейросферы, которые пришли на следующий день после того, как мы поддерживали в ультра-низкой пластины вложения. После 24 часов покрытия, как с высокой, так и низкой плотностью потроха нейронов наблюдается для отображения здоровой морфологии. Здесь отображается фазовое контрастное изображение нейронов с низкой плотностью, которые культурируются около семи дней.Нейроны отображают здоровую морфологию, и могут поддерживаться до 30 дней с более энергичной маршрутизации и взаимосвязей. Диаграмма бара показывает около 90 процентов жизнеспособности нейронов с низкой плотностью даже после 30 дней культуры, как это определено анализом MTT. Первичные нейроны здесь были охарактеризованы иммуностимулирования с Tuj 1, маркер дифференцированных нейронов, и тау, маркер нейрональных аксонов.Чистота нейронов подтверждается отсутствием окрашивания в не нейрональных маркерах GFAP для астроцитов и O4 для олигодендроцитов. Во всех исследованиях характеристик, ядра были окрашены Hoechst 33258. Здесь, низкой плотности семян клетки были окрашены астроцитическим маркером GFAP и нейрональный маркер Tuj 1, чтобы проверить чистоту культуры до семи дней.Отмечается, что данный протокол поддерживает преференциальный рост нейронов над астроцитами, как указано в количественном анализе. Ядра были запятнаны Hoechst 33258. Аналогичным образом, в высокой плотности семенных клеток, астроциты были окрашены GFAP и нейронов Tuj 1.Здесь, в количественном анализе, около 17 процентов астроцитов наблюдаются по сравнению с 83 процентов нейронов. Ядра были окрашены Hoechst 33258. Через семь дней наблюдается спонтанное образовалось несколько нейросфер в нейронах высокой плотности.Примерно на восьмой-десятый день культуры, в нейронах с высокой плотностью, нейросферы начинают формировать большие проекции и мосты, состоящие из радиальных глиальных расширений. Черные стрелы указывают на мост между двумя вновь образованными нейросферами. Анализ живых и мертвых клеток проводился в нейросферах в течение 15 дней.В плотном Calcein AM окрашивание, без абсолютно никакого окрашивания йодида пропидия, указывает на почти 100-процентную жизнеспособность нейросфер в культуре. График линии здесь указывает на расширение размера нейросфер с прохождением количества дней. Это чрезмерно окрашенные изображения нейросферы указывает на богатую популяцию нейронных клеток-предшественников за счет увеличения экспрессии маркеров NPC Nestin и Tuj 1.Нейросферы здесь показывают большое количество астроцитов, отмеченных сильным выражением GFAP, сопровождается еще более высоким выражением нейронального маркера Tuj 1. Ядра были окрашены Hoechst 33258. Так что я думаю, что наш протокол довольно захватывающий и интересный, учитывая тот факт, что из одной стратегии мы можем получить две платформы: одну 2-D и одну 3-D.И это будет отличная платформа для скрининга различных нейротерапевтических треков. Так что я думаю, это действительно очень полезно для всех нейробиологов. Также еще одним важным аспектом является то, что нейросферы мы выбираем в чрезвычайно богаты нейронных клеток-предшественников, NPC.И они могут быть использованы, чтобы дифференцировать их на нейроны и не нейрональные линии. Так что, я чувствую, если, действительно, люди могут освоить эту технику, принимая помощь от этого видео, это будет действительно очень полезно для всех. Спасибо.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Двухслойный сотрудничества культуре первичных Крыса корковых нейронов и глии

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Метод Узловые ганглиев инъекций в Спрэг Dawley крыс

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...