Name: purification of platelets from mouse blood
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por una financiación inicial de la Fundación de investigación infantil de Cincinnati y una subvención translacional de la Universidad de Cincinnati a M.N. Nos gustaría agradecer el núcleo de la citometría de flujo de investigación de Cincinnati children's hospital por sus servicios.

La recolección de sangre del ratón debe realizarse con la aprobación apropiada de los animales institucionales y el Comité de uso.
Nota: El protocolo de purificación de plaquetas se describe en un diagrama de flujo en la figura 1.
1. recolección de sangre
<ol><li>Añadir 25 μL de citrato de sodio al 3,2% (pH 7,2) como un anticoagulante y 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) en un tubo de polipropileno.</li>
	<li>
<...

<ol>
	<li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation.">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li><li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte:+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation.">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li><li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+signaling+cells+in+the+immune+continuum.">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li><li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+platelets+and+PBMC:+New+evidence+in+wound+healing.">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li><li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets:+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall.">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li><li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets'+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock.">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li><li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis.">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li><li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+&amp;#34;first+responders&amp;#34;+in+wound+response,+cancer,+and+metastasis.">Platelet &amp;#34;first responders&amp;#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li><li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection.">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li><li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood.">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).</li><li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new,+rapid,+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood.">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li><li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo.">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li><li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nycodenz:+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium.">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li><li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge.">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li><li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice.">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li><li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function.">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li><li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease.">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li><li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic/severe+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li><li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection,+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide.">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li><li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+murine+platelet+structure,+function,+assays,+and+genetic+alterations.">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li><li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway.">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li></ol>

Comúnmente, las plaquetas se aíslan por centrifugación de baja velocidad que produce plasma rico en plaquetas que contiene un número significativo de células sanguíneas, desechos celulares y proteínas plasmáticas que pueden interferir con los ensayos y necesidades bioquímicos y fisiológicos purificación adicional21. Por lo tanto, es importante utilizar un método rápido y simple que puede producir plaquetas puras sin contaminantes importantes. El protocolo presentado aquí describe la ...

