Name: transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Il nostro lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Deutsche Krebshilfe, Grant Number: 111647, e German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.

Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate dalle autorità di regolamentazione: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) e Regierungspr-sidium Tubingen, Germania. Tutte le manipolazioni devono essere eseguite in condizioni sterili (sotto cofano di flusso laminare) utilizzando reagenti e strumenti sterili (siringhe, forbici, pinze, bisturi usa e getta, piatti Petri).
NOTA: lo schema generale del protocollo è illustrato nella ...

<ol>
	<li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model.">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li><li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kr&#246;ger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-&#946;.">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-&#946;.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li><li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B-cell+colony-enhancing+factor,+whose+expression+is+upregulated+in+activated+lymphocytes,+is+a+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+a+cytosolic+enzyme+involved+in+NAD+biosynthesis.">Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis.</a> European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).</li><li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD(+)-sirtuin-1-dependent+pathway.">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li><li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics.">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622 (2018).</li><li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+(NAMPT)+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li><li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-B+cell+colony-enhancing+factor/visfatin,+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities.">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li><li>Jablonska, J., Wu, C. -. F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta.">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li><li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human.">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li><li>Wu, C. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lack+of+type+I+interferon+induces+neutrophil-mediated+pre-metastatic+niche+formation+in+the+mouse+lung.">The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.</a> International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).</li><li>Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+side+effects+of+monoclonal+antibodies.">The safety and side effects of monoclonal antibodies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).</li><li>Hasmann, M., Schemainda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FK866,+a+highly+specific+noncompetitive+inhibitor+of+nicotinamide+phosphoribosyltransferase,+represents+a+novel+mechanism+for+induction+of+tumor+cell+apoptosis.">FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis.</a> Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).</li><li>Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacokinetics,+toxicities,+and+biologic+effects+of+FK866,+a+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthesis+inhibitor.">The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor.</a> Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).</li><li>von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+NAD+depleting+cancer+drugs:+results+of+a+phase+I+clinical+trial+of+CHS+828+and+overview+of+published+data.">Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data.</a> Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).</li><li>De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Factors+in+Measuring+Angiogenesis+Using+the+Aortic+Ring+Model.">Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).</li><li>Pylaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+signaling+is+critical+for+the+proangiogenic+activity+of+tumor-associated+neutrophils.">NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils.</a> International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).</li></ol>

Nonostante i progressi nel trattamento chirurgico e farmacologico del cancro, la terapia di successo rimane una sfida. Poiché le cellule immunitarie sono noti per svolgere un ruolo importante nella regolazione della crescita del tumore, dovrebbero essere stabiliti nuovi metodi che inibiscono la tumorigenicità di tali cellule. Qui dimostriamo un nuovo approccio per sopprimere la crescita tumorale attraverso il trasferimento adottivo di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore. Il targeting selettivo della segnala...

