Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien #1K08HL088260 und #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) und die Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) unterstützt. C57BL/6 und BALB/c Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden entweder in unserer Anlage gezüchtet oder von Jackson Labs oder Taconic bereitgestellt.

Alle Studien wurden im Rahmen von Nagetierforschungsprotokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Miami Miller School of Medicine überprüft und genehmigt wurden, das die veterinärmedizinischen Standards der American Association erfüllt. für Labortierwissenschaft (AALAS).
1. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>
Wie in Tabelle 1 beschrieben, bereiten Sie den Colon Buffer, Silica-Based Density Separation Media 100%, Silica-B...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. 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J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Dieses visuelle Protokoll beschreibt gut verträgliche Methoden zur Isolierung von mononukleären kolonischen Zellen einschließlich Lamina propria lymphozyten (LPL). Angesichts der Tatsache, dass dieses Protokoll bei der Bewertung schwerer Mauskolitismodelle nach der Transplantation optimiert wurde, bei denen entzündliche Zytokine und Gewebeverletzungen sich für eine schlechte Lebensfähigkeit von wiedergewonnenem MNC eignen, gehen wir davon aus, dass diese Methoden in andere Anwendungen, die eine phätotypische Analy...

Obwohl der Magen-Darm-Trakt (GI) in erster Linie der Verarbeitung und Resorption von Nährstoffen aus Der Nahrung gewidmet ist, behält der GI-Trakt auch zentrale Rollen in der Integrität des Gefäß-, Lymph- und Nervensystems und zahlreicher anderer Organe durch schleimhaut- und submukosalenImmunsystems 1. Das GI-Immunsystem hat eine einflussreiche Rolle sowohl in der gastrointestinalen als auch in der systemischen Gesundheit aufgrund seiner konstanten Exposition gegenüber fremden Antigenen aus Lebensmitteln, kommensalen Bakterien oder eindringenden Krankheitserregern1,2. So muss das GI-Immunsystem ein empfindliches Gleichgewicht aufrechterhalten, in dem es nicht pathogene Antigene toleriert und gleichzeitig angemessen auf pathogene Antigene1,2reagiert. Wenn das Gleichgewicht von Toleranz und Verteidigung gestört ist, können lokalisierte oder systemische Immundysregulation und Entzündungen auftreten, was zu einer Vielzahl von Krankheiten1,2,3führt.
Der Darm beherbergt mindestens 70% aller Lymphzellen im Körper4. Die meisten primären immunologischen Wechselwirkungen umfassen mindestens eine von drei Immunstationen im Darm: 1) Peyer es Patches, 2) Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) und 3) Lamina propria Lymphozyten (LPL). Jeder von ihnen besteht aus einem komplexen vernetzten Netzwerk von Immunzellen, die schnell auf normale Immunherausforderungen im Darm reagieren5. Beschränkt auf die Stroma über der Muskulatur, ist die lose strukturierte Lamina propria das Bindegewebe der Darmschleimhaut und umfasst Gerüste für den Villus, die Vaskulatur, Lymphdrainage und das Mukosalnervensystem sowie viele angeborene und adaptive Immun-Teilmengen6,7,8,9. LPL bestehen aus CD4+ und CD8+ T-Zellen in einem ungefähren Verhältnis von 2:1, Plasmazellen und myeloischen Abstammungszellen einschließlich, dendritischen Zellen, Mastzellen, Eosinophilen und Makrophagen6.