Las plaquetas son un componente de la sangre que funciona como un iniciador de la coagulación de la sangre en respuesta al daño en el vaso sanguíneo. Se reúnen en el lugar de la lesión para tapar la pared del recipiente1. Las plaquetas son fragmentos de anucleato de citoplasma derivados de los megacuariocitos de la médula ósea bajo la influencia de la trombopoyetina y entran en la circulación2. Se consideran como metabólicamente activos y capaces de detectar el entorno extracelular activando las cascadas de señalización intracelulares que resultan en la propagación de plaquetas, la agregación y la formación de tapón hemostático1,3. Además de la hemostasia/trombosis y la cicatrización de heridas4, las plaquetas desempeñan un papel importante en las respuestas inflamatorias del huésped, angiogénesis y nódulos3,5,6,7, 8.
Las plaquetas se purifican de la sangre para estudiar sus propiedades bioquímicas y fisiológicas, que deben estar libres de otros componentes de la sangre. Dado que los glóbulos rojos (RBC) y los glóbulos blancos (WBC) contienen significativamente más ARN y proteínas que las plaquetas9,10, la presencia de incluso un pequeño número de estas células puede interferir con análisis transcriptómicos y proteómicas de ARN y proteínas derivadas de las plaquetas. Descubrimos que las plaquetas purificadas se activaron con anticuerpos de enlace de trombina como anti-GPIIb/IIIa (JON/A) y anti-P-selectin de manera más eficiente que las plaquetas sanguíneas enteras.
Dado que las plaquetas son frágiles, es importante tratar las muestras de la forma más leve posible. Si las plaquetas están activadas, liberan su contenido de gránulo y finalmente se degradan. Por lo tanto, para mantener intactas las propiedades funcionales de las plaquetas, es importante mantener la quiescencia plaquetaria durante el aislamiento. Varios protocolos han descrito el aislamiento de las plaquetas de humano, perro, rata y primates no humano por varios métodos1,10,11,12. Algunos de los métodos requieren múltiples pasos como la recolección de plasma rico en plaquetas por centrifugación, filtración por columna de separación, selección negativa de plaquetas con anticuerpos específicos de RBC y WBC conjugados con cuentas magnéticas, y así sucesivamente, que son consume mucho tiempo y puede degradar las plaquetas y su contenido.
Ford y sus colegas describieron la purificación plaquetaria de sangre humana usando iohexol medio11. Este método utiliza un volumen similar de muestra de sangre y medio durante la purificación. Dado que los seres humanos producen un mayor volumen de sangre, es relativamente fácil purificar las plaquetas.
Iohexol es un medio inerte de gradiente de densidad universal que es libremente soluble en agua y utilizado en el fraccionamiento de ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos, y nucleoproteínas13,14. Tiene baja osmolalidad y no es tóxico, por lo que es un medio ideal para la purificación de las células vivas intactas11. Es un medio no particulado; por lo tanto, la distribución de las células en un degradado se puede determinar mediante hemocitómetro, CITOMETRO de flujo o espectrofotómetro. No interfiere con la mayoría de las reacciones enzimáticas o químicas de las células o fragmentos celulares después de la dilución.
El ratón sirve como un modelo animal importante para muchas enfermedades humanas15,16,17,18. Hay algunos artículos publicados que describen la purificación de las plaquetas del ratón19,20. Sin embargo, el ratón produce un volumen de sangre relativamente más pequeño, lo que dificulta la purificación de las plaquetas. Si se utiliza el mismo volumen pequeño de medio degradado y muestras de sangre, la capa plaquetaria no puede separarse claramente de la capa de RBC-WBC después de la centrifugación. En este artículo, hemos descrito un método rápido y simple de purificación de plaquetas de ratón con tres veces más medio degradado iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación de baja velocidad. También hemos activado las plaquetas purificadas con trombina e investigado su calidad con citometría de flujo y microscopía.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>17-0626-82</td>
			<td>Platelets activation marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-166</td>
			<td>Tube for centifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS DIVA software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352008</td>
			<td>Tubes for flow cytomtery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Ingredient for staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat anti-mouse CD41</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553848</td>
			<td>Platelets marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>FlowJo, Inc.</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Analysis of platelets and whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>03-34-0001</td>
			<td>Prevent platelet clot formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit Capillary tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-362566</td>
			<td>Blood collection capillary tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemavet</td>
			<td>Drew Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Blood cell analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3100</td>
			<td>Cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936040</td>
			<td>Use to Anesthetize mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Olympus CKX41)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz (Histodenz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2158</td>
			<td>Gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE rat anti-mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561087</td>
			<td>WBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557853</td>
			<td>RBC marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-1A</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 1000 &#181;L, wide-bore</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21-236-2C</td>
			<td>Transferring blood and platelet samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffured saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td>Buffer for washing and dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Physiological saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-688-26</td>
			<td>Anti-coagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Wash and dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>Swinging bucket rotor centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Enzyme Research Laboratoty</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td>Platelet activation agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td>Buffer for Nycodenz medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of platelets from mouse blood

Las plaquetas se purifican de la sangre entera para estudiar sus propiedades funcionales, que deben estar libres de glóbulos rojos (RBC), glóbulos blancos (WBC) y proteínas plasmáticas. Describimos aquí la purificación de las plaquetas de la sangre del ratón usando un medio degradado de tres veces más iohexol en relación con el volumen de la muestra de sangre y la centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La recuperación/rendimiento de las plaquetas purificadas fue de 18.2-38.5%, y las plaquetas purificadas estaban en un estado de reposo, que no contenía ningún número significativo de RBC y WBC. Las plaquetas purificadas tratadas con trombina mostraron hasta el 93% de activación, indicando su viabilidad. Confirmamos que las plaquetas purificadas son lo suficientemente puras utilizando citometría de flujo y evaluación microscópica. Estas plaquetas se pueden utilizar para la expresión génica, activación, liberación de gránulos, agregación y ensayos de adherencia. Este método se puede utilizar para la purificación de las plaquetas de la sangre de otras especies, así.

El Resumen de la purificación plaquetaria se describe en un diagrama de flujo (figura 1). Los pasos incluyen la recolección de sangre del ratón usando sangrado retro-orbital en presencia de un anticoagulante, adición de la muestra de sangre en el medio degradado de iohexol, centrifugación en un rotor de cubeta oscilante a 400 x g durante 20 min a 20 ° c. La calidad de las plaquetas purificadas se evaluó con microscopía y citometría de flujo después de la tinción con antic...

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Purification of Platelets from Mouse Blood

Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.

