Name: generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo
Uploaded: 2019-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

CSIR-IICB hayvan tesisine teşekkür ederiz. G. D. teşekkür ICMR, J. K. ve V. G. teşekkür DST Inspire, ve D. M. teşekkür DBT, Hindistan onların burs için. S. G. mali destek sağladığı için Serb (EMR/2015/002230) Hindistan'ı kabul eder.

Hayvanlarla ilgili tüm deneysel prosedürler CSIR-Indian Institute of Chemical Biology Kurumsal Hayvan Etik Komitesi (IICB/AEC/Meeting/Npr/2018/1) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktif ve ortam hazırlama
<ol><li>Poli-D-lizin (PDL) çözeltisi: PDL solüsyonları deiyonize suda 0,1 mg/mL konsantrasyonlarda hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Ayrıştırma ortamı: 1 L steril, filtrelenmiş deiyonize su, ilgili konsantrasyonlarda aşağıdaki bileşenleri birle?...

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Masters, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+misidentification:+the+beginning+of+the+end.">Cell line misidentification: the beginning of the end.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).</li><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).</li><li>Geschwind, D. H., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience+in+the+era+of+functional+genomics+and+systems+biology.">Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology.</a> Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density,+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture.">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Rat+Hippocampal+Neurons+at+Low+Density+in+Serum-Free+Medium:+Combination+of+the+Sandwich+Culture+Technique+with+the+Three-Dimensional+Nanofibrous+Hydrogel+PuraMatrix.">Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).</li><li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture.">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209 (4458), 809-810 (1980).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+of+Neuronal+Growth+Over+Glial+Growth+and+Guidance+of+Optic+Nerve+Axons+by+Vertical+Nanowire+Arrays.">Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+Insights+biology+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).</li><li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culture+of+Neural+Stem+Cells.">The Culture of Neural Stem Cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li><li>Pradhan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-Regenerative+Choline-Functionalized+Injectable+Graphene+Oxide+Hydrogel+Repairs+Focal+Brain+Injury.">Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury.</a> ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).</li><li>Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+immunocytochemical+characterization+of+primary+neuronal+cultures+from+adult+rat+brain:+Differential+expression+of+neuronal+and+glial+protein+markers.">Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).</li><li>Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Oligodendroglial+Populations+in+Mouse+Demyelinating+Disease+Using+Flow+Cytometry:+Clues+for+MS+Pathogenesis.">Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li><li>Osterberg, N., Roussa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+neurospheres+generated+from+mouse+ventral+rostral+hindbrain.">Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain.</a> Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li><li>Qu, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5, 3449 (2014).</li><li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+neurons+retain+the+capacity+to+generate+axons+from+dendrites.">Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites.</a> Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).</li><li>Theocharatos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Progenitor+Cell+Proliferation+and+Neuronal+Differentiation+in+Enteric+Nervous+System+Neurospheres.">Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres.</a> PLoS ONE. 8 (1), (2013).</li><li>Binder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Neurospheres+Are+Not+Specific+to+Neural+Crest+Cultures:+Implications+for+Neural+Stem+Cell+Therapies.">Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).</li><li>Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+Reliability+and+Throughput+of+Neurosphere+Culture+on+Hydrogel+Microwell+Arrays.">Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays.</a> Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).</li><li>Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+Neurospheres:+Dynamics+of+Neural+Progenitor/Stem+Cell+Aggregation+Probed+Using+an+Optical+Trap.">Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li></ol>

Bu protokol, primer nöronların hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek iki değişken nöronal platformun nasıl elde edildiğini açıklar. Bu basit bir yöntem olmasına rağmen, istenilen sonuçları elde etmek için her adım titizlikle yapılmalıdır. Diğer önceki yöntemler ya uzun vadeli primer nöron kültürleri veya nörosfer kültürleri bildirilmiştir. En birincil nöron kültür protokolleri için hipokampal nöronların kültürdahil 3-5 hafta, ama çoğu başarısız oldu, nöronlar ölmek ve...

