Name: purification of platelets from mouse blood
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Platelets from Mouse Blood at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en opstartsfinansiering af Cincinnati children's Research Foundation og et University of Cincinnati pilot translational Grant til M.N. Vi vil gerne takke Cincinnati children's Hospital Research flow cytometry Core for deres tjenester.

Mus blodindsamling bør gennemføres med passende institutionel dyrepasning og brug udvalg godkendelse.
Bemærk: Trombocytrensnings protokollen er beskrevet i et flowdiagram i figur 1.
1. indsamling af blod
<ol><li>Der tilsættes 25 μL 3,2% natriumcitrat (pH 7,2) som antikoagulerende og 0,4 mM Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) i et polypropylen-rør.</li>
	<li>
Der opsamles ca. 200 μL blod fra C57BL/6-musen ved hjælp ...

<ol>
	<li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation.">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li><li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte:+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation.">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li><li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+signaling+cells+in+the+immune+continuum.">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li><li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+platelets+and+PBMC:+New+evidence+in+wound+healing.">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li><li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall.">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li><li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets'+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock.">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li><li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis.">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li><li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+&amp;#34;first+responders&amp;#34;+in+wound+response,+cancer,+and+metastasis.">Platelet &amp;#34;first responders&amp;#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li><li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection.">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li><li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood.">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).</li><li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new,+rapid,+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood.">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li><li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo.">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li><li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nycodenz:+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium.">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li><li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge.">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li><li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice.">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function.">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li><li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease.">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li><li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic/severe+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li><li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection,+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide.">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li><li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+murine+platelet+structure,+function,+assays,+and+genetic+alterations.">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li><li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway.">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li></ol>

Almindeligvis isoleres blodpladerne ved centrifugering med lav hastighed, hvilket giver blodpladerigt plasma, der indeholder et betydeligt antal blodlegemer, cellulære rester og plasmaproteiner, som kan forstyrre de biokemiske og fysiologiske analyser og behov yderligere rensning21. Derfor er det vigtigt at bruge en hurtig og enkel metode, som kan give rene blodplader uden større forurenende stoffer. Den protokol, der præsenteres her beskriver rensning af blodplader fra muse blod ved hjælp af ...

Trombocytter er en bestanddel af blod, der fungerer som en igangsætter af blodpropper som reaktion på skader i blodkar. De samles på stedet for skade til at sætte fartøjet væg1. Trombocytter er anucleate fragmenter af cytoplasma afledt af megakaryocytter af knoglemarv under indflydelse af trombopoietin og komme ind i cirkulation2. De betragtes som metabolisk aktive og i stand til at sensing ekstracellulære miljø ved at aktivere intracellulære signalering kaskader, der resulterer i trombocytspredning, aggregering, og hæmostatiske stik formation1,3. Udover hæmostase/trombose og sårheling4, spiller blodpladerne en vigtig rolle i Host inflammatoriske reaktioner, angiogenese, og metastatis3,5,6,7, 8. den er
Blodplader renses fra blodet for at studere deres biokemiske og fysiologiske egenskaber, som bør være fri for andre blodkomponenter. Da røde blodlegemer (RBC) og hvide blodlegemer (WBC) indeholder signifikant mere RNA og proteiner end blodplader9,10, tilstedeværelsen af selv et lille antal af disse celler kan forstyrre transkriptomic og proteomiske analyser af RNA proteiner afledt af blodplader. Vi konstaterede, at rensede blodplader aktiveret med Trombin binde antistof såsom anti-GPIIb/IIIa (JON/A) og anti-P-selectin mere effektivt end fuldblod plader.
Da trombocytterne er skrøbelige, er det vigtigt at behandle prøverne så mildt som muligt. Hvis trombocytterne er aktiveret, frigiver de deres granuler indhold og i sidste ende nedbrydes. Derfor, for at holde trombocytternes funktionelle egenskaber intakt, er det vigtigt at opretholde trombocytaggregation under isolation. Flere protokoller har beskrevet isolation af blodplader fra Human, hund, rotte, og ikke-menneskelige primat ved forskellige metoder1,10,11,12. Nogle af de metoder, der kræver flere trin såsom indsamling af trombocyttal-rige plasma ved centrifugering, filtrering ved separation kolonne, negativ udvælgelse af blodplader med RBC-og WBC-specifikke antistof konjugeret til magnetiske perler, og så videre, som er tidskrævende og kan forringe blodpladerne og deres indhold.
Ford og hans kolleger beskrev blodplade rensning fra humant blod ved hjælp af Iohexol medium11. Denne metode bruger en lignende volumen af blodprøve og medium under rensningen. Da mennesker giver en højere volumen af blod, er det relativt let at rense trombocytterne.
Iohexol er et universelt densitets gradient inert medium, der er frit opløseligt i vand og anvendes i fraktionering af nukleinsyrer, proteiner, polysaccharider og nucleoproteiner13,14. Det har lav osmolalitet og er giftfri, hvilket gør det til et ideelt medium til rensning af intakte levende celler11. Det er et ikke-partikel medium; Derfor kan fordelingen af celler i en gradient bestemmes ved hjælp af hemocytometer, flow cytometer eller spektrofotomometer. Det forstyrrer ikke det meste af den enzymatiske eller kemiske reaktion af cellerne eller cellulære fragmenter efter fortynding.
Musen tjener som en vigtig dyremodel for mange menneskelige sygdomme15,16,17,18. Der er et par udgivne artikler, der beskriver rensning af muse plader19,20. Men, musen giver en relativt mindre volumen af blod, hvilket gør det vanskeligt at rense blodplader. Hvis den samme lille mængde gradient medium og blodprøver anvendes, kan trombocytlaget ikke klart adskilles fra RBC-WBC-lag efter centrifugering. I denne artikel, vi har beskrevet en hurtig og enkel metode til mus trombocytoprensning med tre-fold mere Iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volumen og lav hastighed centrifugering. Vi har også aktiveret de rensede blodplader med Trombin og undersøgt deres kvalitet med flow cytometri og mikroskopi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>17-0626-82</td>
			<td>Platelets activation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-166</td>
			<td>Tube for centifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS DIVA software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Tubes for flow cytomtery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Ingredient for staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat anti-mouse CD41</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553848</td>
			<td>Platelets marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo, Inc.</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-34-0001</td>
			<td>Prevent platelet clot formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit Capillary tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>Blood collection capillary tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Blood cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td>Cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Use to Anesthetize mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Olympus CKX41)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz (Histodenz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td>Gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE rat anti-mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561087</td>
			<td>WBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557853</td>
			<td>RBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-1A</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 1000 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-2C</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffured saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td>Buffer for washing and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Physiological saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-688-26</td>
			<td>Anti-coagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Wash and dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>Swinging bucket rotor centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Enzyme Research Laboratoty</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td>Platelet activation agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td>Buffer for Nycodenz medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of platelets from mouse blood

