Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Agradecemos a las instalaciones para animales del CSIR-IICB. G. D. agradece a ICMR, J. K. y V. G. agradecen a DST Inspire, y a D. M. gracias dbT, India por sus becas. S. G. reconoce amablemente a SERB (EMR/2015/002230) India por proporcionar apoyo financiero.

Todos los procedimientos experimentales relacionados con el animal fueron aprobados por el Comité Institucional de etica animal del CSIR-Instituto Indio de Biología Química (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1. Preparación de reactivos y medios
<ol><li>Solución de poli-d-lisina (PDL): preparar soluciones PDL a concentraciones de 0,1 mg/ml en agua desionizada y almacenar en 4oC hasta su uso.</li>
	<li>Medio de disociación: A 1 L de agua estéril desionizada filtrada, combinar los siguientes...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Este protocolo describe que cómo al alterar las densidades de revestimiento celular de las neuronas primarias, se obtienen dos plataformas neuronales variables. Aunque se trata de un método sencillo, cada paso debe realizarse meticulosamente para lograr los resultados deseados. Otros métodos anteriores han reportado cultivos de neuronas primarias a largo plazo o cultivos de neuroesfera. La mayoría de los protocolos de cultivo de neuronas primarias han implicado el cultivo de neuronas hipocampales durante 3-5 semanas,...

El cerebro es un circuito intrincado de células neuronales y no neuronales. Durante años, los científicos han estado tratando de obtener información sobre esta compleja maquinaria. Para ello, los neurocientíficos recurrieron inicialmente a varias líneas celulares transformadas basadas en los nervios para las investigaciones. Sin embargo, la incapacidad de estas líneas celulares clonales para formar fuertes conexiones sinápticasy axones o dendritas adecuadas han desplazado el interés científico a los cultivos de neuronas primarias 1,2. El aspecto más emocionante de la cultura de neuronas primarias es que crea una oportunidad para observar y manipular las neuronas vivas3. Además, es menos complejo en comparación con el tejido neural, lo que lo convierte en un candidato ideal para estudiar la función y el transporte de varias proteínas neuronales. Recientemente, varios desarrollos en los campos de la microscopía, la genómica y la proteómica han generado nuevas oportunidades para que los neurocientíficos exploten las culturas de las neuronas4.
Las culturas primarias han permitido a los neurocientíficos explorar los mecanismos moleculares detrás del desarrollo neuronal, analizar varias vías de señalización neuronal y desarrollar una comprensión más coherente de la sinapsis. Aunque una serie de métodos han reportado cultivos de neuronas primarias (principalmente del origen del hipocampo5,6,7), un protocolo unificado con un medio definido químicamente que permite el cultivo a largo plazo de las neuronas es todavía es necesario. Sin embargo, las neuronas plateadas a una baja densidad se observan con mayor frecuencia, que no sobreviven a largo plazo, probablemente debido a la falta de soporte trófico8 que es proporcionado por las neuronas adyacentes y células gliales. Algunos métodos incluso han sugerido la co-cultura de las neuronas primarias con célulasgliales, donde las células gliales se utilizan como una capa de alimentación 9. Sin embargo, las células gliales plantean muchos problemas debido a su crecimiento excesivo, que a veces anulan el crecimiento neuronal10. Por lo tanto, teniendo en cuenta los problemas anteriores, se requiere un protocolo de cultivo neural primario más simple y rentable, que puede ser utilizado por neurobiólogos y neuroquímicos para investigaciones.
Un cultivo de neurona primaria es esencialmente una forma de cultivo 2D y no representa la plasticidad, integridad espacial o heterogeneidad del cerebro. Esto ha dado lugar a la necesidad de un modelo 3D más creíble llamado neuroesferas11,12. Las neuroesferas presentan una plataforma novedosa para los neurocientíficos, con un parecido más cercano al cerebro real, in vivo13. Las neuroesferas son grupos 3D no adherentes de células que son ricas en células madre neurales (NSC), células progenitoras neuronales (NPC), neuronas y astrocitos. Son una excelente fuente para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neuronales, que se pueden utilizar para estudiar la diferenciación en varios linajes neuronales y no neuronales. Una vez más, la variabilidad dentro de los cultivos de la neuroesfera producidos utilizando los protocolos reportados anteriormente presenta una barrera a la formulación de un protocolo unificado de cultivo de la neuroesfera14.
Este manuscrito presenta un protocolo en el que es posible generar plataformas 2D y 3D alternando densidades de chapado celular a partir de un cultivo cortical e hipocampal mixto. Se observa que en un plazo de 7 días, las neuroesferas flotantes se obtienen de neuronas chapadas de alta densidad aisladas del embrión de rata Sprague Dawley E14-E16, que tras un cultivo posterior, forman puentes e interconexiones a través de extensiones radiales de tipo glial. Del mismo modo, en las neuronas chapadas de baja densidad, se obtiene un cultivo de neuronas primarias que se pueden mantener hasta 30 días cambiando el medio de mantenimiento dos veces por semana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

