Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Vi tackar CSIR-IICB Animal Facility. G. D. tack ICMR, J. K. och V. G. tack DST Inspire, och D. M. tack DBT, Indien för deras Fellowships. S. G. Vänligen erkänner SERB (EMR/2015/002230) Indien för att ge finansiellt stöd.

Alla experimentella förfaranden som involverar djur godkändes av den institutionella djur etikkommittén vid CSIR-Indian Institute of kemisk biologi (IICB/AEC/möte/apr/2018/1).
1. reagens och förberedelse av media
<ol><li>Poly-D-lysin (PDL) lösning: Förbered PDL lösningar vid koncentrationer av 0,1 mg/mL i avjoniserat vatten och förvara i 4 ° c tills användning.</li>
	<li>Dissociation medium: till 1 L sterilt, filtrerat avjoniserat vatten, kombinera följande komponenter i respekti...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Detta protokoll beskriver att hur genom att förändra cell bordläggningen tätheter av primära nervceller, två variabla neuronala plattformar erhålls. Även om detta är en enkel metod, måste varje steg noggrant utföras för att uppnå önskat resultat. Andra tidigare metoder har antingen rapporterat långsiktiga primära neuron kulturer eller neurosphere kulturer. De flesta primära neuron kultur protokoll har involverat odling av hippocampus nervceller för 3-5 veckor, men de flesta har misslyckats, som nervcell...

Hjärnan är en intrikat krets av neuronala och icke-neuronala celler. I åratal har forskare försökt att få insikt i denna komplexa maskiner. För att göra det, neuroforskare initialt tillgred olika transformerade nervbaserade cellinjer för utredningar. Emellertid, oförmåga dessa klonala cellinjer att bilda starka synaptiska förbindelser och korrekt axoner eller dendriter har skiftat vetenskapligt intresse för primära neuron kulturer1,2. Den mest spännande aspekten av primär neuron kultur är att det skapar en möjlighet att observera och manipulera levande nervceller3. Dessutom är det mindre komplicerat jämfört med neurala vävnad, vilket gör det till en idealisk kandidat för att studera funktion och transport av olika neuronala proteiner. Nyligen har flera utvecklingar inom områdena mikroskopi, genomik och proteomik genererat nya möjligheter för neuroforskare att exploatera neuron kulturer4.
Primär kulturer har tillåtit neuroforskare att utforska molekylära mekanismer bakom neurala utveckling, analysera olika neurala signalering vägar, och utveckla en mer sammanhängande förståelse av Synapsis. Även om ett antal metoder har rapporterat kulturer från primära nervceller (främst från Hippocampus ursprung5,6,7), ett enhetligt protokoll med ett kemiskt definierat medium som möjliggör långsiktig kultur av nervceller är fortfarande behövs. Emellertid, nervceller klädd i en låg densitet är oftast observeras, som inte överlever långsiktiga, sannolikt på grund av bristen på trofiska stöd8 som tillhandahålls av angränsande nervceller och gliaceller. Vissa metoder har även föreslagit samtidig odling av den primära nervceller med gliaceller celler, varvid gliaceller används som en matar skikt9. Emellertid, gliaceller utgör en hel del problem på grund av deras överväxt, som ibland åsidosätter den neuronala tillväxten10. Därför, med tanke på de problem som ovan, en enklare och mer kostnadseffektiv primära neurala kultur protokoll krävs, som kan användas av både neurobiologer och neurokemister för utredningar.
En primär neuron kultur är i huvudsak en form av 2D-kultur och representerar inte plasticitet, rumslig integritet, eller heterogenitet i hjärnan. Detta har gett upphov till behovet av en mer trovärdig 3D-modell som kallas neurospheres11,12. Neurospheres presentera en ny plattform för neuroforskare, med en närmare likhet med den verkliga, in vivo hjärnan13. Neurospheres är icke-anhängare 3D-kluster av celler som är rika på neurala stamceller (NSCs), neurala progenitorceller (NPCs), nervceller, och astrocyter. De är en utmärkt källa för isolering av neurala stamceller och neurala progenitorceller, som kan användas för att studera differentiering till olika neuronala och icke-neuronala linjer. Återigen, variationer inom neurosphere kulturer produceras med hjälp av tidigare rapporterade protokollen utgör ett hinder för utformningen av en enhetlig neurosphere Culture Protocol14.
Detta manuskript presenterar ett protokoll där det är möjligt att generera både 2D-och 3D-plattformar genom alternerande cellplätering tätheter från en blandad kortikal och Hippocampus kultur. Det observeras att inom 7 dagar fritt flytande neurospheres erhålls från högdensitetspläterade neuroner isolerade från E14-E16 Sprague Dawley råtta embryo, som på ytterligare kultur, bilda broar och sammanlänkningar genom radiella Glial-liknande förlängningar. På samma sätt, i lågdensitetspläterade neuroner, en primär neuron kultur som kan upprätthållas i upp till 30 dagar erhålls genom att ändra underhålls mediet två gånger per vecka.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