Blodplader renses fra fuldblod for at studere deres funktionelle egenskaber, som bør være fri for røde blodlegemer (RBC), hvide blodlegemer (WBC), og plasmaproteiner. Vi beskriver her rensning af blodplader fra muse blod ved hjælp af tre gange mere Iohexol gradient medium i forhold til blodprøve volumen og centrifugering i en svingende skovl rotor ved 400 x g i 20 min ved 20 °c. Genindvinding/udbytte af de rensede trombocytter var 18,2-38,5%, og de rensede blodplader var i hviletilstand, som ikke indeholdt et signifikant antal RBC og WBC. De rensede trombocytter, der blev behandlet med thrombin, viste en aktivering på op til 93%, hvilket indikerer deres levedygtighed. Vi bekræftede, at de rensede blodplader er tilstrækkeligt rene ved hjælp af flow cytometrisk og mikroskopisk evaluering. Disse blodplader kan bruges til genekspression, aktivering, granula frigivelse, aggregering, og vedhæftning assays. Denne metode kan bruges til rensning af blodplader fra blodet af andre arter samt.

Resuméet af trombocytoprensningen er beskrevet i et flowdiagram (figur 1). Trin omfatter opsamling af blod fra mus ved hjælp af retroorbital blødning i tilstedeværelsen af en antikoagulerende middel, tilsætning af blodprøve på Iohexol gradient medium, centrifugering i en svingende skovl rotor ved 400 x g i 20 min ved 20 °c. Kvaliteten af de rensede blodplader blev evalueret med mikroskopi og flow cytometri efter farvning med antistof til påvisning af kontaminerende celler o...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Platelets from Mouse Blood at JoVE.com

Purification of Platelets from Mouse Blood

Her, mus blod blev indsamlet i nærværelse af en anti-koagulans. Trombocytterne blev renset ved Iohexol gradient medium ved hjælp af lav hastighed centrifugering. Trombocytterne blev aktiveret med thrombin for at undersøge, om de var levedygtige. Kvaliteten af de rensede blodplader blev analyseret ved flow cytometri og mikroskopi.

