Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح #1K08HL088260 و #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ومؤسسة Batchelor لبحوث الأطفال (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 وBALB / ج الفئران المستخدمة في هذه الدراسة إما ولدت في منشأتنا أو المقدمة من مختبرات جاكسون أو تاكونيك.

أجريت جميع الدراسات بموجب بروتوكولات أبحاث القوارض التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لكلية الطب بجامعة ميامي ميلر، والتي تفي بالمعايير البيطرية التي وضعتها الرابطة الأمريكية لعلوم الحيوانات المختبرية (AALAS).
1. إعداد الحلو...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول البصري الأساليب التي يمكن تحملها بشكل جيد لعزل الخلايا أحادية النووية القولونية بما في ذلك الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). وبالنظر إلى أن هذا البروتوكول تم تحسينه في تقييم نماذج التهاب القولون الماوس بعد زرع شديدة حيث السيتوكينات الالتهابية وإصابة الأنسجة تصلح...

على الرغم من أن الجهاز الهضمي (GI) مخصص في المقام الأول لمعالجة وإعادة امتصاص المواد الغذائية من المواد الغذائية، فإن الجهاز الهضمي يحافظ أيضا على أدوار مركزية في سلامة الأوعية الدموية، اللمفاوية، والجهاز العصبي والعديد من الأجهزة الأخرى من خلال في الغشاء المخاطي والجهاز المناعي تحت المخاطية1. الجهاز المناعي GI له دور مؤثر في كل من الجهاز الهضمي والصحة الجهازية بسبب تعرضه المستمر للمستضدات الأجنبية من الغذاء، والبكتيريا commensal، أو مسببات الأمراض الغازية1،2. وهكذا، يجب على الجهاز المناعي GI الحفاظ على توازن دقيق الذي يتسامح مع المستضدات غير المسببة للأمراض في حين تستجيب بشكل مناسب للمستضدات المسببة للأمراض1،2. عندما يتم تعطيل توازن التسامح والدفاع، يمكن أن يحدث خلل التنظيم المناعي الموضعي أو الجهازي والالتهاب مما يؤدي إلى عدد لا يحصى من الأمراض1،2،3.
الأمعاء تأوي ما لا يقل عن 70٪ من جميع الخلايا اللمفاوية في الجسم4. معظم التفاعلات المناعية الأولية تنطوي على واحدة على الأقل من ثلاث محطات المناعة في الأمعاء: 1) بقع باير، 2) الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IEL) و 3) الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). يتكون كل من هذه من شبكة معقدة مترابطة من الخلايا المناعية التي تستجيب بسرعة للتحديات المناعية الطبيعية في الأمعاء5. يقتصر على ستروما فوق الغشاء المخاطي العضلي، وpropria لامينا منظم بشكل فضفاض هو النسيج الضام من الغشاء المخاطي للمعوة الأمعاء ويشمل السقالات للزغب، والأوعية الدموية، والصرف اللمفاوي، والجهاز العصبي المخاطي، فضلا عن العديد من الفطرية والمجموعات الفرعية المناعيةالتكيفية6و7و8و9. وتتألف LPL من CD4+ وCD8+ T الخلايا في نسبة تقريبية من 2:1، خلايا البلازما وخلايا النسب النخاعي بما في ذلك، الخلايا التقشرية، والخلايا الصاري، الحمضات والضامة6.
هناك اهتمام متزايد في فهم خلل التنظيم المناعي والتهاب الأمعاء لأنها تتعلق بحالات المرض المختلفة. مثل أمراض كرون والتهاب القولون التقرحي كل ذلك يظهر مستويات متفاوتة من التهاب القولون10،11،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرضى الذين يعانون من اضطرابات خبيثة أو غير خبيثة في النخاع أو الجهاز المناعي الذين يخضعون لزراعة نخاع العظم الالوجيني (allo-BMT) تطوير أشكال مختلفة من التهاب القولون بما في ذلك 1) السمية المباشرة من أنظمة تكييف قبل BMT، 2) العدوى الناجمة عن كبت المناعة بعد BMT و 3) الكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف (GVHD) مدفوعا الخلايا T من النوع المانح ة رد فعل على المستضدات المانحة في الأنسجة بعد BMT13،14،15. كل هذه المضاعفات ما بعد BMT يؤدي إلى تغييرات كبيرة في الوسط المناعي للأمعاء16،17،18. تسمح الطريقة المقترحة بتقييم يمكن الاعتماد عليه لتراكم الخلايا المناعية في القولون الفأر، وعندما تطبق على متلقي المورين بعد BMT، تسهل فحص كفاءة لكل من الخلايا المناعية المانحة والمتلقية المشاركة في تحمل زرع19 ،20. وتشمل الأسباب الإضافية لالتهاب الأمعاء الأورام الخبيثة، والحساسية الغذائية، أو اضطراب ميكروبيوم الأمعاء. يسمح هذا البروتوكول بالوصول إلى الخلايا أحادية النووية في الأمعاء من القولون، ومع التعديلات، إلى الكريات البيض في الأمعاء الدقيقة في أي من هذه النماذج المارين قبل السريرية.
بحث PubMed باستخدام مصطلحات البحث "الأمعاء والخلية المناعية والعزلة" يكشف أكثر من 200 منشورات تصف أساليب هضم الأمعاء الدقيقة لاستخراج الخلايا المناعية. ومع ذلك، فإن البحث عن الأدب مماثلة للقولون لا تسفر عن بروتوكولات محددة جيدا تحديد عزل الخلايا المناعية من القولون. قد يكون هذا لأن القولون لديه طبقات أكثر العضلات والخلالية، مما يجعل من الصعب هضم تماما من الأمعاء الدقيقة. على عكس البروتوكولات القائمة، يستخدم هذا البروتوكول على وجه التحديد كولاجيناز E من الهتستيك Clostridium دون الكولاجين البكتيرية الأخرى (Collagenase D / Collagenase I). نحن نثبت أنه، باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تحقيق هضم الأنسجة القولونية مع الحفاظ على نوعية الخلايا المناعية أحادية النووية الأمعاء المعزولة (MNC) دون إضافة الكواشف المضادة للتكتل مثل فيرسنال الصوديوم (EDTA)، Dispase II، و ديوكسيريبونوكليس 1 (DNAse I)21،22،23. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح باستخراج قوي قابل للاستنساخ من MNC قابلة للحياة من القولون مورين لمزيد من الدراسات الموجهة، وينبغي أن تصلح لدراسة المناعة من القولون أو (مع التعديلات) الأمعاء الدقيقة24، 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

