Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Grants #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus, der anvendes i denne undersøgelse blev enten opdrættet i vores facilitet eller leveres af Jackson Labs eller Taconic.

Alle undersøgelser blev gennemført i henhold til gnaver forskningsprotokoller, som blev gennemgået og godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved University of Miami Miller School of Medicine, som opfylder de veterinære standarder, der er fastsat af American Association for Forsøgsdyrsvidenskab (AALAS).
1. forberedelse af løsninger
<ol><li>
Som beskrevet i tabel 1, forberede Colon buffer, silica-baserede tæthed adskillelse medier 100%, silica-bas...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Denne visuelle protokol beskriver veltolereret metoder til isolering af koloniske mononukleare celler, herunder lamina propria lymfocytter (LPL). I betragtning af, at denne protokol blev optimeret til at evaluere alvorlige post-transplantation muse colitis modeller, hvor inflammatoriske cytokiner og vævsskade egner sig til dårlig levedygtighed af genvundet MNC, vi forventer, at disse metoder kan oversættes til andre applikationer, der kræver fænotypisk analyse af Colon MNC. Disse omfatter, men, er ikke begrænset ti...

Selvom mave-tarmkanalen primært er dedikeret til behandling og reabsorption af næringsstoffer fra fødevarer, bevarer GI-kanalen også centrale roller i integriteten af vaskulære, lymfe-og nervesystemer og mange andre organer gennem dets slimhinde og submucosale immunsystem1. GI immunsystemet har en indflydelsesrig rolle i både gastrointestinal og systemisk sundhed på grund af sin konstante udsættelse for udenlandske antigener fra fødevarer, kommensal bakterier, eller invaderende patogener1,2. Således, GI immunsystemet skal opretholde en delikat balance, hvor det tolererer ikke-patogene antigener samtidig reagere passende på patogene antigener1,2. Når balancen i tolerance og forsvar er forstyrret, lokaliseret eller systemisk immun dysregulering og betændelse kan forekomme resulterer i et utal af sygdomme1,2,3.
Tarmen havne mindst 70% af alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære immunologiske interaktioner involverer mindst én af tre immun stationer i tarmen: 1) Peyers patches, 2) Intraepiteliale lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria lymfocytter (LPL). Hver af disse består af et komplekst sammenkoblet netværk af immunceller, der hurtigt reagerer på normale immun udfordringer i tarmen5. Begrænset til stroma over muscularis mucosae, den løst strukturerede lamina propria er bindevæv i tarmslimhinden og omfatter stilladser til villus, Vaskulaturen, lymfedrænage og slimhinde nervesystem, samt mange medfødte og adaptive immun undersæt6,7,8,9. LPL består af CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentligt forhold på 2:1, plasmaceller og myeloid Lineage celler herunder, dendritiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.
Der er en stigende interesse i at forstå immun dysregulering og betændelse i tarmen, da det vedrører forskellige sygdomstilstande. Sådanne tilstande som Crohns sygdom og colitis ulcerosa alle manifesterer varierende niveauer af Colon inflammation10,11,12. Desuden kan patienter med maligne eller ikke-maligne lidelser i marv eller immunsystemet, som gennemgår en allogen knoglemarvstransplantation (Allo-BMT), udvikle forskellige former for colitis, herunder 1) direkte toksicitet fra konditioneringsregimer før BMT, 2) infektioner forårsaget af immunsuppression efter BMT og 3) graft-versus-Host sygdom (gvhd) drevet af donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vævet efter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikationer resulterer i betydelige ændringer i immunforsvaret af tarmene16,17,18. Den foreslåede metode muliggør en pålidelig vurdering af immuncelle akkumulering i muse tyktarmen og, når den anvendes til murine modtagere efter BMT, letter en effektiv analyse af både donor og recipient immunceller involveret i transplantations tolerance19 ,20. Yderligere årsager til tarmbetændelse omfatter maligniteter, fødevareallergi, eller afbrydelse af tarm mikrobiome. Denne protokol giver adgang til Gut mononukleare celler fra tyktarmen og, med ændringer, til leukocytter af tyndtarm i nogen af disse prækliniske murine modeller.
En PubMed søgning ved hjælp af søgeordene "tarm og immuncelle og isolation" afslører over 200 publikationer, der beskriver metoder til tyndtarm fordøjelse til at udtrække immunceller. Men en lignende litteratursøgning for Colon giver ingen velafgrænsede protokoller, der specificerer isolering af immunceller fra tyktarmen. Dette kan være fordi tyktarmen har mere muskuløs og interstitiel lag, hvilket gør det vanskeligere at helt fordøje end den lille tarm. I modsætning til eksisterende protokoller, denne protokol specifikt bruger collagenase E fra Clostridium histolyticum uden andre bakterielle kollagenaser (collagenase D/collagenase I). Vi viser, at ved hjælp af denne protokol, kan fordøjelsen af det koloniske væv opnås samtidig bevare kvaliteten af isolerede tarm mononukleiske immunceller (MNC) uden tilsætning af anti-clumping reagenser såsom natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Denne protokol er optimeret til at tillade reproducerbar robust udvinding af levedygtige MNC fra murine kolon for yderligere rettet undersøgelser og bør egner sig til studiet af immunologi af tyktarmen eller (med ændringer) tyndtarmen24, 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

