Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies #1K08HL088260 en #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), en de Batchelor Foundation voor pediatrisch onderzoek (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 en BALB/c muizen die in deze studie werden gebruikt, werden ofwel gefokt in onze faciliteit of geleverd door Jackson Labs of Taconic.

Alle studies werden uitgevoerd onder onderzoeksprotocollen voor knaagdieren die werden beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami Miller school of Medicine, die voldoet aan de veterinaire normen vastgesteld door de American Association voor laboratoriumdieren Wetenschappen (AALAS).
1. voorbereiding van de oplossingen
<ol><li>
Zoals beschreven in tabel 1, bereid de Colon buffer, op silica gebaseerde dichtheids...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Dit visuele protocol beschrijft goed getolereerde methoden voor de isolatie van Colon mononucleaire cellen, waaronder lamina propria lymfocyten (LPL). Gezien het feit dat dit protocol is geoptimaliseerd in de evaluatie van ernstige post-transplantatie muis colitis modellen waar inflammatoire cytokines en weefsel letsel lenen zich voor een slechte levensvatbaarheid van teruggewonnen MNC, we verwachten dat deze methoden kunnen worden vertaald naar andere toepassingen die fenotypische analyse van Colon MNC vereisen. Deze om...

Hoewel de gastro-intestinale (GI) tractus is voornamelijk gewijd aan de verwerking en reabsorptie van voedingsstoffen uit voedsel, het GI-tractus onderhoudt ook centrale rollen in de integriteit van de vasculaire, lymfatische, en zenuwstelsel en van tal van andere organen via het mucosale en submucosale immuunsysteem1. Het GI-immuunsysteem heeft een invloedrijke rol in zowel de gastro-intestinale en systemische gezondheid als gevolg van de constante blootstelling aan buitenlandse antigenen uit voedsel, commensale bacteriën, of binnenvallende pathogenen1,2. Zo moet het GI-immuunsysteem een delicaat evenwicht behouden waarin het niet-pathogene antigenen tolereert terwijl het adequaat reageert op pathogene antigenen1,2. Wanneer de balans van tolerantie en verdediging wordt verstoord, gelokaliseerde of systemische immuun disregulatie en ontsteking kan optreden resulterend in een groot aantal ziekten1,2,3.
De darm herbergt ten minste 70% van alle lymfoïde cellen in het lichaam4. De meeste primaire immunologische interacties betreffen ten minste één van de drie immuunstations in de darm: 1) Peyer's patches, 2) Intraepitheliale lymfocyten (IEL) en 3) lamina propria lymfocyten (LPL). Elk van deze bestaat uit een complex verbonden netwerk van immuuncellen die snel reageren op normale immuunproblemen in de darm5. Beperkt tot de stroma boven de Muscularis mucosae, de losjes gestructureerde lamina propria is het bindweefsel van het darm slijmvlies en omvat steigers voor de villus, de vasculatuur, lymfedrainage, en mucosale zenuwstelsel, evenals vele aangeboren en adaptieve immune deelverzamelingen6,7,8,9. LPL bestaat uit CD4+ -en CD8+ T-cellen in een geschatte verhouding van 2:1, plasmacellen en myeloïde Lineage cellen, waaronder dendritische cellen, mestcellen, eosinofielen en macrofagen6.
Er is een groeiende belangstelling voor het begrijpen van de immuun disregulatie en ontsteking van de darm als het betrekking heeft op verschillende ziektetoestanden. Dergelijke aandoeningen als de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa manifesteren alle verschillende niveaus van Colon ontsteking10,11,12. Bovendien kunnen patiënten met maligne of niet-maligne aandoeningen van het merg of het immuunsysteem die een allogene beenmergtransplantatie ondergaan (Allo-BMT) verschillende vormen van colitis ontwikkelen, waaronder 1) directe toxiciteit van conditionerings regimes vóór BMT, 2) infecties veroorzaakt door immunosuppressie na BMT en 3) Graft-versus-hostziekte (gvhd) die wordt aangedreven door donor-type T cellen die reageren op donor Allo-antigenen in de weefsels na BMT13,14,15. Al deze complicaties na BMT resulteren in significante veranderingen in het immuunmilieu van de darmen16,17,18. De voorgestelde methode maakt een betrouwbare beoordeling van de accumulatie van immune cellen in de muis Colon mogelijk en, wanneer toegepast op muriene ontvangers na BMT, vergemakkelijkt een efficiënte assay van zowel donor-als ontvangende immuuncel die betrokken zijn bij transplantatie tolerantie19 ,20. Extra oorzaken van ontsteking van de darm zijn maligniteiten, voedselallergieën, of verstoring van het microbioom van de darmen. Dit protocol biedt toegang tot de darm mononucleaire cellen van de dikke darm en, met wijzigingen, aan leukocyten van de dunne darm in een van deze preklinische Murine modellen.
