Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים #1K08HL088260 ו #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., ח, S.J.), ואת הקרן Batchelor למחקר ילדים (D.M., ח, S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 ו-BALB/c עכברים המשמשים במחקר זה היו מונולדו במתקן שלנו או שסופקו על ידי מעבדות ג'קסון או Taconic.

כל המחקרים נערכו תחת פרוטוקולי מחקר מכרסמים שנסקרו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי מילר בית הספר לרפואה, אשר עונה על הסטנדרטים הוטרינרים שנקבעו על ידי האגודה האמריקנית עבור מדע בעלי חיים במעבדה (AALAS).
1. הכנת פתרונות
<ol><li>
כפי שמתו?...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

פרוטוקול חזותי זה מתאר שיטות נסבל היטב עבור בידוד של תאים מוננועיים במעי הגס כולל לימפוציטים קיננה (LPL). בהינתן כי פרוטוקול זה היה אופטימיזציה בהערכת חמור לאחר השתלת מודלים העכבר כאשר ציטוקינים דלקתיים ופציעה רקמות להשאיל את עצמם הכדאיות הירודה של MNC התאושש, אנו מצפים כי שיטות אלה ניתן לתר?...

למרות מערכת העיכול (GI) במערכת מוקדש בעיקר עיבוד וספיגה חוזרת של חומרים מזינים מזון, במערכת GI גם שומר על תפקידים מרכזיים ביושרה של כלי הדם, הלימפה, והעצבים של איברים רבים אחרים באמצעות המערכת החיסונית שלה submucosal1. מערכת החיסון GI יש תפקיד רב השפעה הן בריאות המערכת העיכול ומערכתית בשל החשיפה המתמדת שלו אנטיגנים זרים ממזון, בקטריה של הקומנדנט, או פולשים פתוגנים1,2. לכן, מערכת החיסון GI חייב לשמור על איזון עדין שבו היא סובלנית אנטיגנים שאינם פתוגניים תוך התגובה בהתאם אנטיגנים פתוגניים1,2. כאשר האיזון של סובלנות והגנה מופרת, מקומי או מערכתית החיסונית חוסר תקנה ודלקת יכול להתרחש כתוצאה מספר עצום של מחלות1,2,3.
המעי נמלים לפחות 70% של כל תאי הלימפה בגוף4. האינטראקציות הראשוניות ביותר במערכת החיסונית כרוכות לפחות באחת משלוש תחנות החיסון במעי: 1. כתמים של Peyer, 2) לימפוציטים האפיתל (אל-על) ו-3) לימפוציטים באופן מרכזי (LPL). כל אלה מורכב רשת מורכבת מחוברים של תאים חיסוניים המגיבים במהירות לאתגרים החיסונית נורמלי בבטן5. מוגבל לסטרומה מעל המוסקולריס mucosae, מובנה לאמינה מובנית היא רקמת החיבור של רירית הבטן וכולל פיגומים על הוויאוס, הוזוקולטורה, ניקוז הלימפה, מערכת העצבים mucosae, כמו גם מולדים רבים ומערכת המשנה החיסונית. האדפטיבית6,7,8,9 LPL הם מורכבים CD4+ ו CD8+ T תאים ביחס משוער של 2:1, תאים פלזמה ותאים השושלת המייאלואידית כולל, תאים דנדריטים, התורן תאים, אאוזיפרפילים ו מקרופאגים6.
יש עניין הולך וגובר בהבנת הדיסתקנה החיסונית ודלקת הבטן כפי שהיא מתייחסת למצבי מחלה שונים. תנאים כגון מחלת קרוהן ו קוליטיס כיבית כל מניפסט רמות שונות של דלקת במעי הגס10,11,12. בנוסף, חולים עם הפרעות ממאירות או שאינן ממאירות של מח או מערכת החיסון אשר עוברים השתלת מח עצם allogeneic (allo-BMT) יכול לפתח צורות שונות של קוליטיס כולל 1) רעילות ישירה מתוך התניה משטרי לפני bmt, 2) זיהומים נגרמת על ידי דיכוי חיסוני לאחר bmt ו 3) השתל-מול-מארח מחלה (gvhd) מונע על ידי מסוג התורם תאים T מגיב התורם allo-אנטיגנים ברקמות לאחר bmt13,14,15. כל אלה post-bmt סיבוכים לגרום שינויים משמעותיים בסביבה החיסונית של המעיים16,17,18. השיטה המוצעת מאפשרת הערכה מהימנה של הצטברות תאים חיסוניים במעי הגס של העכבר, כאשר מוחל על הנמענים murine לאחר BMT, מקלה על היכולת היעילה של שני התאים החיסוניים של התורם והנמען המעורבים סובלנות השתלה19 ,20. גורמים נוספים לדלקות בטן כוללים ממאירות, אלרגיה למזון, או שיבוש מיקרובידום המעיים. פרוטוקול זה מאפשר גישה של תאים מונוליניים המעיים מן המעי הגס, עם שינויים, לוקיציטים של המעי הדק בכל אחד מדגמי murine אלה טרום קלינית.
חיפוש בתוך באמצעות מונחי החיפוש "המעי והתא החיסונית ובידוד" חושף מעל 200 פרסומים המתארים שיטות עיכול קטן כדי לחלץ תאים חיסוניים. עם זאת, החיפוש ספרות דומה לתשואות המעי הגס לא היטב פרוטוקולים המציין בידוד של תאים חיסוניים מן המעי הגס. זה יכול להיות בגלל המעי הגס יש יותר שרירי וביניים בשכבות, עיבוד זה קשה יותר לעכל לחלוטין מאשר המעי הדק. בניגוד לפרוטוקולים קיימים, פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי בקולאגנאז E מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום ללא הקולגן האחרים בקטריות (קולאגנאז D/קולאגנאז I). אנו מדגימים כי, באמצעות פרוטוקול זה, העיכול של רקמת המעי הגס ניתן להשיג תוך שמירה על איכות הבטן מבודדים תאים חיסוניים ברורים (MNC) ללא תוספת של ריאגנטים נגד החלקה כגון נתרן versenate (EDTA), Dispase השני, ו ביטול הכרה i (dnase)21,22,23. פרוטוקול זה הוא ממוטב כדי לאפשר הפקת חזקה מיותרת של MNC קיימא מן הנקודתיים murine עבור מחקרים מכוונים נוספים צריך להשאיל את עצמו למחקר של אימונולוגיה של המעי הגס או (עם שינויים) את המעי הדק24, . עשרים וחמש