Es gibt ein wachsendes Interesse am Verständnis der Immundysregulation und Entzündung des Darms, wie es zu verschiedenen Krankheitszuständen betrifft. Solche Bedingungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa manifestieren alle unterschiedliche Konzentrationsniveaus der Darmentzündung10,11,12. Darüber hinaus können Patienten mit bösartigen oder nicht-bösartigen Erkrankungen des Markoder Immunsystems, die sich einer allogenen Knochenmarktransplantation (allo-BMT) unterziehen, verschiedene Formen der Kolitis entwickeln, einschließlich 1) direkte Toxizität durch Konditionierungsschemas vor BMT, 2) Infektionen, die durch Immunsuppression nach BMT und 3) Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) verursacht werden, die von Spender-Typ-T-Zellen angetrieben werden, die auf Spender-Allo-Antigene im Gewebe nach BMT13,14,15reagieren. Alle diese Post-BMT-Komplikationen führen zu signifikanten Veränderungen im Immunmilieu des Darms16,17,18. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung der Immunzellakkumulation im Mausdoppel und ermöglicht, wenn sie auf murine Empfänger nach BMT angewendet wird, einen effizienten Test sowohl der Spender- als auch der Empfängerimmunzellen, die an der Transplantationstoleranz beteiligt sind19 ,20. Weitere Ursachen für Darmentzündungen sind Bösartige Erkrankungen, Lebensmittelallergien oder Störungen des Darmmikrobioms. Dieses Protokoll ermöglicht den Zugang von Darm mononukleären Zellen aus dem Dickdarm und, mit Modifikationen, zu Leukozyten des Dünndarms in einem dieser präklinischen murine Modelle.
Eine PubMed-Suche mit dem Suchbegriff "Darm UND Immunzelle UND Isolation" zeigt über 200 Publikationen, die Methoden zur Dünndarmverdauung zur Extraktion von Immunzellen beschreiben. Eine ähnliche Literatursuche nach Dickdarm ergibt jedoch keine gut abgegrenzten Protokolle, die die Isolierung von Immunzellen vom Dickdarm angeben. Dies kann daran liegen, dass der Dickdarm mehr muskel- und interstitielle Schichten hat, was es schwieriger macht, vollständig zu verdauen als der Dünndarm. Im Gegensatz zu bestehenden Protokollen verwendet dieses Protokoll speziell Collagenase E von Clostridium histolyticum ohne andere bakterielle Kollagene (Collagenase D/ Collagenase I). Wir zeigen, dass mit diesem Protokoll die Verdauung des Kolongewebes unter Beibehaltung der Qualität isolierter mononukleärer Darmimmunzellen (MNC) ohne Zugabe von antiklumpenden Reagenzien wie Natriumversenat (EDTA), Dispase II und Desoxyribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Dieses Protokoll ist optimiert, um eine reproduzierbare robuste Extraktion von lebensfähigem MNC aus dem murinen Dickdarm für weitere gerichtete Studien zu ermöglichen und sollte sich für die Untersuchung der Immunologie des Dickdarms oder (mit Modifikationen) des Dünndarms24 , 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

Der Darm ist die Heimat der größten Anzahl von Immunzellen im Körper. Die kleinen und großen Darm-Immunsysteme Polizei Exposition gegenüber exogenen Antigenen und modulieren Reaktionen auf potente mikrobiell abgeleitete Immunreize. Aus diesem Grund ist der Darm ein wichtiger Zielort für Immundysregulation und Entzündungen bei vielen Krankheiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD) nach Knochen Knochenmarktransplantation (BMT) und viele allergische und infektiöse Erkrankungen. Murine Modelle von Magen-Darm-Entzündung und Kolitis werden stark verwendet, um GI-Komplikationen zu studieren und vorklinisch zu optimieren Strategien für Prävention und Behandlung. Daten, die aus diesen Modellen über Isolation und phänotypische Analyse von Immunzellen aus dem Darm gewonnen werden, sind entscheidend für ein weiteres Immunverständnis, das zur Linderung gastrointestinaler und systemischer entzündlicher Erkrankungen angewendet werden kann. Dieser Bericht beschreibt ein hochwirksames Protokoll zur Isolierung mononuklearer Zellen (MNC) aus dem Doppelpunkt unter Verwendung einer gemischten, auf Kieselsäure basierenden Dichtegradientenschnittstelle. Diese Methode isoliert reproduzierbar eine signifikante Anzahl lebensfähiger Leukozyten und minimiert dabei die Kontamination von Schmutz und ermöglicht eine nachträgliche Immun-Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie oder andere Methoden.