Een PubMed zoeken met behulp van de zoektermen "darm en immune cel en isolatie" onthult meer dan 200 publicaties beschrijven methoden voor de spijsvertering van de dunne darm om immune cellen te extraheren. Echter, een soortgelijke literatuur zoeken naar Colon levert geen goed afgebakende protocollen specificeren isolatie van immune cellen van de dikke darm. Dit kan zijn omdat de dikke darm meer gespierde en interstitiële lagen heeft, waardoor het moeilijker om volledig te verteren dan de dunne darm. In tegenstelling tot bestaande protocollen, gebruikt dit protocol specifiek Collagenase E van Clostridium histolyticum zonder andere bacteriële collagenasen (Collagenase D/Collagenase I). We tonen aan dat, met behulp van dit protocol, de vertering van het Colon weefsel kan worden bereikt met behoud van de kwaliteit van geïsoleerde gut mononucleaire immuuncellen (MNC) zonder toevoeging van anti klonter reagentia zoals natrium versenate (EDTA), Dispase II, en deoxyribonuclease i (DNase i)21,22,23. Dit protocol is geoptimaliseerd om toe te staan reproduceerbare robuuste extractie van levensvatbaar MNC van de Murine Colon voor verdere gerichte studies en moet zich lenen voor de studie van immunologie van de dikke darm of (met modificaties) de dunne darm24, 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

De darm is de thuisbasis van het grootste aantal immuuncellen in het lichaam. De kleine en grote intestinale immuun systemen politie blootstelling aan exogene antigenen en moduleren reacties op krachtige microbieel afgeleide immuun stimuli. Om deze reden, de darm is een belangrijke doelsite van immuun disregulatie en ontsteking bij vele ziekten, met inbegrip van maar, niet beperkt tot inflammatoire darmziekten zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, transplantaat-versus-host ziekte (GVHD) na bot beenmergtransplantatie (BMT), en vele allergische en infectieuze aandoeningen. Murine modellen van gastro-intestinale ontsteking en colitis worden intensief gebruikt voor het bestuderen van GI complicaties en vooraf klinisch optimaliseren strategieën voor preventie en behandeling. Gegevens uit deze modellen via isolatie en fenotypische analyse van immuuncellen uit de darm is van cruciaal belang voor verder immuun begrip dat kan worden toegepast op het verzachten van gastro-intestinale en systemische inflammatoire aandoeningen. Dit rapport beschrijft een zeer effectief protocol voor de isolatie van mononucleaire cellen (MNC) van de dikke darm met behulp van een gemengde dichtheidsgradiënt interface op basis van silica. Deze methode reproduceert een significant aantal levensvatbare leukocyten, terwijl het contaminerende vuil minimaliseert, waardoor daaropvolgende immuunfenotyping door Flowcytometrie of andere methoden mogelijk is.

