Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Notre travail a été soutenu par des subventions de Deutsche Krebshilfe, Numéro de subvention: 111647, et German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par les autorités de régulation : LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) et Regierungspr'sidium T'bingen, Allemagne. Toutes les manipulations doivent être effectuées dans des conditions stériles (sous le capot à débit laminaire) à l'aide de réactifs et d'instruments stériles (seringues, ciseaux, forceps, scalpels jetables, vaisselle Petri).
REMARQUE : Le schéma global du protocole est ...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

Malgré les progrès dans le traitement chirurgical et pharmacologique du cancer, la thérapie réussie demeure un défi. Puisque les cellules immunitaires sont connues pour jouer un rôle important dans la régulation de la croissance de tumeur, de nouvelles méthodes inhibant la tumorigenicité de telles cellules devraient être établies. Ici nous démontrons une approche nouvelle pour supprimer la croissance de tumeur par l'intermédiaire du transfert adoptif des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic tumeur-a...

Les interférons de type I (IFN) jouent un rôle important dans la stimulation des réponses de l'hôte aux néoplasias, car l'absence de signalisation IFN de type I entraîne une croissance tumorale significativement élevée1. Un des mécanismes impliqués dans ce processus est la régulation de l'activité tumorigène des neutrophiles tumeur-associés, qui estcontrôlé par le récepteur de facteur 3 de colonie-stimulant (CSF3R) en aval signalant 2. Le facteur de stimulation de la colonie 3 (CSF3), ou facteur stimulant la colonie de granulocytes, a été montré pour activer la signalisation impliquant le phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT)3,4. NAMPT est une enzyme limitant le taux pour la synthèse de dinuccléotide d'adénine de nicotinamide, qui améliore la glycolyse et régule la réparation d'ADN, l'expression de gène, et la réponse de stress favorisant la survie et la proliférationdecellules cancéreuses 5. Le NAMPT est surexprimé dans plusieurs types de cancer, y compris colorectal, ovaire, sein, gastrique, cancer de la prostate et gliomes6. NAMPT est essentiel non seulement pour les cellules tumorales, mais aussi pour une grande variété d'autres types de cellules qui sont présents dans les tumeurs, telles que les cellules myéloïdes - il conduit leur différenciation4, inhibe l'apoptose et stimuler l'expression de cytokines multiples ou enzymes dégradantes dans les macrophages7.
Les neutrophiles tumeur-associés représentent les modulateurs importants de la croissance de tumeur. Les fonctions TAN dépendent fortement de la disponibilité de type I IFN, car ces cytokines première activité antitumorale des neutrophiles. Au contraire, l'absence d'IFN soutient l'activation tumorigène de ces cellules, en particulier leurs propriétés pro-angiogéniques. En accord avec cela, les souris déficientes en IFN développent des tumeurs significativement plus grandes et mieux vascularisées, qui sont fortement infiltrées avec des neutrophiles pro-tumoral/pro-angiogéniques1,2,8, 9,10. Fait important, ces TAN pro-angiogéniques montrent une activité élevée de NAMPT, suggérant son rôle essentiel dans la polarisation pro-tumorale des neutrophiles.
L'épuisement des neutrophiles utilisant l'anticorps ly6G ou l'inhibition de leur migration (anticorps CXCR2) a comme conséquence l'angiogenèse diminuée de tumeur, la croissance, et la métastasie1,8. Néanmoins, les anticorps monoclonaux générés sont immunogènes, et leur administration est associée à une gamme d'effets secondaires représentant un danger pour la vie11. Le traitement avec de petites molécules, telles que l'inhibiteur de NAMPT FK866, qui modulent la tumoriogenicity de neutrophile, pourrait aider à éviter de telles complications. Malheureusement, l'inhibition systémique pharmacologique de NAMPT, à côté de son effet thérapeutique sur la croissance de tumeur, mène aux effets secondaires graves comprenant la toxicité gastro-intestinale et la thrombocytopenia. Par conséquent, l'application systémique des inhibiteurs nAMPT n'est pas faisable12,13,14.
Pour cette raison, nous suggérons ici un protocole où l'activité NAMPT est bloquée directement dans les NAN isolés. De tels neutrophiles antitumorales sont alors adoptifs transférés dans un hôte tumeur-portant. Ce protocole permettra d'éviter les effets secondaires toxiques systémiques des composés, tandis que son effet sur les cellules cibles sera maintenu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