Bei der Arbeit mit murinen Darmerkrankungen Modellen ist es hilfreich, sowohl quantifizieren als auch qualitativ bewerten zu können, unter den MNC des Dickdarms, mehrere Immunzellen-Subsets, die am Entzündungsprozess beteiligt sind. Die durch die Anwendung dieses Protokolls erhaltene einzellige Suspension von MNC ermöglicht eine solche phänotypische Charakterisierung in robuster und reproduzierbarer Weise. Als Grundsatzbeweis für die Anwendung dieser Isolationsmethode unter verschied...

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Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Die Isolierung in der phänotypischen Analyse von Immunzellen aus dem Darm mit diesem Protokoll haben sich als anwendbar auf das Verständnis von GI und systemischen entzündlichen Störungen erwiesen. Diese Methode isoliert eine signifikante Anzahl lebensfähiger mononukleischer Zellen, indem sie kontaminierende Trümmer minimiert, die eine nachfolgende Immun-Phänotypisierung durch Fleurs Atomistry oder andere Methoden ermöglichen. Da der Darm ein wichtiger Zielort für Entzündungen bei vielen Krankheiten ist, kann dieses Protokoll für die Untersuchung von Darmimmunpopulationen in Mausmodellen von Krebs, Allergie, Transplantation und Autoimmunität nützlich sein.Um die Ausbeute und Effizienz dieses Protokolls zu optimieren, wird empfohlen, dass wichtige Lösungen und Materialien wie bereits erwähnt im Voraus vorbereitet werden. Nach dem Einschläfern der Maus und einem vertikalen Mittellinienschnitt verwenden Sie eine feine Sezierschere, um das Peritoneum zu öffnen. Bewegen Sie den kleinen Darm mit Zangen zur Seite und legen Sie den absteigenden Dickdarm aus.Ziehen Sie leicht nach oben auf dem absteigenden Doppelpunkt, um den rektalen Teil des Dickdarms maximal freizulegen. Schneiden Sie dann das distale Rektum tief im Becken und sezieren Sie den gesamten Dickdarm als eine Einheit vom distalen Rektum bis zur Cecal-Kappe. Legen Sie zunächst den Dickdarm auf ein befeuchtetes Papiertuch und verwenden Sie das stumpfe Ende einer Schere oder Zange, um leichten Druck auf die Darmwand auszuüben und den festen Stuhl zu extrahieren.Als nächstes legen Sie den Dickdarm in eine Petrischale und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Spur stumpf gefüllten Nadel, um den Darm mit 10 Millilitergekühlten Dickdarmpuffer zu spülen. Legen Sie den Doppelpunkt in eine Petrischale gefüllt mit 5-10 Milliliter gekühlten Dickdarmpuffer und agitieren manuell, um den restlichen Koloninhalt zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche 2-3 Mal, mit einer neuen Petrischale mit frischem Puffer für jede Wäsche.Danach den Dickdarm in eine neue Petrischale mit frisch gekühltem Dickdarmpuffer übertragen. Schneiden Sie den Dickdarm längs von seinem muskulöseren rektalen Ende zum proximalen Dickdarm, um ein einzelnes rechteckiges offenes Doppelpunktstück zu erzeugen. Entsorgen Sie den Median in der Schale und ersetzen Sie ihn durch einen sauberen gekühlten Dickdarmpuffer.Legen Sie das rechteckige Doppelgewebe auf ein Papiertuch, das mit Einem Dickdarmpuffer befeuchtet ist, und schneiden Sie es, indem Sie es horizontal und dann in kleine Fragmente schneiden. Verwenden Sie feine Zangen, um die Doppelpunktfragmente in einem 50 Milliliter Polypropylen konischen Rohr mit 20 Milliliter gekühlten Dickdarmpuffer zu sammeln. Dann waschen Sie die Fragmente, indem Sie das Rohr 30 Sekunden lang kräftig wirbeln.Nach dem Waschen, lassen