Gli interferoni di tipo I (IFN) svolgono un ruolo importante nella stimolazione delle risposte dell'ospite alle neoplasie, poiché la mancanza di segnalazione IFN di tipo I si traduce in una crescita tumorale significativamente elevata1. Uno dei meccanismi coinvolti in questo processo è la regolazione dell'attività tumorale dei neutrofili associati al tumore, che è controllata dalla segnalazione a valle del fattore di stimolazione della colonia 3 (CSF3R). Il fattore stimolante della colonia 3 (CSF3), o fattore di stimolazione della colonia di granulociti, ha dimostrato di attivare la segnalazione che coinvolge la tosfororibosyltransferae alla nicotinamina (NAMPT)3,4. NAMPT è un enzima che limita il tasso per la sintesi di dinucleotide dell'adenina nicotinamide, che migliora la glicolisi e regola la riparazione del DNA, l'espressione genica e la risposta allo stress promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali5 . NAMPT è sovraespresso in più tipi di cancro, tra cui colorettale, ovarico, seno, gastrico, cancro alla prostata e glioma6 . NAMPT è essenziale non solo per le cellule tumorali, ma anche per una grande varietà di altri tipi di cellule presenti nei tumori, come le cellule mieloidi - guida la loro differenziazione4, inibisce l'apoptosi e stimola l'espressione di citochine multiple o enzimi degradanti in macrofagi7.
I neutrofili associati al tumore rappresentano importanti modulatori della crescita tumorale. Le funzioni TAN dipendono fortemente dalla disponibilità IFN di tipo I, in quanto queste citochine primo attività anti-tumorale dei neutrofili. Al contrario, l'assenza di IFN supporta l'attivazione cancerogena di queste cellule, in particolare le loro proprietà pro-angiogeniche. In accordo con questo, i topi carenti in IFN sviluppano tumori vascolarizzati significativamente più grandi e migliori, che sono fortemente infiltrati con neutrofili pro-tumorale / pro-angiogenico1,2,8, 9,10. È importante sottolineare che tali TAN pro-angiogenici mostrano un'elevata attività di NAMPT, suggerendo il suo ruolo essenziale nella polarizzazione pro-tumorale dei neutrofili.
L'esaurimento dei neutrofili usando anticorpo Ly6G o inibizione della loro migrazione (anticorpo CXCR2) provoca una diminuzione dell'angiogenesi tumorale, crescita, e metastasi1,8. Tuttavia, gli anticorpi monoclonali generati sono immunogenici e la loro somministrazione è associata a una serie di effetti collaterali pericolosi per la vita11. Il trattamento con piccole molecole, come l'inibitore NAMPT FK866, che modula la tumoriogenicità dei neutrofi, potrebbe aiutare a evitare tali complicazioni. Sfortunatamente, l'inibizione sistemica farmacologica di NAMPT, accanto al suo effetto terapeutico sulla crescita del tumore, porta a gravi effetti collaterali tra cui tossicità gastrointestinale e trombocitopenia. Pertanto, l'applicazione sistemica degli inibitori NAMPT non è fattibile12,13,14.
Per questo motivo, è possibile suggerire un protocollo in cui l'attività NAMPT viene bloccata direttamente in TAN isolati. Tali neutrofili anti-tumorale vengono poi trasferiti adottivamente in un ospite portatore di tumori. Questo protocollo aiuterà a evitare gli effetti collaterali tossici sistemici dei composti, mentre il suo effetto sulle cellule bersaglio sarà sostenuto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>6006180 / 607180 / 760180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom cell culture plates</td>
			<td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMG EVOS fl digital inverted microscope</td>
			<td>AMG, Bothel, U.S.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553312</td>
			<td>clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>127608</td>
			<td>clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaII</td>
			<td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td></td>
			<td>cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Vogel Germany, Kevelaer, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy cell counter</td>
			<td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Trics 50&#181;m / 100 &#181;m sterile filters</td>
			<td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany</td>
			<td>04-004-2327 / 04-004-2328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Rotina 420 R</td>
			<td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>BioLegend, California, U.S.</td>
			<td>422801</td>
			<td>Stock: 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethylsufoxide)</td>
			<td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany</td>
			<td>WAK-DMSO-10</td>
			<td>CryoSure-DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany</td>
			<td>c-22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (Anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>553142</td>
			<td>clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FK 866 hydrochloride</td>
			<td>Axon Medchem, Groningen, Netherlands</td>
			<td>Axon 1546</td>
			<td>Stock: 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L</td>
			<td>Abcam, Cambridge, U.K.</td>
			<td>ab97075</td>
			<td>Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.</td>
			<td>51026334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>12440-053</td>
			<td>IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis GT420 shaver</td>
			<td>B. Braun Asculap, Suhl, Germany</td>
			<td>90200714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix basement membrane</td>
			<td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands</td>
			<td>7205011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td>
			<td>Microm International GmbH, Walldorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F3777</td>
			<td>FITC-conjugated, no information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles 0.4 mm x 16 mm</td>
			<td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>302200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomount</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>HX67590916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetus automatic pipette</td>
			<td>Hirschmann Laborger&#228;te, Eberstadt, Germany</td>
			<td>9907200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain</td>
			<td>Immundiagnostik, Bensheim, Germany</td>
			<td>AP1001.1</td>
			<td>No information about stock concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase</td>
			<td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td>
			<td>A1105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile disposal scalpel (no. 15)</td>
			<td>MedWare, Naples, U.S.</td>
			<td>120920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 ml</td>
			<td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 10 ml</td>
			<td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td>
			<td>309110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 sterile cell culture flasks</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>833,911,302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, U.S.</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning</td>
			<td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfer of manipulated tumor-associated neutrophils into tumor-bearing mice to study their angiogenic potential in vivo