Tarmen er hjemsted for det største antal immunceller i kroppen. De små og store tarm immun systemer politi eksponering for eksogene antigener og moduere responser på potente mikrobielt afledte immun stimuli. Af denne grund, tarmen er et stort mål sted for immun dysregulering og betændelse i mange sygdomme, herunder, men ikke begrænset til inflammatoriske tarmsygdomme såsom Crohns sygdom og colitis ulcerosa, graft-versus-Host sygdom (GVHD) efter knogle knoglemarv transplantation (BMT), og mange allergiske og smitsomme tilstande. Murine modeller af gastrointestinal inflammation og colitis er stærkt anvendt til at studere GI komplikationer og til præ-klinisk optimere strategier for forebyggelse og behandling. Data hentet fra disse modeller via isolation og fænotypisk analyse af immunceller fra tarmen er afgørende for yderligere immun forståelse, der kan anvendes til at forbedre gastrointestinale og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapport beskriver en meget effektiv protokol til isolering af mononukleare celler (MNC) fra tyktarmen ved hjælp af en blandet silica-baseret tæthed gradient interface. Denne metode reproducerbart isolerer et betydeligt antal levedygtige leukocytter samtidig minimere kontaminerende snavs, tillader efterfølgende immun fænotypebestemmelse ved flow cytometri eller andre metoder.

Når du arbejder med murine tyktarms sygdom modeller, det er nyttigt at være i stand til både kvantificere og kvalitativt vurdere, blandt MNC af tyktarmen, flere immunceller undergrupper involveret i den inflammatoriske proces. Single-cellesuspension af MNC opnået gennem anvendelsen af denne protokol letter sådanne fænotypiske karakterisering i en robust og reproducerbar måde. Som et bevis på princippet for anvendelsen af denne isolationsmetode under forskellige eksperimentelle ind...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Målet med denne protokol er at isolere mononukleare celler, der bor i lamina propria i tyktarmen ved enzymatisk fordøjelse af vævet ved hjælp af collagenase. Denne protokol giver mulighed for effektiv isolering af mononukleare celler, hvilket resulterer i en enkelt cellesuspension, som igen kan bruges til robust immunophenotyping.