Purificación de plaquetas de la sangre del ratón

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Las plaquetas deben estar libres de células sanguíneas y proteínas al estudiar sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo para purificar las plaquetas de la sangre del ratón. Esta técnica puede purificar las plaquetas utilizando la centrifugación media y de baja velocidad del gradiente de iohexol, lo que resulta en una separación clara de las plaquetas de otros componentes sanguíneos.Para purificar las plaquetas, utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para colocar 200 microlitros de sangre entera recién cosechada lentamente por el lado de un tubo de 1,5 mililitros en 600 microlitros de medio de gradiente de iohexol sin mezclar. Después de la centrifugación en un rotor de cubo oscilante para aislar las plaquetas, utilice una nueva punta de pipeta de diámetro ancho para recoger la mayor parte de la capa rica en plaquetas y una pequeña fracción de la capa pobre en plaquetas sin aspirar el glóbulo blanco o la capa de glóbulos rojos. Agregue la muestra de plaquetas a un tubo nuevo y agregue un mililitro de PBS a las plaquetas.Mezclar las plaquetas por inversión antes de realizar otra centrifugación. A continuación, resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS con pipeteo suave. Para la activación plaquetaria, transfiera de una a dos veces 10 a las seis plaquetas a un tubo nuevo que contenga 100 microlitros de tampón de tinción.Añadir de una a dos veces 10 a las seis plaquetas a un tubo diferente que contenga 100 microlitros de tampón de tinción complementado con 0,4 mililitros de péptido GPRP. Añadir trombina al tubo con el péptido GPRP para activar las plaquetas, y añadir el cóctel de anticuerpos de interés a ambos tubos. Como control positivo, agregue un microlitro de sangre entera en hasta 100 microlitros de tampón de tinción en un tubo que contenga 0,4 mililitros de péptido GPRP, y agregue trombina para activar estas plaquetas.Como control negativo, agregue un microlitro de sangre entera en hasta 100 microlitros de tampón de tinción. A continuación, manche ambos tubos de control con el cóctel de anticuerpos. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, lave las muestras con un mililitro de tampón de tinción fresca por tubo.Resuspender los pellets en 300 microlitros de tampón de tinción fresca. A continuación, transfiera las muestras celulares a tubos de análisis de citometría de flujo individuales protegidos de la luz. Para analizar las plaquetas por citometría de flujo, cree un nuevo experimento y genere dispersión logarítmica hacia adelante frente a gráficas de puntos de dispersión lateral logarítmica.Después de ajustar los voltajes según sea necesario, registre las celdas manchadas de un solo color para los controles de compensación. Ahora ejecute la muestra de control positivo para adquirir suficientes celdas para ajustar la compensación y las puertas. A continuación, adquiera y registre 100.000 eventos para cada muestra de sangre completa, y analice los datos de citometría de flujo utilizando las gráficas y puertas adecuadas.Si la sangre se añade al medio lentamente, el medio de gradiente de iohexol y la muestra de sangre formarán dos capas separadas en el tubo. Después de la centrifugación, la capa superior de color paja contiene el plasma, pero no las células sanguíneas intactas. La segunda capa, blanquecina, rica en plaquetas contiene la mayoría de las plaquetas.La tercera capa transparente es la capa pobre en plaquetas y está directamente por encima de los glóbulos rojos y el gránulo de glóbulos blancos. Toda la sangre exhibe poblaciones distintas de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en una dispersión logarítmica hacia adelante frente a la gráfica de puntos de dispersión lateral. Las plaquetas purificadas, sin embargo, demuestran una población distinta con un número insignificante de glóbulos rojos o blancos.Las muestras de sangre entera contienen glóbulos rojos positivos a Ter119 y poblaciones de glóbulos blancos CD45 positivos que están casi ausentes en muestras de plaquetas purificadas. Las plaquetas purificadas no tratadas casi no expresan marcadores de activación que confirmen su estado de reposo, mientras que las plaquetas purificadas tratadas con trombina suelen demostrar una expresión de selección de P del 71%. La evaluación microscópica de muestras de plaquetas purificadas no tratadas no revela ninguna agregación plaquetaria.Después de la activación con trombina, sin embargo, las plaquetas demuestran una agregación robusta, confirmando aún más su viabilidad después de la purificación como se demostró. Capa de la muestra de sangre cuidadosamente en el medio iohexol, y al recoger las plaquetas, asegúrese de aspirar cuidadosamente como para no recoger los glóbulos rojos y capas de glóbulos blancos para la purificación plaquetaria exitosa. Este método se puede utilizar para la purificación plaquetaria de otras especies, así.Las plaquetas purificadas se pueden utilizar para estudios de expresión génica, activación, agregación, liberación de gránulos y adhesión.

Research

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