Sie die Gewebefragmente auf den Boden des Rohres vor der Dekantierung oder Vakuum Aspirating des Überstandes, Achten Sie darauf, den Verlust von Gewebefragmenten zu vermeiden, wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang 3 Mal mit frischem Dickdarmpuffer für jede Wäsche. Zunächst fügen Sie 20 Milliliter Kollagenase-Verdauungspuffer in die Röhre mit den gewaschenen Doppelpunktfragmenten ein. Versiegeln Sie das Rohr und legen Sie es in einem Orbital-Shaker bei 37 Grad Celsius mit einer Rotationsrate von 2 mal G für 60 Minuten.Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während der Agitation in ständiger Bewegung sind. Gießen Sie zunächst 5 Milliliter 66%Silica-basierte Dichtetrennmedien in jedes von 3 separaten 15 Milliliter Polypropylen-Röhren. Als nächstes verwenden Sie eine 25 Milliliter serologische Pipette, um nur den Überstand aus Collagenase Digestion 1 zu sammeln.Filtern Sie den Überstand durch ein 40 Mikroliter armes Filtrationsgewebezellensieb, das in ein sauberes 50 Milliliter Polypropylen-Konusrohr gelegt wird. Füllen Sie das Rohr vollständig mit gekühlten Dickdarmpuffer, um den Kollagenase-Verdauungspuffer zu löschen. Dann drehen Sie die Zellen, aspirieren Sie den Überstand, und halten Sie das Pellet auf Eis.Führen Sie die Collagenase Digestion 2 wie im Textprotokoll beschrieben weiter. Nachdem Collagenase Digestion 2 abgeschlossen ist, spülen Sie die Gewebefragmente kräftig zwischen dem Rohr und einer 10 Milliliter Spritze durch eine 18-Spur stumpfe Endnadel. Wiederholen Sie diese Spülung für mindestens 7-8 Passagen, so lange, bis keine groben Gewebefragmente oder Debri sichtbar sind.Als nächstes passieren Sie die Gewebedisaggregationsuspension durch ein 40 Mikrometer armes Filtrationsgewebe Zellsieb, das in ein sauberes 50-Milliliter-Polypropylenrohr gelegt wird. Füllen Sie das Rohr bis zum Rand mit gekühlten Dickdarmpuffer, um die Verdauung und Zentrifuge bei 800 mal G in bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten zu löschen. Entsorgen Sie den Überstand über Vakuumaspiration und ziehen Sie das aufgehängte Pellet von Collagenase Digestion 1 in das entsprechende Rohr.Danach setzen Sie jedes Pellet in 24 Milliliter n.G. 44% Auf Kieselsäure basierende Dichtetrennungsmedien pro Dickdarm wieder aus. Verwenden Sie eine 10 Milliliter serologische Pipette, um langsam 8 Milliliter dieses Mediums auf jedes der 3 Röhren zu schichten, die 66% Silica-basierte Dichtetrennmedien enthalten. Balancieren Sie die Rohre in Zentrifugenschaufeln sorgfältig mit einer Waage oder einem Gleichgewicht.Zentrifuge bei 859 mal G in bei 20 Grad Celsius für 20 Minuten ohne Pause. Lassen Sie die Roder s, um ruhe zu kommen, bevor Sie Rohre entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen an der Gradientenschnittstelle nicht gestört werden. Visualisieren Sie zunächst die Gradientenschnittstelle in der Nähe der 5-Milliliter-Marke, wo in der Regel ein 1-2 Milliliter dickes weißes Band vorhanden ist.Vakuum-Aspirat und entsorgen Sie die oberen 7 Milliliter des Farbverlaufs, um einen einfacheren Pipettenzugriff auf die Schnittstelle zu ermöglichen. Mit kontinuierlicher manueller Absaugung und stetig rotierender Handgelenkbewegung, sammeln Sie die Schnittstellenschicht der Zellen. Sammeln, bis die Schnittstelle zwischen den beiden Gradienten klar und reraktil ist und übertragen Sie die Schnittstelle auf ein neues 50 Milliliter Polypropylen konisches Rohr.Als