Primär neuron kultur är en viktig teknik inom neurovetenskap. För att få djupare mekanistiska insikter i hjärnan, är det viktigt att ha en robust in vitro-modell som kan utnyttjas för olika neurobiologi studier. Även primära neuron kulturer (dvs., långsiktiga Hippocampus kulturer) har gett forskare med modeller, det ännu inte representerar komplexiteten i hjärnans nätverk helt. I kölvattnet av dessa begränsningar, en ny modell har dykt upp med hjälp av neurospheres, som bär en närmare likhet med hjärnvävnaden. Det nuvarande protokollet beskriver bordläggningen av höga och låga densiteter av blandade kortikala och Hippocampus nervceller isolerade från embryot från embryonala dag 14-16 Sprague Dawley råttor. Detta gör det möjligt för generering av neurospheres och långsiktig primär neuron kultur som två oberoende plattformar för att genomföra ytterligare studier. Denna process är mycket enkel och kostnadseffektiv, eftersom det minimerar flera steg och reagenser som tidigare bedömts vara väsentliga för neuron kultur. Detta är ett robust protokoll med minimala krav som kan utföras med uppnåeliga resultat och som ytterligare används för en mångfald av studier relaterade till neurovetenskap.

I det här protokollet har en enkel strategi klarlagts där densiteter för variabel cell beläggning från två olika neurala screening-plattformar erhålls. Figur 1a,B illustrerar adherencen av celler efter 4 h av plätering av neuronerna i hög-och lågdensitetspläterade celler, respektive. På observation av korrekt vidhäftning av nervceller som visas i figur 1, pläteringsmediet ersattes av underhålls med...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Presenteras här är ett protokoll för spontan generering av neurospheres berikas i neurala stamceller från högdensitetspläterade neuroner. Under samma experiment, när nervceller är klädd i en lägre densitet, protokollet resulterar också i långvariga primära råtta neuron kulturer.