Beyin nöronal ve non-nöronal hücrelerin karmaşık bir devre olduğunu. Yıllardır, bilim adamları bu karmaşık makine hakkında bilgi edinmeye çalışıyorlar. Bunu yapmak için, nörologlar başlangıçta çeşitli dönüştürülmüş sinir tabanlı hücre hatları soruşturmalar için başvurdu. Ancak, güçlü sinaptik bağlantılar ve uygun akson veya dendritler oluşturmak için bu klonal hücre hatlarıyetersizlik birincil nöron kültürleri1bilimsel ilgi kaymıştır1 ,2. Birincil nöron kültürünün en heyecan verici yönü gözlemlemek ve yaşayan nöronları işlemek için bir fırsat oluştururolmasıdır 3. Ayrıca, nöral doku ile karşılaştırıldığında daha az karmaşıktır, hangi fonksiyon ve çeşitli nöronal proteinlerin taşınması için ideal bir aday yapar. Son zamanlarda, mikroskopik, genomik ve proteomik alanlarında çeşitli gelişmeler nöron kültürleri yararlanmak için nörologlar için yeni fırsatlar yarattık4.
Birincil kültürler nörologların nöral gelişimin arkasındaki moleküler mekanizmaları keşfetmelerine, çeşitli sinirsel sinyal yollarını analiz etmelerine ve sinaps hakkında daha tutarlı bir anlayış geliştirmelerine olanak sağlamıştır. Yöntemlerin bir dizi birincil nöronlar kültürleri rapor olmasına rağmen (çoğunlukla hipokampal kökenli5,6,7), nöronların uzun vadeli kültür sağlayan kimyasal olarak tanımlanmış bir orta ile birleşik bir protokol hala gerekli. Ancak, düşük yoğunluklu kaplama nöronlar en sık gözlenir, hangi uzun vadeli hayatta değil, muhtemelen komşu nöronlar ve glial hücreler tarafından sağlanan trofik destek eksikliği nedeniyle8. Bazı yöntemler bile glial hücreleri ile birincil nöronların co-kültüre önerdi, glial hücreler bir besleyici tabaka olarak kullanılan nerede9. Ancak, glial hücreler bazen nöronal büyüme geçersiz kılınan aşırı büyüme nedeniyle bir çok sorun teşkil10. Bu nedenle, yukarıdaki sorunlar göz önüne alındığında, daha basit ve daha uygun maliyetli birincil nöral kültür protokolü gereklidir, hangi araştırmalar için hem nörobiyologlar ve nörokimyacılar tarafından kullanılabilir.
Birincil nöron kültürü aslında 2D kültür biçimidir ve plastisite temsil etmez, mekansal bütünlük, ya da beynin heterojenlik. Bu nörosferler denilen daha inandırıcı bir 3D modeli için ihtiyaç doğurdu11,12. Nörosferler nörologlar için yeni bir platform mevcut, gerçek daha yakın bir benzerlik ile, in vivo beyin13. Nörosferler nöral kök hücreler (NSCs), nöral progenitor hücreleri (NPCs), nöronlar ve astrositler açısından zengin olan non-adherent 3D hücre kümeleridir. Onlar nöral kök hücreleri ve nöral progenitor hücrelerinizolasyon için mükemmel bir kaynak, çeşitli nöronal ve non-nöronal soylara farklılaşma çalışma için kullanılabilir. Yine, daha önce bildirilen protokoller kullanılarak üretilen nörosfer kültürleri içinde değişkenlik birleşik bir nörosfer kültür protokolü formülasyonu için bir engel sunuyor14.
Bu el yazması, karışık kortikal ve hipokampal kültürden hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek hem 2D hem de 3Boyutlu platformlar oluşturmanın mümkün olduğu bir protokol sunar. 7 gün içinde serbest yüzen nörosferlerin E14-E16 Sprague Dawley sıçan embriyosundan izole edilen yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan elde edildiği ve daha fazla kültür üzerine radyal glial benzeri uzantılar aracılığıyla köprüler ve ara bağlantılar oluşturduğu gözlenmiştir. Benzer şekilde, düşük yoğunluklu kaplama nöronlarda, haftada iki kez bakım ortamı değiştirilerek 30 güne kadar muhafaza edilebilen birincil nöron kültürü elde edilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-GFAP</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB7260</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti- Nestin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB92391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-O4</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tau</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:174px;">AB76128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Anti-Tuj1</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Serum Free Supplement&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:174px;">Countess II FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:174px;">Galaxy 170 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">SDFCL</td>
			<td style="width:174px;">38450-K05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Ethanol</td>
			<td style="width:183px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:174px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:174px;">IX83 Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">47608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax-I Supplement</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG Fluor</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP1814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">GtXMs IgG (H+L)</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">AP124C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">16826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:174px;">382061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td style="width:183px;">HiMedia</td>
			<td style="width:174px;">RM10674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:183px;">Rankem</td>
			<td style="width:174px;">H0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Laminar Hood</td>
			<td style="width:183px;">BioBase</td>
			<td style="width:174px;">BBS-V1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Eagle&#8217;s with Earle&#8217;s BSS&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:174px;">M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Victory Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:207px;">Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)</td>
			<td style="width:183px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:174px;">353047, 352350 and 3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">90 mm Petridishes</td>
			<td style="width:183px;">Himedia</td>
			<td style="width:174px;">PW001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:174px;">A.003.E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:174px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qualigem</td>
			<td style="width:174px;">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Merck</td>
			<td style="width:174px;">MI6M562328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Stereomicrosope</td>
			<td style="width:183px;">Dewinter</td>
			<td style="width:174px;">Zoomstar Model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:183px;">SRL</td>
			<td style="width:174px;">2020130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">0.25 % Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:174px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of neurospheres from mixed primary hippocampal and cortical neurons isolated from e14-e16 sprague dawley rat embryo

