Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
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Ce travail a été appuyé par des subventions #1K08HL088260 et #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), et la Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Les souris C57BL/6 et BALB/c utilisées dans cette étude ont été élevées dans notre établissement ou fournies par Jackson Labs ou Taconic.

Toutes les études ont été menées dans le cadre de protocoles de recherche sur les rongeurs examinés et approuvés par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université de Miami Miller School of Medicine, qui répond aux normes vétérinaires établies par l'American Association pour les sciences animales de laboratoire (AALAS).
1. Préparation de solutions
<ol><li>
Comme décrit dans le tableau 1, préparez le tampon de colon, les médias de séparation de d...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. 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J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Ce protocole visuel décrit des méthodes bien tolérées pour l'isolement des cellules mononucléaires du côlon, y compris les lymphocytes lamina propria (LPL). Étant donné que ce protocole a été optimisé dans l'évaluation des modèles graves de colite de souris post-transplantation où les cytokines inflammatoires et les lésions tissulaires se prêtent à une faible viabilité de la MNC récupérée, nous prévoyons que ces méthodes peuvent être traduites à d'autres applications nécessitant une analyse phé...

Bien que le tractus gastro-intestinal (GI) soit principalement dédié au traitement et à la réabsorption des nutriments des aliments, le tractus gastro-intestinal maintient également des rôles centraux dans l'intégrité des systèmes vasculaires, lymphatiques et nerveux et de nombreux autres organes par son système immunitaire muqueux et submucosal1. Le système immunitaire gastro-intestinal et systémique a un rôle influent en raison de son exposition constante à des antigènes étrangers provenant d'aliments, de bactéries commensales ou d'agents pathogènes envahissants1,2. Ainsi, le système immunitaire GASTRO doit maintenir un équilibre délicat dans lequel il tolère les antigènes non pathogènes tout en répondant de manière appropriée aux antigènes pathogènes1,2. Lorsque l'équilibre de la tolérance et de la défense est perturbé, la dysrégulation immunitaire localisée ou systémique et l'inflammation peuvent se produire résultant en une myriade de maladies1,2,3.
L'intestin abrite au moins 70% de toutes les cellules lymphoïdes dans le corps4. La plupart des interactions immunologiques primaires impliquent au moins une des trois stations immunitaires dans l'intestin : 1) Patchs de Peyer, 2) lymphocytes intraépithélial (IEL) et 3) lymphocytes lamina propria (LPL). Chacun d'eux est composé d'un réseau complexe interconnecté de cellules immunitaires qui répondent rapidement aux défis immunitaires normaux dans l'intestin5. Limité au stroma au-dessus de la muqueuse musculaire, la propria lamina vaguement structurée est le tissu conjonctif de la muqueuse intestinale et comprend l'échafaudage pour le villus, la vascularisation, le drainage lymphatique, et le système nerveux muqueux, ainsi que de nombreux innés et les sous-ensembles immunitaires adaptatifs6,7,8,9. LPL sont composés de CD4et CD8- lymphocytes T dans un rapport approximatif de 2:1, les cellules plasmatiques et les cellules de lignée myéloïde, y compris, les cellules dendritiques, les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages6.
Il y a un intérêt croissant dans la compréhension de la dysrégulation immunisée et de l'inflammation de l'intestin en ce qui concerne divers états de la maladie. Des conditions telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse se manifestent toutes de différents niveaux d'inflammation du côlon10,11,12. En outre, les patients présentant des troubles malins ou non malins de la moelle ou du système immunitaire qui subissent une transplantation allogénique de moelle (allo-BMT) peuvent développer diverses formes de colite comprenant 1) toxicité directe des régimes de conditionnement avant BMT, 2) infections provoquées par immunosuppression après BMT et 3 la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) conduite par les cellules T de distributeur-type réagissant aux allo-antigènes de distributeur dans les tissus après BMT13,14,15. Toutes ces complications post-BMT entraînent des altérations significatives dans le milieu immunitaire des intestins16,17,18. La méthode proposée permet une évaluation fiable de l'accumulation des cellules immunitaires dans le côlon de la souris et, lorsqu'elle est appliquée aux receveurs de murine après bMT, facilite un test efficace des cellules immunitaires des donneurs et des receveurs impliqués dans la tolérance à la greffe19 ,20. D'autres causes de l'inflammation intestinale incluent des malignités, des allergies alimentaires, ou une perturbation du microbiome intestinal. Ce protocole permet l'accès des cellules mononucléaires intestinales du côlon et, avec des modifications, aux leucocytes de l'intestin grêle dans l'un de ces modèles précliniques de murine.
Une recherche PubMed utilisant les termes de recherche "intestin ET cellule immunitaire ET isolement" révèle plus de 200 publications décrivant les méthodes de digestion de l'intestin grêle pour extraire les cellules immunitaires. Cependant, une recherche semblable de littérature pour le côlon ne donne aucun protocole bien délimité spécifiant l'isolement des cellules immunitaires du côlon. C'est peut-être parce que le côlon a plus de couches musculaires et interstitielles, ce qui le rend plus difficile à digérer complètement que l'intestin grêle. Contrairement aux protocoles existants, ce protocole utilise spécifiquement la collagène E de Clostridium histolyticum sans autres collagènes bactériens (Collagenase D/ Collagenase I). Nous démontrons que, utilisant ce protocole, la digestion du tissu colonique peut être réalisée tout en préservant la qualité des cellules immunitaires mononucléaires d'intestin d'isolement (MNC) sans l'addition des réactifs anti-clumping tels que le versenate de sodium (EDTA), Dispase II, et deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. Ce protocole est optimisé pour permettre l'extraction robuste reproductible de MNC viable du côlon murine pour d'autres études dirigées et devrait se prêter à l'étude de l'immunologie du côlon ou (avec des modifications) l'intestin grêle24, 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