Generering av Neurosfärer från blandade primära hippocampal och kortikala neuroner isolerade från E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Det övergripande målet med detta förfarande är att visa utvecklingen av neurosfärer från blandade primära hippocampus och när nervceller isolerade från E14-E16 Sprague Dawley råtta embryo, i syfte att erbjuda en robust och låg kostnad plattform för att studera effekten av olika neuroterapeutiska leder. Som ni vet, att hjärnan är ett komplext nätverk av nervceller i samband med stort antal stödjande celler. För att förstå hjärnans funktion, ofta de flesta av forskningen är återinitierad från in vitro-experiment, som innebär kommersiellt tillgängliga neurala härstamning härledda cellinjer.Denna cellinjer är dock transformerade cellinjer som lider av genotypiska och fenotypiska variationer. För att ta itu med dessa frågor, primära neuron kultur är den lämpliga metoden. Här illustrerade vi ett enkelt och kostnadseffektivt protokoll till kultur primära nervceller och byggt en robust screening plattform för olika neurala therapeutics.Den största fördelen med detta protokoll är att bara genom att modulera cellen plätering tätheter, vi kan visa upp två kontrasterande plattformar neuron kultur där låg densitet leder till långvarig primär neuron kultur, och hög densitet genererar spontana neurosfärer. Ta två 24-brunns plattor. En för högdensitet, och en annan för lågdensitetsplätering.Överför 12 mm sterila glasöverdrag i 24-brunnsplattorna. Häll 300 mikroliter av PDL-lösning i var och en av brunnarna på ett sätt som den helt täcker ytan på hela täckplattan. Bered PDL-lösning vid en koncentration av 0,1 mg/mL i avjoniserat vatten.Linda plattorna med aluminiumfolie för att förhindra torkning, och förvara den i CO2-inkubatorn över natten. Nästa dag, före plätering, aspirera PDL-lösningen. Tvätta ordentligt med sterilt vatten i två till tre gånger.Tillsätt sedan pläteringsmedia, och returnera plattorna till inkubatorn tills plätering. Offra en E14-E16 tidsbefriad gravid Sprague-Dawley råtta, Gör en V-formad snitt i buken med hjälp av sterila tövråkar och ett par trubbiga-end sax. Ta bort alla foster och placera dem försiktigt på petriplattan med kall HBSS-lösning.Ta ut embryona ur de embryonala säckarna och tvätta dem försiktigt i en separat petriskål i färsk, kall HBSS. Halshugg huvudet med hjälp av steril sax. Överför huvudena i de sterila petrisplattorna på 90 mm med kalla HBSS.Under stereomikroskopet håller du huvudet från nosregionen med de sterila tandade kraftknimerna och tar ut hjärnan genom att skära upp huden och skallen. Ta bort alla hjärnhinnorna från halvkloten och mellanhjärnan genom att hålla i hjärnstammen. Försiktigt bort de intakta halvkloten, som liknar svamp mössor som innehåller hippocampus och cortex.Samla hemisfärerna som innehåller cortex och intakt hippocampus i en 15 mL koniska röret som innehåller 10 mL dissociation media. Låt de insamlade vävnaderna att slå sig ner, och aspirera dissociation mediet, lämnar fem till tio procent av medium i den. Återigen, tillsätt 10 mL färsk dissociation medium till det, och upprepa detta steg två gånger.Tillsätt 4,5 mL dissociationsmedium och 0,5 mL trypsin-EDTA-lösning. Håll den i inkubatorn vid 37 grader Celsius i 20 minuter för matsmältningen att fortsätta. Aspirera mediet och tvätta med 10 mL dissociation medium och plätering medium, i följd.Resuspend dem i 2,5 mL av plätering medium. Håll en 90 mm steril skål över det inverterade locket på skålen och häll den i basen av 90 mm steril maträtt. Titrera de smälta vävnaderna i hörnbasen på skålen, med 1000 mikroliterpipets, så att de upptar minst volym.För den erhållna cellupphängningen genom 70 mikrometercellsilen, exklusive eventuella vävnadsbitar. Bestäm densiteten av livskraftiga celler med hjälp av trypan blå färgämne uteslutning, och räkna antalet celler i en automatiserad cellräknare. Späda ut antalet celler som erhållits på ett sätt så att plattan 1.5 till 10 till effekten av 5 celler per mL för högdensitetsplätering, och 20, 000 celler per mL för lågdensitetsplätering i två separata rör som innehåller 30 mL pläteringsmedium.Aspirera den tidigare tillsatta plätering medium och platta 500 mikroliter av celler spridda i plätering medium i varje brunn. Därefter återlämnar du plåtarna till inkubatorn i fyra timmar. Fyra timmar efter