Birincil nöron kültürü nörobilim alanında önemli bir tekniktir. Beyne daha derin mekanik anlayışlar elde etmek için, çeşitli nörobiyoloji çalışmaları için istismar edilebilir sağlam bir in vitro modeli olması esastır. Birincil nöron kültürleri (yani, uzun vadeli hipokampal kültürler) modelleri ile bilim adamları sağlamıştır rağmen, henüz tamamen beyin ağının karmaşıklığını temsil etmez. Bu sınırlamaların ardından, beyin dokusuna daha yakın bir benzerlik taşıyan nörosferler kullanılarak yeni bir model ortaya çıkmıştır. Bu protokol, embriyonik gün 14-16 Sprague Dawley sıçanlarının embriyosundan izole edilmiş karışık kortikal ve hipokampal nöronların yüksek ve düşük yoğunluklarının kaplamasını tanımlar. Bu nörosferler ve uzun vadeli birincil nöron kültürünün üretimi için iki bağımsız platformlar olarak daha fazla çalışma yürütmek için izin verir. Bu süreç son derece basit ve uygun maliyetli, birkaç adım ve reaktifler daha önce nöron kültürü için gerekli kabul en aza indirir gibi. Bu, ulaşılabilen sonuçlarla yapIlebilen ve nöroloji ile ilgili çeşitli çalışmalarda daha fazla kullanılabilen en az gereksinime sahip sağlam bir protokoldür.

Bu protokolde, iki farklı nöral tarama platformundan değişken hücre kaplama yoğunluklarının elde edildiği basit bir strateji ortaya çıkarılmıştır. Şekil 1A,B yüksek ve düşük yoğunluklu kaplamalı hücrelerde nöronların kaplama 4 saat sonra hücrelerin yapışmasını göstermektedir, sırasıyla. Şekil1'de gösterildiği gibi nöronların uygun yapışmasını gözlemleyerek, kaplama ortam...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo at JoVE.com