Nächstes fügen Sie FACS Buffer zu dieser Wanne hinzu, bis die Gesamtsuspension 50 Milliliter erreicht. Zentrifuge bei 800 mal G in bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Dann aspirieren Sie den Überstand über Vakuumaspiration und setzen Sie das Pellet in 1 Milliliter FACS Buffer wieder auf.Das in diesem Video beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um mononukleäre Zellen aus dem Dickdarm oder, mit Modifikationen, aus dem Dünndarm zu isolieren. Darüber hinaus wird Zytometrie und Datenanalyse durchgeführt, um die Fraktionen von apoptotischen und nekrotischen/toten Lymphozyten zu vergleichen, wenn entweder Collagenase E oder D für die Isolierung verwendet wird, mit unserer Behandlung ohne DNAse 1. Nach Annexin 5 und fixierbarer lebender blauer Farbstofffärbung auf einzelzelligen Suspensionen nach jeder Isolierung zeigte Collagenase E ohne DNAse einen signifikant höheren Anteil an lebenden Zellen nach Isolation im Vergleich zu Collagenase D ohne DNAse.Auch im Vergleich zu einer Kollagenase mit DNAse. Darüber hinaus identifizierten wir nekrotische Zellen mit einem medianen Prozentsatz von 41,0% in der Gruppe Collagenase E gegenüber 90,0% in der Gruppe Collagenase D. 75,9% in der Gruppe Collagenase E DNAse und 80,3% in der Gruppe Collagenase D DNAse.Die multiperimetrische Durchflusszytometrie wird dann am 7. Tag nach Erhalt von BMT- oder allogenen oder syngenischen BMT-Modellen auf MNC angewendet, die von CD45.2-Ventil-C-Empfängermäusen isoliert wurden. Die durchschnittliche absolute Anzahl der Spender-CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen, die aus dem Doppelpunkt des BMT-Empfängers extrahiert wurden, werden berechnet und verglichen. So kann es wichtig sein, seltene Immunzellpopulationen in solchen Mausmodellen zu identifizieren und/oder zu quantitieren.Seltene Teilmengen, einschließlich von Spendern abgeleiteter FOX-P3-positiver T-Regulierungszellen, werden sowohl in syngenem als auch in allogenen BMT-Modellen bewertet. Mit dieser Methode können selbst seltene Teilmengen, wie z. B. spenderabgeleitete Darm-T-Regulierungs-Infiltrierende Empfängermaus-Doppelpunkte nach BMT, analysiert werden. Es sollte beachtet werden, dass Collagenase E bei 37 Grad Celsius aktiv ist.Daher sollten alle Kollagenase-Lösungen für eine angemessene Kollagenase-Aktivität vorgewärmt und gründlich abgeschreckt werden, um die Aktivität zu beenden. Dieses Protokoll ermöglicht eine große Anzahl von mononukleären Zellen, die für die nachfolgende Charakterisierung durch eine Fleur-Zytometrie, molekularbiologische Techniken, Mikroskopie, Kultur und Ort von unter anderem verwendet werden können. Dieses Protokoll lieferte eine zuverlässige Beurteilung der Entzündung im Dickdarm von experimentellen versus kontrollierten Mäusen in einem Knochenmarktransplantationsmodell.So erleichtert die Entdeckung neuer regulatorischer Immunmechanismen der Transplantationstoleranz. Kollagenase von Clostridium Istoliticum ist ein Reagenz, das mit Laborsicherheitstechniken behandelt werden sollte. Es stellt eine Gesundheitsgefährdung beim Einatmen dar und kann Haut- und Augenreizungen verursachen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolation, Verarbeitung und Analyse von Murine Gingivazellen

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolierung von Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Ratte Hoden

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...