Isolering af lamina propria mononukleare celler fra murine Colon ved hjælp af collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolation i fænokomypisk analyse af immunceller fra tarmen ved hjælp af denne protokol har vist sig gældende for forståelsen af GI og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne metode isolerer et betydeligt antal levedygtige mononukleare celler ved at minimere forurenende snavs, der tillader efterfølgende immunhenotyping ved Fleurs atomistrium eller andre metoder. Da tarmen er et vigtigt målsted for betændelse i mange sygdomme, denne protokol kan være nyttige for studiet af tarmim immunpopulationer i musemodeller af kræft, allergi, transplantation, og autoimmunitet.For at optimere udbyttet og effektiviteten af denne protokol anbefales det, at vigtige løsninger og materialer forberedes på forhånd som nævnt. Efter aflive musen og gøre en lodret midterlinjen snit, bruge fine dissektion saks til at åbne bughinden. Brug afcespævring, flytte tyndtarmen til den ene side og udsætte faldende kolon.Træk lidt opad på faldende kolon for at maksimalt udsætte rektal del af tyktarmen. Derefter skæres den distale endetarm dybt i bækkenet og dissekere hele tyktarmen som en enhed fra den distale endetarm til cecal cap. Først skal du placere tyktarmen på en fugtet køkkenrulle og bruge den stumpe ende af en saks eller fortræt til at anvende mildt pres på tarmvæggen og udtrække den faste afføring.Dernæst placere kolon i en petriskål og bruge en 10 milliliter sprøjte med en 18-gauge stump fyldt nål til at skylle tarmen med 10 milliliter kølet kolon buffer. Placer tyktarmen i en petriskål fyldt med 5-10 milliliter kølet kolon buffer og agitere manuelt at vaske de resterende colon indhold. Gentag denne vask 2-3 gange, ved hjælp af en ny petriskål, der indeholder frisk buffer for hver vask.Efter dette, overføre tyktarmen til en ny petriskål, der indeholder frisk kølet kolon buffer. Skær tyktarmen langsgående fra sin mere muskuløse rektal ende til den proksimale kolon, at generere en enkelt rektangulær åben kolon stykke. Medianen kasseres i skålen, og den erstattes med ren kølet kolonbuffer.Placer rektangulære kolon væv på en køkkenrulle, der er fugtet med kolon buffer og skære det ved at skære det vandret og derefter i små fragmenter. Brug fine kraftbefængte til at samle kolonfragmenterne i et 50 milliliter polypropylenkonisk rør, der indeholder 20 milliliter kølet tyktarmsbuffer. Derefter vaskes fragmenterne ved kraftigt at hvirvle røret i 30 sekunder.Efter vask, lad væv fragmenter bosætte sig til bunden af røret, før dekantering eller vakuum aspirere supernatant, Sørg for at undgå at miste væv fragmenter, gentag hele denne vaskeproces 3 gange ved hjælp af frisk kolon buffer for hver vask. Til at begynde, tilføje 20 milliliter kollagenase fordøjelse buffer til røret, der indeholder de vaskede kolon fragmenter. Forsegle røret og placere den i en orbital shaker ved 37 grader Celsius med en rotationshastighed på 2 gange G i 60 minutter.Sørg for, at vævsfragmenterne er i konstant bevægelse under omrøring. Først hældes 5 milliliter 66% silica baseret tæthedsadskillelsesmedie i hver af 3 separate 15 milliliter polypropylenrør. Brug derefter en 25 milliliter serologisk pipette til kun at indsamle supernatanten fra Collagenase Digestion 1.Supernatanten filtreres gennem et 40 mikroliterfattige filtreringsstofcellestiter, der er placeret i et rent 50 milliliter polypropylenkonisk rør. Fyld røret helt med kølet kolon buffer til at slukke kollagenase fordøjelsen buffer. Drej derefter cellerne, aspirere supernatanten, og hold pellet på is.Fortsæt med at udføre Collagenase Digestion 2 som beskrevet i tekstprotokollen. Når Kollagenase fordøjelse 2 er afsluttet, skylles vævsfragmenterne kraftigt frem og tilbage mellem røret og en 10 milliliter sprøjte gennem en 18-gauge stump ende nål. Gentag denne skylning i mindst 7-8 passager, fortsætter, indtil ingen bruttovævsfragmenter eller debri er synlige.Dernæst passerer vævsafspredning suspension gennem en 40 mikrometer dårlig filtrering stof celle si placeret i en ren 50 milliliter polypropylen rør. Fyld røret til fælgen med kølet tyktarm buffer til at slukke fordøjelsen og centrifuge ved 800 gange G i ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Kassér supernatanten via vakuumaspiration og træk den re suspenderede pellet fra Collagenase Digestion 1 til det tilsvarende rør.Derefter skal hver pellet suspenderes igen i 24 milliliter 44%silicabaseret tæthedsadskillelsesmedie pr. kolon. Brug en 10 milliliter serologisk pipette til langsomt