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli nöroterapötik yol ların etkisini incelemek için sağlam ve düşük maliyetli bir platform sunmak amacıyla, E14-E16 Sprague Dawley sıçan embriyosundan izole edilen karışık primer hipokampal ve kortikal nöronlardan nörosferlerin gelişimini göstermektir. Bildiğiniz gibi, bu beyin çok sayıda destekleyici hücreyle ilişkili karmaşık bir nöron ağıdır. Beyin fonksiyonlarını anlamak için, genellikle araştırmanın çoğu, ticari olarak mevcut nöral soy hücre hatları içeren in vitro deneyler, yeniden başlatılır.Ancak, bu hücre çizgileri genotipik ve henotypic varyasyonları muzdarip hücre hatları dönüştürülür. Bu sorunları gidermek için, birincil nöron kültürü uygun bir yaklaşımdır. Burada, kültür birincil nöronlar için basit ve uygun maliyetli bir protokol resimli ve çeşitli nöral terapötikler için sağlam bir tarama platformu inşa.Bu protokolün en büyük avantajı, sadece hücre kaplama yoğunluklarını modüle ederek, düşük yoğunluklu ların uzun süreli birincil nöron kültürüne yol açtığı ve yüksek yoğunluklu spontan nörosferler ürettiği iki zıt nöron kültür platformlarını sergileyebiliyor olmamızdır. İki tane 24 kuyu tabak al. Biri yüksek yoğunluklu kaplama için, diğeri de düşük yoğunluklu kaplama için.24 kuyulu plakalarda 12 mm steril cam kapaklı dudak aktarın. Kuyuların her birine 300 mikrolitre PDL çözeltisi dökün. Deiyonize suda 0.1 mg/mL konsantrasyonda PDL çözeltisini hazırlayın.Kurutmayı önlemek için plakaları alüminyum folyolarla sarın ve bir gecede CO2 kuluçka makinesinde saklayın. Ertesi gün, kaplama önce, PDL çözeltisi aspire. Steril suile 2-3 kez iyice yıkayın.Sonra kaplama medya ekleyin ve kaplama kadar kuvöz plakaları iade edin. Kurban bir E14-E16 zamanlı hamile Sprague-Dawley sıçan, steril forceps ve künt uçlu makas bir çift kullanarak karın bölgesinde V şeklinde kesim olun. Tüm fetusları çıkarın ve soğuk HBSS çözeltisi ile petri plakaüzerine dikkatlice yerleştirin.Embriyoları embriyonik keselerden alın ve taze, soğuk HBSS'de ayrı bir petri kabında dikkatlice yıkayın. Steril makas yardımıyla başının kafasını koparın. Soğuk HBSS ile steril 90 mm petri plakalarda kafaları aktarın.Stereo mikroskop altında, steril tırtıklı forceps ile prout bölgeden baş tutun ve deri ve kafatası açık keserek beyin çıkarmak. Beyin sapını tutarak hemisfer ve orta beyindeki tüm menenjleri çıkarın. Dikkatle hipokampus ve korteks içeren mantar kapakları benzeyen, bozulmamış hemisfer kaldırın.10 mL dissosyasyon ortamı içeren 15 mL konik tüpte korteks ve bozulmamış hipokampus içeren hemisferleri toplayın. Toplanan dokuların yerleşmesine izin verin ve ayrışma ortamını aspire edin, içinde ortamın %5-10'unu bırakarak. Yine, 10 mL taze dissociation orta ekleyin ve bu adımı iki kez tekrarlayın.4,5 mL dissosilasyon ortave 0,5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Sindirimin devam etmesi için 37 derecede kuvözde 20 dakika bekletin. Orta aspire ve ayrışma orta ve kaplama orta 10 mL ile yıkama, ardışık.2,5 mL kaplama orta onları yeniden askıya alın. Yemeğin ters kapağının üzerinde 90 mm steril bir çanak tutun ve 90 mm steril çanak tabanına dökün. En az hacimli olacak şekilde 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak yemeğin köşe tabanındaki sindirilmiş dokuları titre edin.Elde edilen hücre süspansiyonu 70 mikrometre hücre süzgecinden geçirin, doku parçaları hariç. Trypan mavi boya hariç tutma kullanarak canlı hücrelerin yoğunluğunu belirleyin ve otomatik hücre sayacındaki hücre sayısını sayın. Yüksek yoğunluklu kaplama için mL başına 5 hücrenin gücüne 1,5'i 10'a, düşük yoğunluklu kaplama için ise 30 mL kaplama lı iki ayrı tüpte düşük yoğunluklu kaplama için 20.000 hücreye kadar 10'a kadar seyreltin.Aspire daha önce eklenen kaplama orta ve plaka hücrelerin in 500 mikrolitre her kuyuda kaplama ortamda dağınık. Ondan sonra, plakaları dört saat boyunca kuvöze geri ver. Kaplamadan dört saat sonra, hücreleri mikroskop altında yapışma için inceleyin.Kaplama dört saat sonra, hem