Bij het werken met Murine Colon ziekte modellen, het is nuttig om te kunnen zowel kwantificeren en kwalitatief beoordelen, onder de MNC van de dikke darm, meerdere immuuncelsubgroepen betrokken bij het ontstekingsproces. De eencellige suspensie van MNC verkregen door toepassing van dit protocol vergemakkelijkt dergelijke fenotypische karakterisering op een robuuste en reproduceerbare manier. Als een bewijs van principe voor de toepassing van deze isolatiemethode onder diverse experimentel...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolatie in fenotypische analyse van immuuncellen uit de darm met behulp van dit protocol zijn van toepassing gebleken op het begrip van GI en systemische ontstekingsstoornissen. Deze methode isoleert een aanzienlijk aantal levensvatbare mononucleaire cellen door het minimaliseren van vervuilend puin waardoor latere immuun fenotypering door Fleur's Atomistry of andere methoden. Aangezien de darm is een belangrijke doelplaats van ontsteking in veel ziekten, dit protocol kan nuttig zijn voor de studie van de darm immuun populaties in muismodellen van kanker, allergie, transplantatie, en auto-immuniteit.Om de opbrengst en efficiëntie van dit protocol te optimaliseren, wordt aanbevolen om belangrijke oplossingen en materialen vooraf te voorbereiden, zoals opgemerkt. Na het euthanaseren van de muis en het maken van een verticale middellijn incisie, gebruik fijne dissectie schaar om het buikvlies te openen. Met behulp van tangen, verplaats de dunne darm aan de ene kant en bloot de dalende dikke darm.Trek iets omhoog op de dalende dikke darm om het rectale gedeelte van de dikke darm maximaal bloot te leggen. Snijd vervolgens het distale rectum diep in het bekken en ontleed de hele dikke darm als één eenheid van het distale rectum tot de cecal cap. Plaats eerst de dikke darm op een bevochtigde papieren handdoek en gebruik het stompe uiteinde van een schaar of tang om milde druk op de darmwand toe te passen en de vaste ontlasting te extraheren.Plaats vervolgens de dikke darm in een petrischaaltje en gebruik een 10 milliliter spuit met een 18-gauge botte gevulde naald om de darm te spoelen met 10 milliliter gekoelde dikke darmbuffer. Plaats de dikke darm in een petrischaal gevuld met 5-10 milliliter gekoelde dikke darm buffer en roeren handmatig om de resterende darminhoud te wassen. Herhaal deze was 2-3 keer, met behulp van een nieuwe petrischaal met verse buffer voor elke wasbeurt.Breng hierna de dikke darm over naar een nieuwe petrischaal met verse gekoelde dikke darmbuffer. Snijd de dikke darm in de lengterichting van de meer gespierde rectale einde aan de proximale dikke darm, om een enkele rechthoekige open dikke darm stuk te genereren. Gooi de mediaan in de schotel en vervang deze door schone gekoelde dikke darmbuffer.Plaats de rechthoekige dikke darm weefsel op een papieren handdoek die is bevochtigd met dikke darm buffer en snijd het door het horizontaal snijden en vervolgens in kleine fragmenten. Gebruik fijne tangen om de dikke darm fragmenten te verzamelen in een 50 milliliter polypropyleen kegelvormige buis met 20 milliliter van gekoelde dikke darm buffer. Was vervolgens de fragmenten door de buis gedurende 30 seconden krachtig te wervelen.Laat na de wasbeurt de weefselfragmenten zich op de bodem van de buis nestelen voordat u de supernatant decanteert of stofzuigt, zorg ervoor dat u weefselfragmenten niet verliest, herhaal dit hele wasproces 3 keer met behulp van verse dubbele puntbuffer voor elke wasbeurt. Om te beginnen, voeg 20 milliliter collagenase spijsvertering buffer aan de buis met de gewassen dikke darm fragmenten. Verzegel de buis en plaats deze in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius met een rotatiesnelheid van 2 keer G gedurende 60 minuten.Zorg ervoor dat de weefselfragmenten constant in beweging zijn tijdens het roeren. Giet eerst 5 milliliter van 66% op silica gebaseerde dichtheidsscheidingsmedia in elk van 3 afzonderlijke 15 milliliter polypropyleenbuizen. Gebruik vervolgens een serologische pipet van 25 milliliter om alleen de supernatant van Collagenase Digestion 1 te verzamelen.Filter de supernatant door een 40 microliter slechte filtratie stof cel zeef geplaatst in een schone 50 milliliter polypropyleen conische buis. Vul de buis volledig met gekoelde dikke darm buffer om de collagenase spijsvertering buffer te blussen. Draai dan de cellen, aspirate de supernatant, en houd de pellet op ijs.Ga door met het uitvoeren van Collagenase Digestion 2 zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat Collagenase Digestion 2 is voltooid, spoel de weefselfragmenten krachtig heen en weer tussen de buis en een 10 milliliter spuit door een 18-gauge stompe eindnaald. Herhaal deze flush voor ten minste 7-8 passages, voortzetting totdat