plätering, undersöka cellerna för följsamhet under mikroskopet.Efter fyra timmars plätering, i både hög och låg densitet plattor, nervceller visar god följsamhet till plattorna. Byt ut mediet i varje brunn med 500 mikroliter av färskt underhållsmedium, och inkubera det i en inkubator vid 37 grader Celsius. Vi måste odla dessa nervceller pläterade för vid hög och låg densitet.Medan de lågdensitetspläterade nervcellerna kan användas för långvariga kulturer, upp till 30 dagar, genom att ändra underhållsmediet två gånger i veckan, börjar de högdensitetspläterade nervcellerna att spontant generera neurosfärer, som kom dagen efter att vi upprätthållit i ultralåg fästplatta. Efter 24 timmars plätering observeras både hög- och lågdensitetspläterade nervceller för att visa hälsosam morfologi. En faskontrast bild av låg densitet pläterade nervceller, odlade i ungefär sju dagar, visas här.Nervcellerna visar hälsosam morfologi, och kan upprätthållas upp till 30 dagar med mer kraftfull routing och sammanlänkningar. Baren diagrammet här visar cirka 90 procent lönsamheten för lågdensitetspläterade nervceller även efter 30 dagars kultur, som bestäms av MTT analys. Den primära nervceller här har kännetecknats av immunfärgning med Tuj 1, en markör för differentierade nervceller, och tau, en markör för neuronala axoner.Renheten i nervcellerna bekräftas av frånvaron av färgning i icke-neuronala markörer GFAP för astrocyter och O4 för oligodenadrocyter. I alla karakteriseringsstudier har kärnor färgats med Hoechst 33258. Här har de lågdensitetsfröerade cellerna färgats med astrocytisk markör GFAP och neuronal markör Tuj 1 för att kontrollera renheten i kulturen upp till sju dagar.Det observeras att detta protokoll stöder den förmånliga tillväxten av nervceller över astrocyter som anges genom den kvantitativa analysen. Kärnor har färgats med Hoechst 33258. På samma sätt, i de högdensitetsfröerade cellerna, har astrocyterna färgats med GFAP och nervceller av Tuj 1.Här, i den kvantitativa analysen, runt 17 procent astrocyter observeras jämfört med 83 procent nervceller. Kärnorna har färgats med Hoechst 33258. Efter sju dagar observeras spontant flera neurospheres i de högdensitetsnerveuron.Runt åttonde till tionde dagen av kultur, i hög densitet pläterade nervceller, neurosfärer börjar bilda stora prognoser och broar som består av radiella glia-liknande förlängningar. De svarta pilarna indikerar bron mellan två nybildade neurosfärer. Levande och döda cell assay har utförts på neurospheres i 15 dagar.I tät Calcein AM färgning, med absolut ingen propidium iodid färgning, indikerar nästan 100 procent livskraft neurosfärerna i kultur. Linjegrafen indikerar här en expansion i storleken på neurosfärerna med passagen av antal dagar. Denna alltför färgade bilden av neurosfären indikerar en rik population av neurala stamceller genom ökat uttryck för NPC markörer Nestin och Tuj 1.Neurospheres här visar höga mängder av astrocyter präglas av det starka uttrycket av GFAP, tillsammans med en ännu högre uttryck för neuronal markör Tuj 1. Kärnorna har färgats med Hoechst 33258. Så jag tror att vårt protokoll är ganska spännande och intressant, med tanke på att från en enda strategi vi har möjlighet att få två plattformar: en 2-D och en 3-D.Och detta kommer att bli en bra plattform för screening olika neuroterapeutiska spår. Så jag antar att det är verkligen verkligen användbart för alla neuroforskare. En annan viktig aspekt är också att de neurosfärer vi väljer är extremt rika på neurala stamceller, NPCs.Och de kan användas för att differentiera dem till nervceller och icke-neuronala härstamningar. Så, jag känner om, verkligen, människor kan behärska denna teknik genom att ta hjälp från den här videon, kommer det att bli riktigt riktigt användbart för alla. Tack.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generering av neuronala stamceller från kasserade mänskliga foster Bark-Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Fastställande av mitokondriell membranpotential och reaktiva syreradikaler i Live Rat kortikala Neuroner

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering och kultur hippocampusneuroner från Prenatal möss

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

En metod för KNUTIG Ganglia Injektion i Sprague-Dawley-råtta

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...