الأمعاء هي موطن لأكبر عدد من الخلايا المناعية في الجسم. أجهزة المناعة المعوية الصغيرة والكبيرة الشرطة التعرض للمستضدات الخارجية وتعديل الاستجابات للمحفزات المناعية المستمدة من الميكروبات قوية. لهذا السبب، الأمعاء هي موقع الهدف الرئيسي من خلل التنظيم المناعي والتهاب في العديد من الأمراض بما في ذلك، ولكن، لا تقتصر على أمراض الأمعاء الالتهابية مثل مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، ومرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) بعد العظام زرع نخاع (BMT)، والعديد من الحالات التحسسية والمعدية. وتستخدم نماذج مورين من التهاب الجهاز الهضمي والتهاب القولون بشكل كبير لدراسة مضاعفات GI ولتحسين استراتيجيات ما قبل السريرية للوقاية والعلاج. البيانات التي تم جمعها من هذه النماذج عن طريق العزلة والتحليل الفينوتي للخلايا المناعية من الأمعاء أمر بالغ الأهمية لمزيد من الفهم المناعي التي يمكن تطبيقها لتحسين اضطرابات الجهاز الهضمي والالتهابات الجهازية. يصف هذا التقرير بروتوكولًا عالي الفعالية لعزل الخلايا أحادية النووية (MNC) عن القولون باستخدام واجهة تدرج تدرج ية مختلطة قائمة على السيليكا. هذه الطريقة reproducibly يعزل عددا كبيرا من الكريات البيض قابلة للحياة مع التقليل من تلوث الحطام، مما يسمح اللاحقة الفينول المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي أو غيرها من الأساليب.

