Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), e dalla Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). I topi C57BL/6 e BALB/c utilizzati in questo studio sono stati allevati nella nostra struttura o forniti da Jackson Labs o Taconic.

Tutti gli studi sono stati condotti nell'ambito di protocolli di ricerca sui roditori esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Miami Miller School of Medicine, che soddisfa gli standard veterinari stabiliti dall'American Association per laboratorio di scienza animale (AALAS).
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>
Come descritto nella Tabella 1, preparare il buffer del colon, il supporto di separazione della densità basata ...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. 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(132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Questo protocollo visivo descrive metodi ben tollerati per l'isolamento delle cellule mononucleari coloniche, tra cui i linfociti propria di lamina (LPL). Dato che questo protocollo è stato ottimizzato nella valutazione di modelli di colite murina pre-trapianto in cui le citochine infiammatorie e le lesioni tissutali si prestano alla scarsa redditività della MNC recuperata, prevediamo che questi metodi possono essere tradotti in altri applicazioni che richiedono l'analisi fenotipica del MNC colonico. Questi includono, ...

Sebbene il tratto gastrointestinale (GI) sia principalmente dedicato alla lavorazione e al riassorbimento dei nutrienti dagli alimenti, il tratto GI mantiene anche un ruolo centrale nell'integrità del sistema vascolare, linfatico e nervoso e di numerosi altri organi attraverso il suo sistema immunitario mucosale e submucosale1. Il sistema immunitario GI ha un ruolo influente nella salute gastrointestinale e sistemica a causa della sua costante esposizione a antigeni estranei da alimenti, batteri commensici o agenti patogeni invasori1,2. Pertanto, il sistema immunitario GI deve mantenere un delicato equilibrio in cui tollera gli antigeni non patogeni rispondendo in modo appropriato agli antigeni patogeni1,2. Quando l'equilibrio di tolleranza e difesa viene interrotto, localizzato o sistemico immune diregolazione e infiammazione può verificarsi con conseguente una miriade di malattie1,2,3.
L'intestino ospita almeno il 70% di tutte le cellule linfoidi nel corpo4. La maggior parte delle interazioni immunologiche primarie coinvolgono almeno una delle tre stazioni immunitarie dell'intestino: 1) Peyer's Patches, 2) Linfociti intraeliali (IEL) e 3) linfociti di lamina (LPL). Ognuna di queste è costituita da una complessa rete interconnessa di cellule immunitarie che rispondono rapidamente alle normali sfide immunitarie nell'intestino5. Limitata allo stroma sopra la mucosae muscolosa, la lamina vagamente strutturata propria è il tessuto connettivo della mucosa intestinale e comprende impalcature per il villus, la vascolatura, il drenaggio linfatico e il sistema nervoso mucosale, così come molti e sottoinsiemi immunitari adattivi6,7,8,9. LPL è composto da celluleT CD4 e CD8 in un rapporto approssimativo di 2:1, cellule plasmatiche e cellule di lignaggio mieloidi tra cui, cellule dendritiche, mastociti, eosinofili e macrofagi6.
C'è un crescente interesse nella comprensione della disregolazione immunitaria e dell'infiammazione dell'intestino in quanto si prova per vari stati di malattia. Tali condizioni come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa manifestano tutti diversi livelli di infiammazione colonica10,11,12. Inoltre, i pazienti con disturbi maligni o non maligni del midollo o del sistema immunitario sottoposti a trapianto di midollo osseo allogenico (allo-BMT) possono sviluppare varie forme di colite, tra cui 1) tossicità diretta da regimi condizionanti prima del BMT, 2) infezioni causate dall'immunosoppressione dopo BMT e 3) malattia di innesto-contro-ospite (GVHD) causata da cellule T di tipo donatore che reagiscono agli allogenesti donatori nei tessuti dopo BMT13,14,15. Tutte queste complicazioni post-BMT provocano alterazioni significative nell'ambiente immunitario dell'intestino16,17,18. Il metodo proposto consente una valutazione affidabile dell'accumulo di cellule immunitarie nel colon del topo e, quando applicato ai destinatari murini dopo BMT, facilita un saggio efficiente delle cellule donatrici e immunitarie riceventi coinvolte nella tolleranza deitrapianti 19 ,20. Ulteriori cause di infiammazione intestinale includono malignità, allergie alimentari, o interruzione del microbioma intestinale. Questo protocollo consente l'accesso alle cellule mononucleari intestinali dal colon e, con modifiche, ai leucociti dell'intestino tenue in uno di questi modelli murini preclinici.
Una ricerca PubMed usando i termini di ricerca "intestine e cellule immunitarie e isolamento" rivela oltre 200 pubblicazioni che descrivono i metodi per la digestione dell'intestino tenue per estrarre le cellule immunitarie. Tuttavia, una ricerca simile alla letteratura per il colon non produce protocolli ben delineati che specificano l'isolamento delle cellule immunitarie dal colon. Questo può essere perché il colon ha strati più muscolari e interstiziali, rendendo più difficile da digerire completamente rispetto all'intestino tenue. A differenza dei protocolli esistenti, questo protocollo utilizza specificamente Collagenase E di Clostridium histolyticum senza altre collagene batteriche (Collagenase D/ Collagenase I). Dimostriamo che, utilizzando questo protocollo, la digestione del tessuto colonico può essere raggiunta preservando la qualità delle cellule immunitarie mononucleari dell'intestino isolate (MNC) senza l'aggiunta di reagenti anti-agglomeranti come il versinato di sodio (EDTA), diSpase II e deoxyribonuclease I (DNasie I)21,22,23. Questo protocollo è ottimizzato per consentire l'estrazione robusta riproducibile di MNC vitale dal colon murino per ulteriori studi diretti e dovrebbe prestarsi allo studio dell'immunologia del colon o (con modifiche) dell'intestino tenue24, 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