El cultivo de neuronas primarias es una técnica esencial en el campo de la neurociencia. Para obtener una visión mecanicista más profunda en el cerebro, es esencial tener un modelo in vitro robusto que pueda ser explotado para varios estudios de neurobiología. Aunque los cultivos de neuronas primarias (es decir, cultivos hipocampales a largo plazo) han proporcionado a los científicos modelos, todavía no representa la complejidad de la red cerebral por completo. A raíz de estas limitaciones, un nuevo modelo ha surgido utilizando las neuroesferas, que tiene un parecido más cercano al tejido cerebral. El presente protocolo describe el revestimiento de altas y bajas densidades de neuronas corticales e hipocampales mixtas aisladas del embrión de ratas embrionarias del día 14-16 de Sprague Dawley. Esto permite la generación de neuroesferas y cultivo de neuronas primarias a largo plazo como dos plataformas independientes para llevar a cabo más estudios. Este proceso es extremadamente simple y rentable, ya que minimiza varios pasos y reactivos que anteriormente se consideraban esenciales para el cultivo de neuronas. Este es un protocolo robusto con requisitos mínimos que se pueden realizar con resultados alcanzables y más utilizado para una diversidad de estudios relacionados con la neurociencia.

En este protocolo, se ha aclarado una estrategia simple en la que se obtienen densidades de chapado de células variables de dos plataformas de cribado neuronal diferentes. Figura 1A,B ilustra la adherencia de las células después de 4 h de chapado de las neuronas en células chapadas de alta y baja densidad, respectivamente. Al observar la correcta adherencia de las neuronas como se muestra en la Figura 1, el m...

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Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Aquí se presenta un protocolo para la generación espontánea de neuroesferas enriquecidas en células progenitoras neuronales a partir de neuronas chapadas de alta densidad. Durante el mismo experimento, cuando las neuronas se platean a una densidad más baja, el protocolo también resulta en cultivos prolongados de neuronas de rata primaria.

Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el desarrollo de neuroesferas a partir de neuronas mixtas primarias de hipocampo y cortical aisladas del embrión de rata E14-E16 Sprague Dawley, con el fin de ofrecer una plataforma robusta y de bajo costo para estudiar el efecto de varios conductores neuroterapéuticos. Como usted sabe, ese cerebro es una red compleja de neuronas asociadas con un gran número de células de apoyo. Para entender la función cerebral, a menudo la mayor parte de la investigación se reinicia a partir de experimentos in vitro, que involucra líneas celulares derivadas del linaje neural disponibles comercialmente.Sin embargo, estas líneas celulares son líneas celulares transformadas que sufren de variaciones genotípicas y fenotípicas. Para abordar estos problemas, el cultivo de neuronas primarias es el enfoque adecuado. Aquí, ilustramos un protocolo simple y rentable para cultivar neuronas primarias y construimos una plataforma de detección robusta para varias terapias neuronales.La principal ventaja de este protocolo es que con sólo modular las densidades de revestimiento celular, podemos mostrar dos plataformas de cultivo de neuronas en contraste donde la baja densidad conduce a un cultivo prolongado de neuronas primarias, y la alta densidad genera neuroesferas espontáneas. Tome dos placas de 24 pozos. Uno para alta densidad y otro para chapado de baja densidad.Transfiera 12 mm de cubreobjetos de vidrio estéril en las placas de 24 pozos. Vierta 300 microlitros de solución PDL en cada uno de los pozos de una manera que cubra completamente la superficie de toda la cubierta. Preparar la solución de PDL a una concentración de 0,1 mg/ml en agua desionizada.Envuelva las placas con láminas de aluminio para evitar el secado, y manténgalas en la incubadora de CO2 durante la noche. Al día siguiente, antes de enchapar, aspirar la solución PDL. Lavar correctamente con agua estéril durante dos o tres veces.A continuación, agregue el soporte de chapado y vuelva a colocar las placas en la incubadora hasta que estén enchapadas. Sacrifica una rata Sprague-Dawley embarazada E14-E16, haz un corte en forma de V en la zona abdominal usando fórceps estériles y un par de tijeras de extremo romo. Retire todos los fetos y colóquelos cuidadosamente en la placa de petri con solución fría de HBSS.Saque los embriones de los sacos embrionarios y lávelos cuidadosamente en un plato de petri separado en HBSS fresco y frío. Decapitar la cabeza con la ayuda de tijeras estériles. Transfiera los cabezales en las placas de petri estériles de 90 mm con HBSS frío.Bajo el microscopio estéreo, sostenga la cabeza de la región del hocico con los fórceps serrados estériles, y saque el cerebro cortando la piel y el cráneo abierto. Retire todas las meninges de los hemisferios y del cerebro medio sosteniendo el tronco encefálica. Retire cuidadosamente los hemisferios intactos, que se asemejan a las tapas de setas que contiene el hipocampo y la corteza.Recoger los hemisferios que contienen corteza e hipocampo intacto en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de medios de disociación. Permita que los tejidos recogidos se asienten y aspire el medio de disociación, dejando entre el cinco y el diez por ciento del medio en él. Una vez más, agregue 10 ml de medio de disociación fresca a él, y repita este paso dos veces.Añadir 4,5 ml de medio de disociación y 0,5 ml de solución de trippsina-EDTA. Guárdalo en la incubadora a 37 grados centígrados durante 20 minutos para que la digestión continúe. Aspirar el medio y lavar con 10 ml de medio de disociación y medio de chapado, consecutivamente.Resuspenderlos en 2,5 ml de medio de chapado. Conservar un plato estéril de 90 mm sobre la cubierta invertida del plato y verterlo en la base de un plato estéril de 90 mm. Valorar los tejidos digeridos en la base de la esquina del plato, utilizando la punta de pipeta de 1000 microlitros, con el fin de ocupar el menor volumen.Pasar la suspensión celular obtenida a través del colador celular de 70 micrómetros, excluyendo cualquier trozo de tejido. Determine la densidad de las células viables mediante la exclusión de tinte azul de tripano y cuente el número de celdas en un contador de celdas automatizado. Diluir el número de células obtenidas de manera que la placa 1,5 en 10 a la potencia de 5 células por ml para el revestimiento de alta densidad, y 20.000 células por ml para el revestimiento de baja densidad en dos tubos separados que contienen 30 ml de medio de chapado.Aspirar el medio de chapado previamente añadido y la placa 500 microlitros de células dispersas en medio de chapado en cada pozo. Después de eso, devuelva las placas a la incubadora durante cuatro horas. Cuatro horas después del