La contribution des neutrophiles à la régulation de la tumorigénèse reçoit une attention accrue. Ces cellules sont hétérogènes, et selon le milieu tumoral peut posséder une capacité pro- ou anti-tumorale. Une des cytokines importantes régulant des fonctions de neutrophile dans un contexte de tumeur sont des interférons de type I. En présence d'interférons, les neutrophiles gagnent des propriétés antitumorales, y compris la cytotoxicité ou la stimulation du système immunitaire. Inversement, l'absence d'un signal d'interféron a comme conséquence l'activité pro-tumorale pro en avant, caractérisée avec la stimulation forte de l'angiogenèse de tumeur. Récemment, nous pourrions démontrer que les propriétés pro-angiogéniques des neutrophiles dépendent de l'activation de la voie de signalisation de phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT) dans ces cellules. L'inhibition de cette voie dans les neutrophiles tumeur-associés mène à leur phénotype anti-angiogenic puissant. Ici, nous démontrons notre modèle nouvellement établi permettant l'évaluation in vivo du potentiel tumorigenic des neutrophiles tumoraux-associés manipulés (TANs). Peu de temps après, les neutrophiles tumeur-associés pro-angiogenic peuvent être isolés des souris interféron-déficientes de tumeur-portantes et repolarized dans le phénotype anti-angiogenic en bloquant la signalisation de NAMPT. L'activité angiogénique de ces cellules peut être ensuite évaluée à l'aide d'un analyse de l'anneau aortique. Les TAN anti-angiogéniques peuvent être transférés dans les destinataires sauvages de type tumeur-portant s'ils portent et la croissance de tumeur devrait être surveillée pendant 14 jours. Au jour 14 souris sont sacrifiées, tumeurs enlevées et coupées avec leur vascularisation évaluée. Dans l'ensemble, notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer in vivo la capacité angiogénique des cellules primaires, telles que les neutrophiles tumeur-associés, sans avoir besoin d'employer des modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. Vc

Utilisant la procédure décrite ici, Ifnar1-/- les neutrophiles ont été isolés des tumeurs et traités avec l'inhibiteur de NAMPT FK866 pendant 2 h. Ifnar1 non traité -/- les neutrophiles ont été employés comme contrôle. L'effectivité du traitement a été évaluée à l'aide de l'antoire aortique, qui reflète les étapes clés impliquées dans l'angiogenèse (dégradation de la matrice, migration, prolifération, réorganisation). Nous...

Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Ici, nous montrons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic après leur transfert dans les souris tumeur-portantes. Ce protocole peut être utilisé pour manipuler l'activité neutrophile ex vivo et pour ensuite évaluer leur fonctionnalité in vivo dans le développement de tumeurs. Il s'agit d'un modèle approprié pour l'étude des immunothérapies potentielles à base de neutrophiles.

Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer le potentiel angiogénique des neutrophiles primaires tumeur-associés in vivo sans avoir besoin d’employer les modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. L’inhibition directe de la phosphoribosyltransferase nicotinamide, bientôt NAMPT, dans les neutrophiles tumeur-associés avec leur transfert adoptif suivant dans les animaux tumeur-roulement permet la manipulation des neutrophiles sans effets secondaires toxiques systémiques. Nous démontrerons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic manipulés après transfert dans les hôtes tumeur-roulements pour l’étude des immunothérapies neutrophile-basées potentielles dans différents modèles de cancer.Pour mettre en place un modèle allogénique de souris tumorale, rasez la peau de 10 souris femelles alpha interféron alpha et bêta-récepteurs de 1 mois avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec 70% d’éthanol, puis chargez trois fois 10 aux six cellules de mélanome B16F10 par millilitre de PBS dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de 0,4 par 19 millimètres et injectez 100 microlitres de la suspension sous-cutanée sur un flanc arrière dans chaque Animal. Pour le transfert neutrophile-adoptif, diluer les cellules de mélanome B16F10 à une concentration six fois 10 à la sixième par millilitre dans PBS et diluer les neutrophiles traités avec l’inhibiteur du NAMPT FK866 à six fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de concentration de PBS. Ensuite, mélangez les neutrophiles non traités ou traités par inhibiteur avec les cellules du mélanome à un rapport neutrophile-tumeur de 1:10 et injectez sous-cutanément 100 microlitres de cellules dans jusqu’à cinq souris par groupe.Après les injections, placez jusqu’à cinq souris femelles injectées dans une seule cage et utilisez des étriers pour mesurer la longueur, la largeur et la profondeur de la tumeur chaque jour pendant 14 jours. Au jour 14 après injection, désinfectez la peau de chaque animal injecté avec 70% d’éthanol et utilisez des ciseaux et des forceps pour récolter les tumeurs dans un tube conique de 50 millilitres contenant un milieu complet sur la glace. Pour sectioner les tumeurs pour l’analyse histologique, submergez les tumeurs dans le composé optimal de température de coupe et congelez les échantillons dans l’azote liquide pour le stockage à moins 80 degrés Celsius.Le jour de la section, décongeler les échantillons à moins 20 degrés Celsius avant d’utiliser un cryotome pour obtenir des sections de cinq micromètres. Après fixation dans la liaison non spécifique, tacher les sections de tissu de tumeur avec les anticorps primaires d’intérêt pendant une heure à 20 degrés Celsius, suivie de trois lavages dans PBS. Après le dernier lavage, tacher les cellules avec un anticorps secondaire conjugué à la fluorescence approprié dans un colorant nucléaire comme le DAPI pendant une heure à 20 degrés Celsius protégé de la lumière.À la fin de l’incubation, séchez les glissières pendant 20 minutes à 20 degrés Celsius à l’abri de la lumière avant de monter les échantillons avec un milieu de montage anhydre, puis couvrez chaque toboggan d’un glissement de couverture et laissez le milieu de montage sécher pendant une heure à 37 degrés Celsius avant d’imagerie des tissus par microscopie fluorescence. Pour l’isolement de neutrophile tumeur-associé, placez cinq tumeurs par puits dans les puits individuels d’une plaque stérile de six puits pendant qu’elles sont récoltées et emploient des ciseaux stériles pour hacher les tumeurs en morceaux de deux à trois millimètres. Ensuite, digérer les fragments tumoraux avec un millilitre de collagène dispase d dnase 1 solution pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% avec l’humidité, mélangeant les échantillons avec une seringue de 10 millilitres toutes les 15 minutes.À la fin de l’incubation, filtrer les cellules à travers des passoires de 100 micromètres dans un tube de 15 millilitres par puits pour enlever les fibres non digérées et ajouter le PBS à un volume final de 15 millilitres. Recueillir les cellules dissociées par centrifugation et lyser les globules rouges avec un millilitre de tampon de lyse par tube. Après le mélange, mélanger le contenu de chaque tube en un seul tube de 15 millilitres, en arrêtant la réaction après deux minutes avec 11 millilitres de milieu complet de quatre degrés Celsius.Après centrifugation, resuspendez la pastille en un millilitre de PBS et bloquez toute liaison non spécifique avec trois microlitres d’anticorps fc-bloc pendant 15 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, étiquetez les cellules avec des anticorps anti-CD11b et Ly6G et tout autre anticorps d’intérêt, plus DAPI, pour une incubation de 30 minutes sur la glace protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules en 14 millilitres de PBS et résuspendre les granulés à une fois 10 à la septième cellule par millilitre de concentration moyenne complète fraîche sur la glace, triez ensuite les neutrophiles CD11b-positifs, Ly6G, élevés de DAPI négatifs sur un trieur de cellules activé par fluorescence selon les protocoles de tri standard, vérifiant la pureté des neutrophiles isolés sur le cytomètre d’écoulement à la fin du tri.Pour l’inhibition in vitro de neutrophile tumeur-associée, graine 1.5 fois 10 aux cinquièmes neutrophiles triés dans chacun des deux puits d’une plaque u-fond de 96 puits et ajoutez FK866 à une concentration finale de 100 nanomolar dans le milieu complet dans un puits et un volume égal de milieu complet seul à l’autre puits. Après deux heures dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez les cellules deux fois avec PBS et résuspendez les granulés dans PBS à la concentration appropriée pour l’injection suivante. Les neutrophiles traités par inhibiteur du NAMPT ont une capacité significativement réduite de stimuler la formation de branches aortiques par rapport aux cellules non traitées.En outre, l’injection sous-cutanée des neutrophiles anti-angiogéniques inhibiteur-traités induit une affaiblissement significative de la croissance de tumeur comparée aux souris injectées avec l’alpha non traité d’interféron et le sous-unité de récepteur bêta 1 neutrophiles de KO. L’examen histologique des tumeurs extraites confirme davantage la suppression significative de l’angiogenèse dans les tumeurs isolées des souris traitées avec des neutrophiles tumeur-associés inhibiteur-traités comparés à ceux injectés avec des neutrophiles de KO non traités. Pour évaluer les propriétés des neutrophiles tumeur-associés FK866-traités, pcr quantitatif et tache occidentale peuvent être exécutés pour étudier l’activation des voies intracellulaires impliquées dans la polarisation de neutrophile.Puisque les neutrophiles sont de courte durée, il est nécessaire d’effectuer toutes les étapes aussi rapidement que possible et de garder les neutrophiles au froid pendant toute la procédure. Cette technique ouvre la voie à l’étude des mécanismes intracellulaires et des facteurs impliqués dans la régulation des propriétés angiogéniques et tumorigenic des neutrophiles tumeur-associés in vivo.

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Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

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