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

המעי הוא הבית למספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים בגוף. המעי קטן וגדול מערכת חיסונית המשטרה חשיפה לאנטיגנים אקסוגני ולווסת את התגובות החזק מיקרוביואלי החיסון הנגזרות. מסיבה זו, המעי הוא אתר היעד העיקרי של חוסר תקנה חיסונית ודלקת במחלות רבות, כולל אבל, לא מוגבל למחלות מעיים דלקתיות כגון מחלת קרוהן כיבית קוליטיס, השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) לאחר העצם השתלת מח עצם (BMT), ומצבים אלרגיים וזיהומיות רבים. מודלים murine של דלקת במערכת העיכול ו קוליטיס משמשים בכבדות כדי לחקור סיבוכים GI ו-קלינית מיטוב אסטרטגיות למניעה וטיפול. נתונים שנאסף מן המודלים האלה באמצעות בידוד וניתוח פנוטימית של תאים חיסוניים מן המעי הוא קריטי כדי הבנה חיסונית נוספת שניתן להחיל על מערכת העיכול שפר הפרעות דלקתיות מערכתית. דו ח זה מתאר פרוטוקול אפקטיבי ביותר לבידוד של תאים מוננועיים (MNC) מהמעי הגס באמצעות ממשק מעבר הדרגתי מעורב בדחיסות מבוססת סיליקה. שיטה זו בונה מבודד מספר משמעותי של לוקיציטים קיימא תוך מזעור פסולת מזהם, ומאפשר פנוטיפים החיסונית הבאים על ידי הזרימה cy, try או שיטות אחרות.

כאשר עובדים עם מחלת המעי הגס מודל מודלים, זה מועיל להיות מסוגל להעריך הן לכמת באיכות איכותית, בין MNC של המעי הגס, מספר קבוצות מערכות החיסון מעורב בתהליך דלקתי. השעיית תא יחיד של MNC שהושג באמצעות היישום של פרוטוקול זה מאפשר אפיון פנוסטילי כזה בצורה איתנה וללא שימוש. כהוכחה ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