عند العمل مع نماذج مرض القولون المورين، فمن المفيد أن تكون قادرة على كل من القياس الكمي وتقييم نوعيا، بين MNC من القولون، والمجموعات الفرعية متعددة الخلايا المناعية المشاركة في العملية الالتهابية. وييسر تعليق الخلية الواحدة للشركات عبر الوطنية التي تم الحصول عليها من خل?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

الهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا أحادية النووية التي توجد في بروبريا لامينا القولون عن طريق الهضم الأنزيمي للأنسجة باستخدام الكولاجين. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا أحادية النووية بكفاءة مما يؤدي إلى تعليق خلية واحدة والتي بدورها يمكن استخدامها للنماذج المناعية القوية.

عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

وقد ثبت أن العزلة في تحليل فينوتوبيك للخلايا المناعية من الأمعاء باستخدام هذا البروتوكول تنطبق على فهم الاضطرابات الالتهابية الجهازية والجالية. يعزل هذا الأسلوب عددا كبيرا من الخلايا أحادية النوى قابلة للحياة عن طريق التقليل من تلوث الحطام مما يسمح في وقت لاحق الظاهري المناعي من قبل Atomistry فلور أو أساليب أخرى. كما الأمعاء هو موقع الهدف الرئيسي للالتهاب في العديد من الأمراض، وهذا البروتوكول قد تكون مفيدة لدراسة السكان المناعي المعوي في نماذج الماوس من السرطان, الحساسية, زرع, و autoimmunity.ولتحسين العائد والكفاءة في هذا البروتوكول، يوصى بإعداد الحلول والمواد الرئيسية مسبقاً كما هو مذكور. بعد القتل الرحيم الماوس وجعل شق خط الوسط الرأسي، واستخدام مقص تشريح غرامة لفتح الصفاق. باستخدام ملقط، نقل الأمعاء الدقيقة إلى جانب واحد وفضح القولون التنازلي.اسحب لأعلى قليلاً على القولون التنازلي لفضح الجزء المستقيمي من القولون إلى أقصى حد. ثم، قطع المستقيم القاصي في عمق الحوض وتشريح القولون بأكمله كوحدة واحدة من المستقيم القاصي إلى قبعة ال cecal. أولاً، ضع القولون على منشفة ورقية مبللة واستخدم الطرف الحاد لزوج من المقص أو ملقط لتطبيق ضغط خفيف على جدار الأمعاء واستخراج البراز الصلب.بعد ذلك، ضع القولون في طبق بتري واستخدم حقنة 10 ملليلتر مع إبرة مملوءة حادة عيار 18 لطرد الأمعاء مع 10 ملليلتر من مخزن القولون المبرد. ضع القولون في طبق بتري مملوء بـ 5-10 ملليلتر من مخزن القولون المبرد وينهيج يدويًا لغسل محتويات القولون المتبقية. كرر هذا الغسيل 2-3 مرات، وذلك باستخدام طبق بتري جديد يحتوي على عازلة جديدة لكل غسل.بعد ذلك، نقل القولون إلى طبق بتري جديد يحتوي على العازلة القولون المبردة الطازجة. قطع القولون طوليا من نهاية المستقيم أكثر العضلات إلى القولون القريب، لتوليد قطعة القولون مفتوحة مستطيلة واحدة. تجاهل الوسيط في الطبق واستبداله بمخزن القولون المبرد النظيف.وضع نسيج القولون مستطيلة على منشفة ورقية التي يتم ترطيبها مع العازلة القولون وقطع عليه عن طريق تشريح أفقيا ومن ثم إلى شظايا صغيرة. استخدام الملقط غرامة لجمع شظايا القولون في أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلتر من العازلة القولون المبردة. ثم، غسل الشظايا عن طريق دوامة بقوة الأنبوب لمدة 30 ثانية.