Il contributo dei neutrofili alla regolazione della tumorigenesi sta ricevendo una maggiore attenzione. Queste cellule sono eterogenee, e a seconda dell'ambiente tumorale può possedere capacità pro o anti-tumorale. Una delle citochine importanti che regolano le funzioni neutrofili in un contesto tumorale sono gli interferoni di tipo I. In presenza di interferoni, i neutrofili ottengono proprietà antitumorali, tra cui citotossicità o stimolazione del sistema immunitario. Al contrario, l'assenza di un segnale di interferone si traduce in un'attività pro-tumorale prominente, caratterizzata da una forte stimolazione dell'angiogenesi tumorale. Recentemente, potremmo dimostrare che le proprietà pro-angiogeniche dei neutrofili dipendono dall'attivazione del percorso di segnalazione del fosfororiboyltransferae nicotina (NAMPT) in queste cellule. L'inibizione di questa via nei neutrofili associati al tumore porta al loro potente fenotipo anti-angiogenico. Qui, dimostriamo il nostro modello appena stabilito che consente la valutazione in vivo del potenziale tumorale dei neutrofili associati al tumore manipolati (TAN). A breve, i neutrofili pro-angiogenici associati al tumore possono essere isolati da topi carenti di interferonzi otumorali e ripolarti in fenotipi anti-angiogenici bloccando la segnalazione NAMPT. L'attività angiogenica di queste cellule può essere successivamente valutata utilizzando un saggio ad anello aortico. I TAN anti-angiogenici possono essere trasferiti in destinatari di tipo selvaggio portatori di tumore e la crescita del tumore deve essere monitorata per 14 giorni. Al giorno 14 topi vengono sacrificati, tumori rimossi e tagliati con la loro vascolarizzazione valutata. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare la capacità angiogenica delle cellule primarie, come i neutrofili associati al tumore, senza la necessità di utilizzare modelli di linee cellulari artificiali di neutrofili. Vc

Utilizzando la procedura descritta qui, i neutrofili Ifnar1-/- sono stati isolati dai tumori e trattati con l'inibitore NAMPT FK866 per 2 h. I neutrofili non trattati -/- sono stati usati come controllo. L'effettività del trattamento è stata valutata utilizzando il saggio dell'anello aortico, che riflette i passaggi chiave coinvolti nell'angiogenesi (degradazione della matrice, migrazione, proliferazione, riorganizzazione). Potremmo dimostrare c...

Watch this Scientific Journal Video about Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo at JoVE.com

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Qui, mostriamo il potenziale terapeutico dei neutrofili anti-angiogenici associati al tumore dopo il loro trasferimento in topi portatori di tumore. Questo protocollo può essere utilizzato per manipolare l'attività dei neutrofili ex vivo e successivamente valutare la loro funzionalità in vivo nello sviluppo di tumori. È un modello appropriato per studiare potenziali immunoterapie a base di neutrofili.