בידוד בניתוח פנוטיפי של תאים חיסוניים מהמעי באמצעות פרוטוקול זה הוכיחו את עצמם ישימים להבנת GI והפרעות דלקתיות מערכתיות. שיטה זו מבודדת מספר משמעותי של תאים חד-גרעיניים בני קיימא על ידי מזעור פסולת מזהמת המאפשרת פנוטיפים חיסוניים עוקבים על ידי האטומיסטריה של פלר או שיטות אחרות. כמו המעי הוא אתר היעד העיקרי של דלקת במחלות רבות, פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לחקר אוכלוסיות החיסון במעיים במודלים העכבר של סרטן, אלרגיה, השתלה, אוטואימוניות.כדי לייעל את התשואה והיעילות של פרוטוקול זה, מומלץ להכין מראש פתרונות וחומרים מרכזיים. לאחר המתת לחץ הפוך את העכבר עושה חתך קו האמצע אנכי, להשתמש מספריים ניתוח עדין כדי לפתוח את peritoneum. באמצעות מדפים, להעביר את המעי הדק לצד אחד ולחשוף את המעי הגס היורד.משוך כלפי מעלה מעט על המעי הגס היורד כדי לחשוף באופן מקסימלי את החלק רקטלי של המעי הגס. לאחר מכן, חותכים את פי הטבעת הדיסטלי עמוק באגן וחותכים את המעי הגס כולו כיחידה אחת מהפי הטבעת הדיסטלית לכסה ה- cecal. ראשית, מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחה ולהשתמש בקצה הקהה של זוג מספריים או מטחנים כדי להחיל לחץ קל על דופן המעי ולחלץ את הצואה מוצק.לאחר מכן, מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18-מד קהה מלא כדי לשטוף את המעיים עם 10 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן להתסיס באופן ידני כדי לשטוף את התוכן המעי הגס הנותר. חזור על שטיפה זו 2-3 פעמים, באמצעות צלחת פטרי חדשה המכילה חיץ טרי לכל שטיפה.לאחר מכן, מעבירים את המעי הגס לצלחת פטרי חדשה המכילה חיץ מעי גס צונן טרי. חותכים את המעי הגס אורך מקצה רקטלי שרירי יותר שלה המעי הגס proximal, כדי ליצור חתיכת המעי הגס פתוח מלבני יחיד. משליכים את החציון בצלחת ומחליפים אותו במאגר המעי הגס הצונן והנקי.מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר כי הוא לח עם חיץ המעי הגס לחתוך אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לתוך שברים קטנים. השתמש ממטרות בסדר כדי לאסוף את שברי המעי הגס לתוך צינור חרוט פוליפרופילן 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן. לאחר מכן, לשטוף את השברים על ידי מערבולת נמרצת את הצינור במשך 30 שניות.לאחר הכביסה, תן שברי הרקמה להתיישב לתחתית הצינור לפני decanting או ואקום שאפת supernatant, הקפד להימנע לאבד שברי רקמות, לחזור על כל תהליך לשטוף את כל זה 3 פעמים באמצעות חיץ המעי הגס טרי עבור כל לשטוף. כדי להתחיל, להוסיף 20 מיליליטר של מאגר עיכול קולגן לצינור המכיל את שברי המעי הגס שטף. לאטום את הצינור ולמקום אותו שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס עם קצב סיבוב של 2 פעמים G במשך 60 דקות.ודא שברי הרקמה נמצאים בתנועה מתמדת במהלך תסיסה. ראשית, יוצקים 5 מיליליטר של מדיה הפרדה מבוססת סיליקה 66% לכל אחד מ-3 צינורות פוליפרופילן נפרדים של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית 25 מיליליטר כדי לאסוף רק את supernatant מ קולאגנס Digestion 1.סנן את העל-טבעי דרך מסננת תאי בד סינון ירודה של 40 מיקרוליטר שהונחה בתוך צינור חרוט פוליפרופילן נקי של 50 מיליליטר. ממלאים את הצינור לחלוטין עם חיץ המעי הגס צונן כדי להתרווה את חיץ העיכול קולגן. ואז לסובב את התאים, שאף את העל-טבעי, ושמור את גלולת הקרח על הקרח.המשך לבצע עיכול קולגנס 2 כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר עיכול קולגנס 2 הושלמה, לשטוף את שברי הרקמה במרץ קדימה ואחורה בין הצינור מזרק 10 מיליליטר דרך מחט קצה קהה 18-מד. חזור על סומק זה לפחות 7-8 מעברים, ממשיך עד שברי רקמה ברוטו או debri גלויים.