er geen bruto weefselfragmenten of debri zichtbaar zijn.Vervolgens passeren het weefsel disaggregatie suspensie door middel van een 40 micrometer slechte filtratie stof cel zeef geplaatst in een schone 50 milliliter polypropyleen buis. Vul de buis aan de rand met gekoelde dikke darm buffer om de spijsvertering te blussen en centrifuge op 800 keer G in bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant via vacuüm aspiratie en trek de opnieuw opgehangen pellet van Collagenase Digestion 1 naar de bijbehorende buis.Na deze, opnieuw opschorten elke pellet in 24 milliliter van 44%silica gebaseerde dichtheid scheiding media per dikke darm. Gebruik een 10 milliliter serologische pipet om langzaam laag 8 milliliter van deze media op elk van de 3 buizen met 66%silica gebaseerde dichtheid scheiding media. Breng de buizen in centrifugebakken zorgvuldig in balans met een weegschaal of een balans.Centrifuge op 859 keer G in bij 20 graden Celsius gedurende 20 minuten zonder de pauze. Laat de roders om te komen tot rust te komen voordat het verwijderen van buizen, zorg ervoor dat niet te verstoren de cellen op de gradiënt interface. Visualiseer eerst de verloopinterface in de buurt van het 5 milliliterteken, waar meestal een 1-2 milliliter dikke witte band aanwezig is.Vacuüm aanzuigen en gooi de bovenste 7 milliliter van de helling om gemakkelijker pipet toegang tot de interface. Met behulp van continue handmatige zuigkracht en gestage roterende polsbeweging, het verzamelen van de interface laag van cellen. Verzamel totdat de interface tussen de twee hellingen duidelijk is en refractile en breng de interface over naar een nieuwe 50 milliliter polypropyleen conische buis.Voeg vervolgens FACS Buffer toe aan dit bad totdat de totale suspensie 50 milliliter bereikt. Centrifuge op 800 keer G in bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Dan, aspirate de supernatant via vacuüm aspiratie en opnieuw op te schorten de pellet in 1 milliliter van FACS Buffer.De procedure beschreven in deze video kan worden gebruikt om mononucleaire cellen te isoleren van de dikke darm of, met wijzigingen, van de dunne darm. Bovendien wordt cytometrie en gegevensanalyse uitgevoerd om de fracties van apoptotische en necrotische/dode lymfocyten te vergelijken bij het gebruik van Collagenase E of D voor de isolatie, met onze zonder DNAse 1-behandeling. Na bijlage 5 en vast te stellen levende dode blauwe kleurstof op eencellige suspensies na elke isolatie, vertoonde Collagenase E zonder DNAse een aanzienlijk hoger percentage levende cellen na isolatie in vergelijking met Collagenase D zonder DNAse.Zelfs in vergelijking met een van beide collagenase met DNAse. Daarnaast identificeerden we necrotische cellen met een mediaanpercentage van 41,0% in de Collagenase E-groep versus 90,0% in de Collagenase D-groep. 75,9% in de Collagenase E DNAse-groep en 80,3% in de Groep Collagenase DNAse.Multi perimetrische stroomcytometrie wordt vervolgens toegepast op MNC geïsoleerd van CD45.2 klep-C ontvanger muizen op dag 7 na ontvangst van BMT of allogene of syngeneic BMT modellen. De gemiddelde absolute aantallen Donor CD4 positieve en CD8 positieve T-cellen gewonnen uit de BMT ontvanger dikke darm worden berekend en vergeleken. Het kan dus belangrijk zijn om zeldzame immuuncelpopulaties in dergelijke muismodellen te identificeren en/of te kwantificeren.Zeldzame subsets, waaronder door donoren afgeleide FOX-P3 positieve T-regulerende cellen worden beoordeeld in zowel syngeneic als allogene BMT-modellen. Met behulp van deze methode, zelfs zeldzame subsets, zoals donor afgeleide colonic T regelgevende infiltrerende ontvanger muis dikke darm, na BMT, kan worden geanalyseerd. Opgemerkt moet worden dat Collagenase E actief is bij 37 graden Celsius.Dus alle collagenase oplossingen moeten worden voorverwarmd voor voldoende collagenase activiteit en grondig geblust om activiteit te beëindigen. Dit protocol maakt een groot aantal mononucleaire cellen mogelijk die kunnen worden gebruikt voor latere karakterisering door een Fleur cytometrie, moleculaire biologietechnieken, microscopie, cultuur en plaats van o.a. Dit protocol voorzag in een betrouwbare beoordeling van ontsteking in de dikke darm van experimentele versus gecontroleerde muizen in een beenmergtransplantatiemodel.Aldus vergemakkelijkend de ontdekking van nieuwe regelgevende immune mechanismen van transplantatietolerantie. Collagenase van Clostridium Istoliticum is een reagens dat moet worden behandeld met lab veiligheidstechnieken. Het vormt een gevaar voor de gezondheid bij inademing en kan huid- en oogirritatie veroorzaken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolatie van Sertoli cellen en peritubulaire Cellen van Rat Testikels

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...