Trasferimento di neutrofili associati al tumore manipolati in topi che portano il tumore per studiare il loro potenziale angiogenico In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Il nostro protocollo fornisce un nuovo strumento per valutare il potenziale angiogenico dei neutrofili primari associati al tumore in vivo senza la necessità di utilizzare modelli di linea cellulare neutrofili artificiali. L'inibizione diretta della nicotinammide fosforibosiltransferasi, a breve NAMPT, nei neutrofili associati al tumore con il loro successivo trasferimento adottivo in animali portanti di tumore consente la manipolazione di neutrofili senza effetti collaterali tossici sistemici. Dimostreremo il potenziale terapeutico dei neutrofili manipolati anti-angiogenici associati al tumore dopo il trasferimento in ospiti portanti di tumore per lo studio di potenziali immunoterapie a base di neutrofili in diversi modelli di cancro.Per impostare un modello di topo tumorale allogenico, radere la pelle da 10 a 12 settimane femmina interferone alfa e beta-recettore subunità 1 topo knockout con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con 70%etanolo, quindi caricare tre volte 10 alle sei cellule di melanoma B16F10 per millilitro di PBS in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 0,4 per 19 millimetri e iniettare 100 microlitri della sospensione per via sottocutanea su un fianco posteriore in ogni rasato Animale. Per il trasferimento neutrofilo-adottivo, diluire le cellule di melanoma B16F10 a sei per 10 alla sesta concentrazione di millilitro in PBS e diluire i neutrofili trattati con inibitore NAMPT FK866 a sei per 10 alla quinta cella per millilitro di concentrazione di PBS. Quindi, mescolare neutrofili non trattati o trattati con inibitori con le cellule del melanoma con un rapporto neutrofilo-tumore di 1:10 e iniettare per via sottocutanea 100 microlitri di cellule in un massimo di cinque topi per gruppo.Dopo le iniezioni, posizionare fino a cinque topi femmine iniettati in una singola gabbia e utilizzare pinze per misurare la lunghezza, la larghezza e la profondità del tumore ogni giorno per 14 giorni. Al giorno 14 dopo l'iniezione, disinfettare la pelle di ogni animale iniettato con il 70% di etanolo e utilizzare forbici e forcep per raccogliere i tumori in un tubo conico da 50 millilitri contenente mezzo completo sul ghiaccio. Per sessare i tumori per l'analisi istologica, immergere i tumori in un composto ottimale della temperatura di taglio e congelare i campioni in azoto liquido per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.Il giorno della sessatura, scongelare i campioni a meno 20 gradi Celsius prima di utilizzare un criotomo per ottenere sezioni di cinque micrometri. Dopo la fissazione in legame non specifico, macchiare le sezioni del tessuto tumorale con gli anticorpi primari di interesse per un'ora a 20 gradi Celsius, seguiti da tre lavaggi in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, macchiare le cellule con un anticorpo secondario coniugato a fluorescenza appropriato in un colorante di colorazione nucleare come DAPI per un'ora a 20 gradi Celsius protetto dalla luce.Al termine dell'incubazione, asciugare i vetrini per 20 minuti a 20 gradi Celsius protetti dalla luce prima di montare i campioni con un mezzo di montaggio anidro, quindi coprire ogni diapositiva con uno scivolo di copertura e lasciare asciugare il supporto di montaggio per un'ora a 37 gradi Celsius prima di periferico i tessuti mediante microscopia a fluorescenza. Per l'isolamento neutrofilo associato al tumore, posizionare cinque tumori per pozzo in singoli pozzi di una piastra sterile a sei pozzi mentre vengono raccolti e utilizzare forbici sterili per tritare i tumori in pezzi da due a tre millimetri. Successivamente, digerire i frammenti tumorali con un millilitro di collagenasi d dnasi 1 soluzione per 45 minuti a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con umidità, mescolando i campioni con una siringa da 10 millilitri ogni 15 minuti.Al termine dell'incubazione, filtrare le cellule attraverso filtri da 100 micrometri in un tubo da 15 millilitri per pozzo per rimuovere le fibre non digerite e aggiungere PBS a un volume finale di 15 millilitri. Raccogliere le cellule dissociate per centrifugazione e lisciviare i globuli rossi con un millilitro di tampone di lisi per tubo. Dopo la miscelazione, unire il contenuto di ogni tubo in un singolo tubo da 15 millilitri, fermando la reazione dopo due minuti con 11 millilitri di mezzo completo di quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, rimescolare il pellet in un millilitro di PBS e bloccare qualsiasi legame non specifico con tre microlitri di anticorpo Fc-block per 15 minuti sul ghiaccio. Al termine dell'incubazione, etichettare le cellule con anticorpi anti-CD11b e Ly6G e qualsiasi altro anticorpo di interesse, più DAPI, per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 14 millilitri di PBS e rimosogliere i pellet a una volta per 10 alla settima cellule per millilitro di concentrazione media completa fresca sul ghiaccio, quindi ordinare i neutrofili CD11b-positivi, Ly6G, ad alto DAPI-negativi su uno smistatore di celle attivato dalla fluorescenza secondo protocolli di smistamento standard, controllando la purezza dei neutrofili isolati sul citometro di flusso alla fine del tipo.Per l'inibizione neutrofila associata al tumore in vitro, seme 1,5 per 10 al quinto neutrofilo ordinato in ciascuno dei due pozzi di una piastra inferiore a U di 96 po 'e aggiungere FK866 a una concentrazione finale di 100 nanomolari in mezzo completo in un pozzo e un volume uguale di mezzo completo da solo all'altro pozzo. Dopo due ore nell'incubatore di coltura cellulare, lavare le cellule due volte con PBS e rimosogliere i pellet in PBS alla concentrazione appropriata per la successiva iniezione. I neutrofili trattati con NAMPT-inibitore hanno una capacità significativamente ridotta di stimolare la formazione di rami aortici rispetto alle cellule non trattate.Inoltre, l'iniezione sottocutanea di neutrofili anti-angiogenici trattati con inibitori induce una significativa compromissione della crescita tumorale rispetto ai topi iniettati con neutrofili knockout alfa interferone non trattato e subunità del recettore beta 1. L'esame istologico dei tumori estratti conferma inoltre la significativa soppressione dell'angiogenesi nei tumori isolati dai topi trattati con neutrofili associati al tumore trattati con inibitori rispetto a quelli iniettati con neutrofili knockout non trattati. Per valutare le proprietà dei neutrofili associati al tumore trattati con FK866, è possibile eseguire PCR quantitativo e Western Blot per studiare l'attivazione di vie intracellulari coinvolte nella polarizzazione neutrofila.Poiché i neutrofili hanno vita breve, è necessario eseguire tutti i passaggi il più rapidamente possibile e mantenere freddi i neutrofili durante l'intera procedura. Questa tecnica apre la strada allo studio dei meccanismi intracellulari e dei fattori coinvolti nella regolazione delle proprietà angiogeniche e tumorigeniche dei neutrofili associati al tumore in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Il Colon-26 Carcinoma tumore-cuscinetto mouse come un modello per lo studio del cancro cachessia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identificazione e caratterizzazione di fattori metastatici di trasferimento genico nel romanzo RIP-Tag; RIP-tva modello murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Rilevamento del potenziale di membrana di mitocondri per studiare CLIC4 HN4 Knockdown-indotta delle cellule apoptosi In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...