לאחר מכן, להעביר את ההשעיה פירוק רקמות דרך 40 מיקרומטר סינון לקוי בד תא מסננת להציב לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מיליליטר. ממלאים את הצינור לשפה עם חיץ המעי הגס מצונן כדי להתרווה על העיכול והצנטריפוגה ב 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. להשליך את supernatant באמצעות שאיפה ואקום ולמשוך את גלולה מושעה מחדש מ Collagenase Digestion 1 לצינור המתאים שלה.לאחר מכן, להשעות כל גלולה ב 24 מיליליטר של 44%סיליקה מבוסס צפיפות הפרדה מדיה לכל המעי הגס. השתמשו בפיפסה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לשכב באיטיות 8 מיליליטר של מדיה זו על כל אחד מ-3 הצינורות המכילים מדיית הפרדה מבוססת סיליקה של 66%. בזהירות לאזן את הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות סולם משקל או איזון.צנטריפוגה ב 859 פעמים G ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ללא הפסקה. אפשר למוטות לבוא לנוח לפני הסרת צינורות, דואג לא לשבש את התאים בממשק הדרגתי. תחילה, דמיין את ממשק המילוי ההדרגתי ליד סימן 5 מיליליטר, שבו בדרך כלל קיימת רצועה לבנה בעובי 1-2 מיליליטר.ואקום שאף והשליך את 7 המיליליטרים העליונים של המילוי ההדרגתי כדי לאפשר גישה קלה יותר של פיפטה לממשק. באמצעות יניקה ידנית רציפה ותנופת פרק כף יד מסתובבת יציבה, לאסוף את שכבת הממשק של תאים. לאסוף עד הממשק בין שני מעברי צבע ברור שביר ולהעביר את הממשק חדש 50 מיליליטר פוליפרופילן צינור חרוט.לאחר מכן, הוסף חיץ FACS לאמבטיה זו עד ההשעיה הכוללת מגיעה 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי באמצעות שאיפת ואקום והשהה מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ FACS.ההליך המתואר בסרטון זה יכול לשמש לבידוד תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס או, עם שינויים, מהמעי הדק. בנוסף, ניתוח ציטומטריה ונתונים מבוצע כדי להשוות את שברי לימפוציטים אפופוטוטיים ונמקים / מתים בעת שימוש או קולגנס E או D לבידוד, עם שלנו ללא טיפול DNAse 1. בעקבות Annexin 5 וכתמי צבע כחול מתים לתיקון על מתלים תא יחיד בעקבות כל בידוד, קולגנס E ללא DNAse הראה אחוז גבוה משמעותית של תאים חיים לאחר בידוד בהשוואה קולגנס D ללא DNAse.גם בהשוואה לקולגנס עם DNAse. בנוסף, זיהינו תאים נמקיים באחוז חציוני של 41.0% בקבוצת קולגנס E לעומת 90.0% בקבוצת קולגנס D. 75.9% בקבוצת קולגנס E DNAse ו-80.3% בקבוצת קולגנס D DNAse.ציטומטריית זרימה רב-פרימטרית מוחלת לאחר מכן על MNC המבודד מעכברי נמען CD45.2 Valve-C ביום 7 לאחר קבלת BMT או דגמי BMT אלוגניים או סינגניים. המספרים המוחלטים הממוצעים של תאי T חיוביים ו- CD8 חיוביים של תורם CD8 שחולצו מנקודתיים של נמען BMT מחושבים ומוושוים. אז זה יכול להיות חשוב לזהות ו / או לכמת אוכלוסיות נדירות של תאי החיסון במודלים עכבר כזה.ערכות משנה נדירות, כולל תאים רגולטוריים T חיוביים FOX-P3 נגזרים תורמים מוערכים הן במודלים סינגניים והן במודלים של BMT אלוגניים ואלוגניים. באמצעות שיטה זו, ניתן לנתח אפילו קבוצות משנה נדירות, כגון רגולציית T המעי הגס הנגזרת על-ידי התורם, לאחר BMT. יש לציין כי קולגנס E פעיל ב 37 מעלות צלזיוס.אז כל פתרונות קולגנס צריך להיות מחומם מראש לפעילות קולגן נאותה ומרווה ביסודיות כדי לסיים את הפעילות. פרוטוקול זה מאפשר מספר רב של תאים חד-גרעיניים שניתן להשתמש בהם לאפיון עוקב על ידי ציטומטריית פלר, טכניקות ביולוגיה מולקולרית, מיקרוסקופיה, תרבות ואתר של, בין היתר. פרוטוקול זה סיפק הערכה מהימנה של דלקת במעי הגס של עכברים ניסיוניים לעומת מבוקרים במודל השתלת מח עצם.ובכך להקל על גילוי מנגנונים חיסוניים רגולטוריים חדשניים של סובלנות להשתלה. קולגנס מ Clostridium Istoliticum הוא רהוט כי יש לטפל עם טכניקות בטיחות במעבדה. זה מהווה סכנה בריאותית כאשר בשאיפה עלול לגרום לגירוי בעור ובעין.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

תאי בידוד של תאי Sertoli ו Peritubular מן חולדת האשכים

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...