بعد غسل, السماح لشظايا الأنسجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب قبل decanting أو فراغ التعرق, التأكد من تجنب فقدان شظايا الأنسجة, كرر هذه العملية غسل كامل 3 مرات باستخدام العازلة القولون الطازجة لكل غسل. للبدء، إضافة 20 ملليلتر من الكولاجين الهضم العازلة إلى أنبوب يحتوي على شظايا القولون غسلها. ختم الأنبوب ووضعها في شاكر المدارية في 37 درجة مئوية مع معدل دوران 2 مرات G لمدة 60 دقيقة.تأكد من أن شظايا الأنسجة في حركة مستمرة أثناء التحريض. أولا، صب 5 ملليلتر من 66٪ السيليكا على أساس وسائل الإعلام الفصل كثافة في كل من 3 أنابيب البولي بروبلين 15 ملليلتر منفصلة. بعد ذلك ، استخدم ماصات مصلية 25 ملليلتر لجمع فقط المابس من كولاجيناز هضم 1.تصفية supernatant من خلال 40 ميكرولتر الفقراء مرشح النسيج النسيج مصفاة وضعت في أنبوب مخروطية البولي بروبلين 50 ملليلتر نظيفة. ملء أنبوب تماما مع المبردة العازلة القولون لإخماد الكولاجين الهضم العازلة. ثم تدور الخلايا، وتتعرق وندفع، والحفاظ على بيليه على الجليد.مواصلة تنفيذ كولاجيناز الهضم 2 كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد اكتمال هضم كولاجيناز 2، طرد شظايا الأنسجة بقوة ذهابا وإيابا بين الأنبوب وحقنة 10 ملليلتر من خلال إبرة نهاية حادة قياس 18. كرر هذا التدفق لمدة 7-8 مقاطع على الأقل، وتستمر حتى لا تظهر أي شظايا الأنسجة الإجمالية أو الحطام.المقبل, تمرير تعليق تقسيم الأنسجة من خلال 40 ميكرومتر الفقراء مصفاة خلية الترشيح النسيج وضعت في أنبوب البولي بروبلين 50 ملليلتر نظيفة. ملء أنبوب إلى حافة مع العازلة القولون المبردة لإخماد الهضم والطرد المركزي في 800 مرة G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل supernatant عبر فراغ الطموح وسحب بيليه علقت من كولاجيناز الهضم 1 إلى أنبوب المقابلة لها.بعد هذا, إعادة تعليق كل بيليه في 24 ملليلتر من 44٪ السيليكا أساس كثافة فصل وسائل الإعلام لكل القولون. استخدام ماصة المصلية ملليلتر 10 ملليلتر لطبقة ببطء 8 ملليلتر من هذه الوسائط على كل من 3 أنابيب تحتوي على 66٪ سيليكا أساس كثافة وسائل الإعلام. توازن الأنابيب بعناية داخل دلاء أجهزة الطرد المركزي باستخدام مقياس الوزن أو التوازن.جهاز طرد مركزي في 859 مرات G في 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة دون كسر. السماح للقضبان تأتي لاستكمال الراحة قبل إزالة الأنابيب، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا في واجهة التدرج. أولاً، تصور واجهة التدرج بالقرب من علامة 5 ملليلتر، حيث عادةً ما يكون هناك شريط أبيض سميك يبلغ 1-2 ملليلتر.فراغ التعرق وتجاهل أعلى 7 ملليلترات من التدرج للسماح أسهل وصول ماصة إلى واجهة. باستخدام شفط مستمر اليدوي وثبات حركة المعصم الدورية، وجمع طبقة واجهة من الخلايا. جمع حتى واجهة بين التدرجين واضح والانكسار ونقل واجهة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر البولي بروبلين المخروطية.