yüksek hem de düşük yoğunluklu plakalar, nöronlar plakaları iyi yapışma gösterir. Her kuyudaki ortamı 500 mikrolitre taze bakım ortamıyla değiştirin ve 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesine yatırın. Bu nöronların yüksek ve düşük yoğunluklu olması için kültür ümüz var.Düşük yoğunluklu kaplama nöronlar uzun kültürler için kullanılabilir iken, kadar 30 gün, haftada iki kez bakım ortamı değiştirerek, yüksek yoğunluklu kaplama nöronlar kendiliğinden nörosferler üretmeye başlar, biz ultra-düşük eki plaka muhafaza sonra gün geldi. Kaplama 24 saat sonra, hem yüksek ve düşük yoğunluklu kaplama nöronlar sağlıklı morfoloji görüntülemek için gözlenmektedir. Düşük yoğunluklu kaplama nöronların faz kontrast görüntüsü, yaklaşık yedi gün boyunca kültürlü, burada görüntülenir.Nöronlar sağlıklı morfoloji görüntüler ve daha güçlü yönlendirme ve ara bağlantılarla 30 güne kadar korunabilir. Buradaki çubuk diyagramı, MTT analizi tarafından belirlenen 30 günlük kültürden sonra bile düşük yoğunluklu kaplamanların yaklaşık yüzde 90 canlılığını gösteriyor. Birincil nöronlar burada Tuj ile immünboyama ile karakterize edilmiştir 1, farklılaşmış nöronların bir belirteç, ve tau, nöronal aksonların bir belirteç.Nöronların saflığı astrositler için nöronal belirteçler GFAP ve oligodendrocytes için O4 boyama yokluğu ile doğrulanır. Tüm karakterizasyon çalışmalarında çekirdekler Hoechst 33258 ile boyanmış. Burada, düşük yoğunluklu tohumlu hücreler yedi güne kadar kültürün saflığını kontrol etmek için astrositik marker GFAP ve nöronal marker Tuj 1 ile boyanmıştır.Bu protokolün kantitatif analizde belirtildiği gibi nöronların astrositler üzerinde tercihli büyümesini desteklediği görülmektedir. Çekirdekler Hoechst 33258 ile lekelenmiştir. Benzer şekilde, yüksek yoğunluklu tohumlu hücrelerde, astrositler Tuj 1 tarafından GFAP ve nöronlar ile boyanmış.Burada, kantitatif analizde, yaklaşık yüzde 17 astrosit, %83 nöronla karşılaştırıldığında gözlenmektedir. Çekirdekler Hoechst 33258 ile lekelenmiştir. Yedi gün sonra, spontan yüksek yoğunluklu nöronlarda birden fazla nörosfer oluşan gözlenir.Kültürün sekizinci ila onuncu günü, yüksek yoğunluklu kaplama nöronların, nörosferler radyal glial benzeri uzantıları oluşan büyük projeksiyonlar ve köprüler oluşturmaya başlar. Siyah oklar yeni oluşmuş iki nörosfer arasındaki köprüyü gösteriyor. Canlı ve ölü hücre tnonu 15 gündür nörosferlerde yapılıyor.Yoğun Calcein boyama, kesinlikle hiçbir propidium iyodür boyama ile, kültürde nörosferlerin neredeyse yüzde 100 canlılık gösterir. Buradaki çizgi grafiği, gün sayısının geçişiyle birlikte nörosferlerin büyüklüğünde bir genişleme olduğunu gösteriyor. Nörosferin bu aşırı lekeli görüntü NPC belirteçleri Nestin ve Tuj 1 artan ifade yoluyla nöral progenitor hücrelerinin zengin bir nüfus gösterir.Nörosferler burada astrositlerin yüksek miktarda GFAP güçlü ifade ile işaretlenmiş göstermek, nöronal marker Tuj daha yüksek bir ifade eşliğinde 1. Çekirdekler Hoechst 33258 ile lekelenmiştir. Bu yüzden protokolümüzün oldukça heyecan verici ve ilginç olduğunu düşünüyorum, tek bir stratejiden iki platform elde edebildiğimiz gerçeğini göz önünde bulundurursak: biri 2-B ve bir 3-B.Ve bu farklı nöroterapötik parça tarama için harika bir platform olacak. Sanırım tüm nörologlar için gerçekten yararlı. Ayrıca bir başka önemli yönü biz tercih nörosferler nöral progenitor hücreleri açısından son derece zengin olmasıdır, NPCs.Ve onları nöronlar ve nöronal olmayan soylara ayırmak için kullanılabilirler. Bu yüzden, eğer insanlar bu videodan yardım alarak bu teknikte ustalayabiliyorsa, herkes için gerçekten yararlı olacağını hissediyorum. Teşekkürler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitokondrial Membran Potansiyeli ve Reaktif Oksijen Türleri Canlı Rat Kortikal nöronlar Belirlenmesi

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Sprague-Dawley Sıçan nodoz Ganglionlar Enjeksiyon Bir Yöntem

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...