enchapado, examine las células en busca de adherencia bajo el microscopio.Después de cuatro horas de chapado, tanto en placas de alta como de baja densidad, las neuronas muestran una buena adherencia a las placas. Sustituya el medio de cada pozo por 500 microlitros de medio de mantenimiento fresco, e incubarlo en una incubadora a 37 grados centígrados. Tenemos que cultivar estas neuronas chapadas a alta y baja densidad.Mientras que las neuronas chapadas de baja densidad se pueden utilizar para cultivos prolongados, hasta 30 días, cambiando el medio de mantenimiento dos veces por semana, las neuronas chapadas de alta densidad comienzan a generar espontáneamente neuroesferas, que vinieron día después de que mantuvimos en placa de fijación ultrabaja. Después de 24 horas de chapado, se observa que las neuronas chapadas de alta y baja densidad muestran una morfología saludable. Aquí se muestra una imagen de contraste de fase de las neuronas chapadas de baja densidad, cultivadas durante unos siete días.Las neuronas muestran morfología saludable, y se pueden mantener hasta 30 días con enrutamiento e interconexiones más vigorosas. El diagrama de barras aquí muestra alrededor del 90 por ciento de viabilidad de las neuronas chapadas de baja densidad incluso después de 30 días de cultivo, según lo determinado por el ensayo MTT. Las neuronas primarias aquí se han caracterizado por la inmunomancha con Tuj 1, un marcador de neuronas diferenciadas, y tau, un marcador de axones neuronales.La pureza de las neuronas se confirma por la ausencia de manchas en marcadores no neuronales GFAP para astrocitos y O4 para oligodendrocitos. En todos los estudios de caracterización, los núcleos se han teñido con Hoechst 33258. Aquí, las células de semillas de baja densidad se han teñido con marcador astrocítico GFAP y marcador neuronal Tuj 1 para comprobar la pureza del cultivo hasta siete días.Se observa que este protocolo apoya el crecimiento preferencial de las neuronas sobre los astrocitos como se indica a través del análisis cuantitativo. Los núcleos han sido manchados con Hoechst 33258. Del mismo modo, en las células sembradas de alta densidad, los astrocitos han sido manchados con GFAP y neuronas por Tuj 1.Aquí, en el análisis cuantitativo, alrededor del 17 por ciento de los astrocitos se observan en comparación con el 83 por ciento de las neuronas. Los núcleos han sido manchados con Hoechst 33258. Después de siete días, se observan espontáneamente múltiples neuroesferas en las neuronas de alta densidad.Alrededor del octavo al décimo día de cultivo, en las neuronas chapadas de alta densidad, las neuroesferas comienzan a formar grandes proyecciones y puentes que consisten en extensiones radiales de tipo glial. Las flechas negras indican el puente entre dos neuroesferas recién formadas. Se han realizado ensayos de células vivas y muertas en las neuroesferas durante 15 días.En la densa tinción de Calcein AM, sin absolutamente ninguna tinción de yoduro propidium, indica casi 100 por ciento de viabilidad de las neuroesferas en el cultivo. El gráfico de líneas aquí indica una expansión en el tamaño de las neuroesferas con el paso del número de días. Esta imagen demasiado manchada de la neuroesfera indica una rica población de células progenitoras neuronales a través de una mayor expresión de los marcadores NPC Nestin y Tuj 1.Las neuroesferas aquí muestran altas cantidades de astrocitos marcados por la fuerte expresión de GFAP, acompañados de una expresión aún mayor del marcador neuronal Tuj 1. Los núcleos han sido manchados con Hoechst 33258. Así que creo que nuestro protocolo es bastante emocionante e interesante, teniendo en cuenta el hecho de que desde una sola estrategia somos capaces de obtener dos plataformas: una 2-D y una 3-D.Y esta será una gran plataforma para la detección de diferentes pistas neuroterapéuticas. Así que supongo que es realmente útil para todos los neurocientíficos. También otro aspecto importante es que las neuroesferas en las que optamos son extremadamente ricas en células progenitoras neuronales, los PNJ.Y se pueden utilizar para diferenciarlos en neuronas y linajes no neuronales. Por lo tanto, siento que si, realmente, la gente puede dominar esta técnica tomando ayuda de este video, será realmente muy útil para todos. Gracias.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

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Investigación

Neurociencias

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

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Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

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Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

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