بعد ذلك، إضافة FACS العازلة لهذا الحوض حتى يصل إجمالي تعليق 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم, الطامح عن طريق التطلع فراغ وإعادة تعليق بيليه في 1 ملليلتر من FACS العازلة.يمكن استخدام الإجراء الموصوف في هذا الفيديو لعزل الخلايا أحادية النوى عن القولون أو، مع تعديلات، من الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء تحليل الخلايا والبيانات لمقارنة الكسور من الخلايا الليمفاوية المبرمجة والنخرية / الميتة عند استخدام إما Collagenase E أو D لعزل، مع دينا دون DNAse 1 العلاج. بعد Annexin 5 وقابلة للإصلاح حية حية صبغة زرقاء ميتة تلطيخ على تعليق خلية واحدة بعد كل عزلة، أظهر Collagenase E دون DNAse نسبة أعلى بكثير من الخلايا الحية بعد العزلة بالمقارنة مع كولاجيناز D دون DNAse.حتى بالمقارنة مع أي collagenase مع DNAse. بالإضافة إلى ذلك، حددنا الخلايا النخرية بنسبة متوسطة تبلغ 41.0٪ في مجموعة Collagenase E مقابل 90.0٪ في مجموعة Collagenase D. 75.9٪ في مجموعة كولاجيناز E DNAse و 80.3٪ في مجموعة كولاجيناز D D.ثم يتم تطبيق قياس تدفق متعدد perimetric إلى MNC معزولة عن CD45.2 صمام- C الفئران المتلقي في اليوم 7 بعد تلقي BMT أو إما نماذج BMT الالجينية أو سينجينيك. يتم حساب متوسط الأرقام المطلقة لـ "المانحة CD4" الإيجابية وC8 الخلايا T-positive المستخرجة من القولون المتلقي BMT ومقارنتها. لذلك يمكن أن يكون من المهم تحديد و / أو كميات مجموعات الخلايا المناعية النادرة في نماذج الماوس هذه.يتم تقييم المجموعات الفرعية النادرة، بما في ذلك الخلايا التنظيمية T الإيجابية المشتقة من FOX-P3 المشتقة من الجهات المانحة في كل من نماذج BMT السينية واللوجينية. باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل حتى مجموعات فرعية نادرة، مثل المانحة مشتقة القولون T التنظيمية تسلل القولون الماوس المتلقي، بعد BMT. وتجدر الإشارة إلى أن كولاجيناز E نشط عند 37 درجة مئوية.لذلك ينبغي أن تكون جميع حلول الكولاجين ساخنة مسبقاً لنشاط الكولاجين الكافي وإخمادها بدقة لإنهاء النشاط. يسمح هذا البروتوكول لعدد كبير من الخلايا أحادية النوى التي يمكن استخدامها للتوصيف اللاحق من قبل Fleur cytometry ، وتقنيات البيولوجيا الجزيئية ، والمجهر ، والثقافة ، وموقع ، من بين أمور أخرى. قدم هذا البروتوكول تقييمًا يمكن الاعتماد عليه للالتهاب في القولون من الفئران التجريبية مقابل التي تسيطر عليها في نموذج زرع نخاع العظم.وبالتالي تسهيل اكتشاف آليات جديدة مناعية تنظيمية للتسامح زرع. Collagenase من Clostridium Istoliticum هو كاشف التي ينبغي التعامل معها مع تقنيات السلامة المختبر. وهو يشكل خطرا على الصحة عند استنشاقه وقد يسبب تهيج الجلد والعين.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

عزل خلايا سيرتولي وPeritubular الخلايا من الفئران الخصية

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...