L'intestin est la maison au plus grand nombre de cellules immunitaires dans le corps. Les petits et grands systèmes immunitaires intestinaux police l'exposition aux antigènes exogènes et modulent les réponses à de puissants stimuli immunitaires microbiens dérivés. Pour cette raison, l'intestin est un site cible principal de la dysrégulation immunitaire et de l'inflammation dans beaucoup de maladies comprenant mais, non limité aux maladies inflammatoires d'entrailles telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) après os greffe de moelle (BMT), et de nombreuses conditions allergiques et infectieuses. Les modèles murines de l'inflammation gastro-intestinale et de la colite sont fortement employés pour étudier des complications de GI et pour optimiser précliniquement des stratégies pour la prévention et le traitement. Les données glanées à partir de ces modèles par l'intermédiaire de l'isolement et de l'analyse phénotypique des cellules immunitaires de l'intestin sont essentielles à une compréhension immunitaire plus poussée qui peut être appliquée pour améliorer les troubles gastro-intestinaux et inflammatoires systémiques. Ce rapport décrit un protocole très efficace pour l'isolement des cellules mononucléaires (MNC) du côlon utilisant une interface mélangée de gradient de densité de silice-basée. Cette méthode isole reproductiblement un nombre significatif de leucocytes viables tout en minimisant les débris contaminants, permettant le phénotypage immunitaire ultérieur par cytométrie d'écoulement ou d'autres méthodes.

En travaillant avec des modèles de maladie du côlon maurine, il est utile d'être en mesure de quantifier et d'évaluer qualitativement, parmi le MNC du côlon, plusieurs sous-ensembles de cellules immunitaires impliqués dans le processus inflammatoire. La suspension unicellulaire de MNC obtenue par l'application de ce protocole facilite une telle caractérisation phénotypique d'une manière robuste et reproductible. Comme preuve de principe pour l'application de cette méthode d'isol...

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Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Le but de ce protocole est d'isoler les cellules mononucléaires qui résident dans la lamina propria du côlon par digestion enzymatique du tissu à l'aide de collagène. Ce protocole permet l'isolement efficace des cellules mononucléaires résultant en une suspension de cellules simples qui à son tour peut être utilisé pour l'immunophénotypage robuste.

Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

L’isolement dans l’analyse phénotypique des cellules immunitaires de l’intestin utilisant ce protocole se sont avérés applicables à la compréhension de GI et des désordres inflammatoires systémiques. Cette méthode isole un nombre important de cellules mononucléaires viables en minimisant la contamination des débris permettant un phénotypage immunitaire ultérieur par l’atomistrie de Fleur ou d’autres méthodes. Comme l’intestin est un site cible majeur de l’inflammation dans de nombreuses maladies, ce protocole peut être utile pour l’étude des populations immunitaires intestinales dans les modèles muraux de cancer, allergie, transplantation et auto-immunité.Afin d’optimiser le rendement et l’efficacité de ce protocole, il est recommandé que les solutions et les matériaux clés soient préparés à l’avance, comme indiqué. Après avoir euthanasié la souris et fait une incision verticale en milieu de ligne, utilisez de fines ciseaux de dissection pour ouvrir le péritoine. À l’aide de forceps, déplacez les petites entrailles d’un côté et exposez le côlon descendant.Tirez vers le haut légèrement sur le côlon descendant pour exposer au maximum la partie rectale du côlon. Ensuite, couper le rectum distal profondément dans le bassin et disséquer l’ensemble du côlon comme une seule unité du rectum distal au capuchon cécal. Tout d’abord, placez le côlon sur une serviette en papier humidifié et utilisez l’extrémité émoussée d’une paire de ciseaux ou de forceps pour appliquer une légère pression sur la paroi intestinale et extraire les selles solides.Ensuite, placez le côlon dans une boîte de Pétri et utilisez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille émoussée de 18 jauges remplie pour rincer l’intestin avec 10 millilitres de tampon refroidi du côlon. Placer le côlon dans une boîte de Pétri remplie de 5-10 millilitres de tampon du côlon réfrigéré et agiter manuellement pour laver le contenu du côlon restant. Répétez ce lavage 2-3 fois, à l’aide d’une nouvelle boîte de Pétri contenant tampon frais pour chaque lavage.Après cela, transférer le côlon dans une nouvelle boîte de Pétri contenant tampon frais du côlon réfrigéré. Couper le côlon longitudinalment de son extrémité rectale plus musclée au côlon proximal, pour générer un seul morceau rectangulaire du côlon ouvert. Jeter le terre-plein central dans le plat et le remplacer par un tampon propre du côlon réfrigéré.Placez le tissu rectangulaire du côlon sur une serviette en papier humidifié avec un tampon du côlon et coupez-le en le coupant horizontalement, puis en petits fragments. Utilisez des forceps fins pour recueillir les fragments du côlon dans un tube conique polypropylène de 50 millilitres contenant 20 millilitres de tampon du côlon réfrigéré. Ensuite, lavez les fragments en tourbillonnant vigoureusement le tube pendant 30 secondes.Après le lavage, laisser les fragments de tissu s’installer au fond du tube avant de décanter ou aspirer sous vide le surnatant, En s’assurant d’éviter de perdre des fragments de tissu, répétez tout ce processus de lavage 3 fois en utilisant tampon du côlon frais pour chaque lavage. Pour commencer, ajouter 20 millilitres de tampon de digestion collagène au tube contenant les fragments de côlon lavés. Scellez le tube et placez-le dans un shaker orbital à 37 degrés Celsius avec un taux de rotation de 2 fois G pendant 60 minutes.Assurez-vous que les fragments de tissu sont en mouvement constant pendant l’agitation. Tout d’abord, versez 5 millilitres de 66% de la densité à base de silice à base de médias de séparation dans chacun des 3 tubes distincts de polypropylène de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette sérologique de 25 millilitres pour recueillir seulement le supernatant de Collagenase Digestion 1.Filtrer le supernatant à travers une passoire cellulaire en tissu de filtration pauvre de 40 microlitres placée dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres. Remplissez complètement le tube d’un tampon de côlon réfrigéré pour étancher le tampon de digestion de collagène. Faites ensuite tourner les cellules, aspirez le surnatant et gardez la pastille sur la glace.Continuez à effectuer Collagenase Digestion 2 tel que décrit dans le protocole de texte. Une fois la digestion de collagène 2 terminée, rincer vigoureusement les fragments de tissu entre le tube et une seringue de 10 millilitres à travers une aiguille à extrémité émoussée de calibre 18. Répétez cette chasse d’eau pendant au moins 7-8 passages, en continuant jusqu’à ce qu’aucun fragment de tissu brut ou debri ne soit visible.Ensuite, passez la suspension de désagrégation tissulaire à travers une passoire de cellules en tissu de filtration pauvre de 40 micromètres placée dans un tube propre en polypropylène de 50 millilitres. Remplissez le tube jusqu’à la jante avec un tampon du côlon réfrigéré pour étancher la digestion et la centrifugeuse à 800 fois G à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le supernatant par aspiration sous vide et tirez la pastille re-suspendue de Collagenase Digestion 1 à son tube correspondant.Après cela, suspendre à nouveau chaque granulé dans 24 millilitres de 44% de la densité à base de silice des médias de séparation par côlon. Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour superposer lentement 8 millilitres de ce média sur chacun des 3 tubes contenant des supports de séparation de densité à base de silice à 66 %. Équilibrez soigneusement les tubes dans des seaux de centrifugeuse à l’aide d’une balance ou d’un équilibre.Centrifugeuse à 859 fois G à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes sans la pause. Laissez les rongeurs s’immobiliser complètement avant d’enlever les tubes, en prenant soin de ne pas perturber les cellules à l’interface de gradient. Tout d’abord, visualisez l’interface de gradient près de la marque de 5 millilitres, où une bande blanche de 1 à 2 millilitres d’épaisseur est présente.Aspirez sous vide et jetez les 7 millilitres les plus hauts du gradient pour faciliter l’accès pipette à l’interface. À l’aide d’une aspiration manuelle continue et d’un mouvement régulier du poignet rotatif, recueillir la couche d’interface des cellules. Recueillir jusqu’à ce que l’interface entre les deux gradients soit claire et réfractile et transférer l’interface vers un nouveau tube conique en polypropylène de 50 millilitres.Ensuite, ajoutez FACS Buffer à cette baignoire jusqu’à ce que la suspension totale atteigne 50 millilitres. Centrifugeuse à 800 fois G à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ensuite, aspirez le supernatant par aspiration sous vide et suspendez la pastille en 1 millilitre de tampon FACS.La procédure décrite dans cette vidéo peut être utilisée pour isoler les cellules mononucléaires du côlon ou, avec des modifications, de l’intestin grêle. De plus, la cytométrie et l’analyse des données sont effectuées pour comparer les fractions des lymphocytes apoptotiques et nécrotiques/morts lors de l’utilisation de Collagène E ou D pour l’isolement, avec notre traitement sans DNAse 1. Après l’annexe 5 et la coloration bleue morte vivante fixable sur des suspensions de cellules simples après chaque isolement, la collagène E sans DNAse a montré un pourcentage sensiblement plus élevé de cellules vivantes après isolement par rapport à Collagène D sans DNAse.Même par rapport à l’un ou l’autre collagène avec DNAse. En outre, nous avons identifié des cellules nécrotiques à un pourcentage médian de 41,0% dans le groupe E de Collagène contre 90,0% dans le groupe de Collagène D. 75,9% dans le groupe Collagenase E DNAse et 80,3% dans le groupe Collagenase DNAse.La cytométrie multi perimétrique de flux est alors appliquée au MNC isolé des souris destinataires de valve-C cd45.2 le jour 7 après réception de BMT ou des modèles allogéniques ou syngénéiques de BMT. Les nombres absolus moyen de lymphocytes T positifs CD4 et CD8 positifs du donneur extraits du côlon du receveur de BMT sont calculés et comparés. Il peut donc être important d’identifier et/ou de quantifier les populations rares de cellules immunitaires dans ces modèles muraux.Des sous-ensembles rares, y compris les cellules de régulation T positives FOX-P3 dérivées du donneur, sont évalués dans les modèles syngénéiques et allogéniques de BMT. En utilisant cette méthode, même les sous-ensembles rares, tels que les donneurs dérivés de T colonique s’infiltrant colon de souris receveurs, après BMT, peuvent être analysés. Il convient de noter que la collagène E est active à 37 degrés Celsius.Ainsi, toutes les solutions de collagène doivent être préchauffées pour une activité adéquate de collagène et soigneusement trempées pour mettre fin à l’activité. Ce protocole permet un grand nombre de cellules mononucléaires qui peuvent être utilisées pour la caractérisation ultérieure par une cytométrie Fleur, techniques de biologie moléculaire, microscopie, culture et site de, entre autres. Ce protocole a fourni une évaluation fiable de l’inflammation dans le côlon des souris expérimentales contre contrôlées dans un modèle de greffe de moelle.Facilitant ainsi la découverte de nouveaux mécanismes immunitaires réglementaires de tolérance à la transplantation. Collagène de Clostridium Istoliticum est un reagent qui doit être manipulé avec des techniques de sécurité de laboratoire. Il pose un danger pour la santé lorsqu’il est inhalé et peut causer une irritation de la peau et des yeux.

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