lag 8 milliliter af dette medie på hver af 3 rør, der indeholder 66% silica baseret tæthed adskillelse medier. Vægten forsigtigt rørene i centrifugespande ved hjælp af en vægtskala eller en balance.Centrifuge ved 859 gange G i ved 20 grader Celsius i 20 minutter uden pause. Lad stavlene komme til at hvile, før du fjerner rør, idet pas på ikke at forstyrre cellerne på gradient interface. Først visualisere gradient interface nær 5 milliliter mærke, hvor typisk en 1-2 milliliter tyk hvid bånd er til stede.Vakuum aspirere og kassér de øverste 7 milliliter af gradienten for at give lettere pipette adgang til grænsefladen. Ved hjælp af kontinuerlig manuel suge og stabil roterende håndled bevægelse, indsamle grænsefladen lag af celler. Opsaml indtil grænsefladen mellem de to gradienter er klar og brydningsglas og overføre grænsefladen til en ny 50 milliliter polypropylen konisk rør.Dernæst tilføje FACS Buffer til dette badekar, indtil den samlede suspension når 50 milliliter. Centrifuge ved 800 gange G i ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Derefter aspirere supernatant via vakuum aspiration og re suspendere pellet i 1 milliliter FACS Buffer.Den procedure, der er beskrevet i denne video kan bruges til at isolere mononukleare celler fra tyktarmen eller, med ændringer, fra tyndtarmen. Plus, cytometri og dataanalyse udføres for at sammenligne fraktioner af apoptotiske og nekrotiske / døde lymfocytter, når du bruger enten Collagenase E eller D for isolering, med vores uden DNAse 1 behandling. Efter annexin 5 og fikserbar levende døde blå farvefarvning på encellesuspensioner efter hver isolering viste Collagenase E uden DNAse en signifikant højere procentdel af levende celler efter isolation sammenlignet med Collagenase D uden DNAse.Selv når man sammenligner med enten kollagenase med DNAse. Derudover identificerede vi nekrotiske celler med en median procent på 41,0% i Kollagen E-gruppen versus 90,0% i Kollagenase D-gruppen. 75,9% i Kollagenase E DNAse-gruppen og 80,3% i Kollagen D DNAse-gruppen.Multi perimetrisk flow cytometri påføres derefter MNC isoleret fra CD45.2 ventil-C modtager mus på dag 7 efter at have modtaget BMT eller enten allogene eller syngeneic BMT modeller. De gennemsnitlige absolutte tal for Donor CD4 positive og CD8 positive T-celler udvundet fra BMT modtagerens kolon beregnes og sammenlignes. Så det kan være vigtigt at identificere og / eller quantitate sjældne immuncellepopulationer i sådanne musemodeller.Sjældne delmængder, herunder donorbaserede FOX-P3-positive T-regulatoriske celler, vurderes i både syngeneiske og allogene BMT-modeller. Ved hjælp af denne metode, selv sjældne delmængder, såsom donor afledt colon T regulerende infiltrerende modtager mus kolon, efter BMT, kan analyseres. Det skal bemærkes, at Collagenase E er aktiv ved 37 grader Celsius.Så alle kollagen løsninger bør være forvarmt for tilstrækkelig kollagenase aktivitet og grundigt slukket for at opsige aktivitet. Denne protokol giver mulighed for et stort antal mononukleare celler, der kan bruges til efterfølgende karakterisering af en Fleur cytometri, molekylærbiologi teknikker, mikroskopi, kultur, og stedet for, blandt andre. Denne protokol gav en pålidelig vurdering af inflammation i tyktarmen af eksperimentelle versus kontrollerede mus i en knoglemarvstransplantation model.Således lette opdagelsen af nye regulerende immunmekanismer af transplantation tolerance. Collagenase fra Clostridium Istoliticum er et reagens, der skal håndteres med lab sikkerhedsteknikker. Det udgør en sundhedsfare ved indånding og kan forårsage hud- og øjenirritation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolation, behandling og analyse af murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering af murine lymfeknuder stromacellers

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering af Sertoliceller og peritubulære Celler fra rotte Testikler

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrianalyse gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolering af ekstracellulære vesikler fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske ved hjælp af en ultrafiltrering centrifugering teknik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolering af spyt Epiteliale celler fra humane spytkirtler til in vitro-vækst som Salisfærer eller Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

Flotationsbaseret T-celleisolering, aktivering og ekspansion fra mononukleære celleprøver fra humant perifert blod ved hjælp af mikrobobler

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...