Rensning af blodplader fra muse blod

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Blodplader bør være fri for blodlegemer og proteiner, når de studerer deres biokemiske og fysiologiske egenskaber. Derfor har vi udviklet en protokol til at rense blodplader fra museblod. Denne teknik kan rense blodplader ved hjælp af iohexol gradient medium og lav hastighed centrifugering, hvilket resulterer i en klar adskillelse af blodplader fra andre blodkomponenter.For at rense blodpladerne skal du bruge en langbrønde pipettespids til lag 200 mikroliter af friskhøstet fuldblod langsomt ned ad siden af et 1,5 milliliterrør på 600 mikroliter iohexol gradient medium uden blanding. Efter centrifugering i en svingende spand rotor til at isolere blodpladerne, skal du bruge en ny bred-boring pipette spids til at indsamle det meste af blodplade-rige lag og en lille brøkdel af blodplade-fattige lag uden at aspirere den hvide blodlegemer eller røde blodlegemer lag. Tilsæt blodpladeprøven til et nyt rør, og tilsæt en milliliter PBS til blodpladerne.Bland blodpladerne ved inversion, før du udfører en anden centrifugering. Derefter resuspend pellet i 200 mikroliter af PBS med mild pipettering. Ved aktivering af blodplader overføres en til to gange 10 til de seks blodplader til et nyt rør med 100 mikroliter farvningsbuffer.Tilsæt en til to gange 10 til de seks blodplader til et andet rør, der indeholder 100 mikroliter af farvning buffer suppleret med 0,4-millimolar GPRP peptid. Tilføj trombin til røret med GPRP peptid at aktivere blodplader, og tilsæt antistof cocktail af interesse for begge rør. Som en positiv kontrol, tilsæt en mikroliter af fuldblod i op til 100 mikroliter af farvning buffer i et rør, der indeholder 0,4-millimolar GPRP peptid, og tilsæt trombin til at aktivere disse blodplader.Som en negativ kontrol, tilsættes en mikroliter af fuldblod i op til 100 mikroliter af farvning buffer. Derefter pletter begge kontrol rør med antistof cocktail. Efter 30 minutter ved stuetemperatur i mørke vaskes prøverne med en milliliter frisk farvningsbuffer pr. rør.Opslæm pellets i 300 mikroliter af frisk farvning buffer. Overfør derefter celleprøverne til individuelle flowcytometrianalyserør, der er beskyttet mod lys. Hvis du vil analysere blodpladerne ved flowcytometri, skal du oprette et nyt eksperiment og generere logaritmiske fremadrettede punkt-plot i forhold til logaritmiske side scatter-punktområder.Når spændingerne er justeret efter behov, registreres de enkeltfarvede celler for kompensationskontrolerne. Kør nu den positive kontrolprøve for at anskaffe nok celler til at justere kompensationen og portene. Derefter erhverve og registrere 100, 000 begivenheder for hver fuldblodsprøve, og analysere flow cytometri data ved hjælp af de relevante parceller og porte.Hvis blodet tilsættes på mediet langsomt, iohexol gradient medium og blodprøven vil danne to separate lag i røret. Efter centrifugering indeholder det øverste, halmfarvede lag plasmaet, men ingen intakte blodlegemer. Det andet, hvidlige, trombocytrige lag indeholder størstedelen af blodpladerne.Det tredje, gennemsigtige lag er det trombocyt-fattige lag og er direkte over de røde blodlegemer og hvide blodlegemer pellet. Fuldblod udviser forskellige populationer af røde blodlegemer, hvide blodlegemer, og blodplader på en logaritmisk fremad scatter versus side scatter prik plot. Rensede blodplader viser imidlertid en tydelig population med ubetydelige antal røde eller hvide blodlegemer.Fuldblodsprøver indeholder Ter119-positive røde blodlegemer og CD45-positive hvide blodlegemer populationer, der er næsten fraværende i rensede blodplader prøver. Ubehandlede rensede blodplader udtrykker næsten ingen aktiveringsmarkører, der bekræfter deres hviletilstand, mens rensede trombinbehandlede blodplader typisk viser et 71% P-selectin udtryk. Mikroskopisk vurdering af ubehandlede rensede blodplader prøver afslører ingen blodplade aggregering.Efter aktivering med trombin, dog, blodpladerne demonstrere en robust sammenlægning, yderligere bekræfter deres levedygtighed efter rensning som påvist. Lag blodprøven omhyggeligt på iohexol medium, og når du indsamler blodpladerne, skal du sørge for at aspirere omhyggeligt, da ikke indsamle de røde blodlegemer og hvide blodlegemer lag for en vellykket blodplade rensning. Denne metode kan også anvendes til rensning af blodplader fra andre arter.De rensede blodplader kan bruges til genekspression, aktivering, sammenlægning, granulat frigivelse, og vedhæftning undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og oprensning af kinesin fra Drosophila Embryoner

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Oprensning og microRNA profilering af Exosomer basis af blod og Kultur Medier

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Celleoverflademarkør Mediated Oprensning af iPS Cell Mellemprodukter fra en Programmerbar musemodel

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...