L'intestino è la casa del maggior numero di cellule immunitarie nel corpo. Il piccolo e grande sistema immunitario intestinale polizia l'esposizione a antigeni esogeni e modula le risposte a potenti stimoli immunitari microbicamente derivati. Per questo motivo, l'intestino è un importante sito bersaglio di disregolazione immunitaria e infiammazione in molte malattie tra cui, ma, non limitato a malattie infiammatorie intestinali come la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, innesto contro l'ospite (GVHD) dopo l'osso trapianto di midollo (BMT), e molte condizioni allergiche e infettive. I modelli Murine di infiammazione gastrointestinale e colite sono pesantemente utilizzati per studiare le complicazioni GI e per ottimizzare pre-clinicamente le strategie per la prevenzione e il trattamento. I dati ricavati da questi modelli attraverso l'isolamento e l'analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall'intestino sono fondamentali per un'ulteriore comprensione immunitaria che può essere applicata per migliorare i disturbi infiammatori gastrointestinali e sistemici. Questo rapporto descrive un protocollo altamente efficace per l'isolamento delle cellule mononucleari (MNC) dal colon utilizzando un'interfaccia mista di gradiente di densità basata sulla silice. Questo metodo isola riproducibilmente un numero significativo di leucociti vitali riducendo al minimo i detriti contaminati, consentendo la successiva fenotipizzazione immunitaria mediante citometria di flusso o altri metodi.

Quando si lavora con modelli di malattia del colon murino, è utile essere in grado di quantificare e valutare qualitativamente, tra il MNC del colon, più sottoinsiemi di cellule immunitarie coinvolti nel processo infiammatorio. La sospensione a singola cellula di MNC ottenuta attraverso l'applicazione di questo protocollo facilita tale caratterizzazione fenotipica in modo robusto e riproducibile. Come prova di principio per l'applicazione di questo metodo di isolamento in diverse impost...

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Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule mononucleari che risiedono nella lamina propria del colon dalla digestione enzimatica del tessuto usando il collagenae. Questo protocollo consente l'isolamento efficiente delle cellule mononucleari con conseguente sospensione a singola cellula che a sua volta può essere utilizzata per l'immunofenofizzazione robusta.

Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

L'isolamento nell'analisi fenotipica delle cellule immunitarie dall'intestino utilizzando questo protocollo si è dimostrato applicabile alla comprensione dei disturbi infiammatori ig e sistemici. Questo metodo isola un numero significativo di cellule mononucleari vitali riducendo al minimo i detriti contaminanti permettendo la successiva fenotipizzazione immunitaria da parte dell'atomistry di Fleur o di altri metodi. Poiché l'intestino è un importante sito bersaglio di infiammazione in molte malattie, questo protocollo può essere utile per lo studio delle popolazioni immunitarie intestinali nei modelli di topo di cancro, allergia, trapianto e autoimmunità.Per ottimizzare la resa e l'efficienza di questo protocollo, si raccomanda di preparare in anticipo soluzioni e materiali chiave, come indicato. Dopo aver eutanasiato il topo e fatto un'incisione verticale della linea mediana, utilizzare forbici a dissezione fine per aprire il peritoneo. Usando le forcep, spostare il piccolo intestino su un lato ed esporre i due punti discendenti.Tirare leggermente verso l'alto sul colon discendente per esporre al massimo la porzione rettale del colon. Quindi, tagliare il retto distale in profondità nel bacino e sezionare l'intero colon come un'unità dal retto distale al cappuccio cecale. In primo luogo, posizionare il colon su un tovagliolo di carta inumidito e utilizzare l'estremità smussata di un paio di forbici o forcep per applicare una leggera pressione sulla parete intestinale ed estrarre le feci solide.Quindi, posizionare il colon in una piastra di Petri e utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago riempito smussato calibro 18 per sciacquare l'intestino con 10 millilitri di tampone del colon refrigerato. Posizionare il colon in una piastra di Petri riempita con 5-10 millilitri di tampone del colon refrigerato e agitare manualmente per lavare il contenuto di colon rimanente. Ripetere questo lavaggio 2-3 volte, utilizzando una nuova piastra di petri contenente tampone fresco per ogni lavaggio.Successivamente, trasferire il colon in una nuova piastra di Petri contenente tampone di colon fresco refrigerato. Tagliare il colon longitudinalmente dalla sua estremità rettale più muscolosa al colon prossimale, per generare un singolo pezzo rettangolare del colon aperto. Scartare la mediana nel piatto e sostituirla con un tampone del colon refrigerato pulito.Posizionare il tessuto rettangolare del colon su un tovagliolo di carta che viene inumidito con tampone del colon e tagliarlo tagliarlo orizzontalmente e quindi in piccoli frammenti. Utilizzare forcep fini per raccogliere i frammenti del colon in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri contenente 20 millilitri di tampone del colon refrigerato. Quindi, lavare i frammenti ruotando vigorosamente il tubo per 30 secondi.Dopo il lavaggio, lasciare che i frammenti di tessuto si sistemino sul fondo del tubo prima di decantare o aspirare sottovuoto il supernatante, Assicurandosi di evitare di perdere frammenti di tessuto, ripetere l'intero processo di lavaggio 3 volte utilizzando il tampone del colon fresco per ogni lavaggio. Per iniziare, aggiungere 20 millilitri di tampone di digestione della collagenasi al tubo contenente i frammenti di colon lavati. Sigillare il tubo e posizionarlo in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius con una velocità di rotazione di 2 volte G per 60 minuti.Assicurarsi che i frammenti di tessuto siano in costante movimento durante l'agitazione. In primo luogo, versare 5 millilitri di mezzi di separazione della densità a base di silice al 66% in ciascuno dei 3 tubi di polipropilene separati da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per raccogliere solo il supernatante dalla digestione della collagenasi 1.Filtrare il supernatante attraverso un filtro cellulare in tessuto di filtrazione povero da 40 microlitri posto in un tubo conico in polipropilene pulito da 50 millilitri. Riempire completamente il tubo con tampone del colon refrigerato per spegnere il tampone di digestione della collagenasi. Quindi girare le cellule, aspirare il supernatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.Continuare a eseguire collagenasi Digestione 2 come delineato nel protocollo di testo. Dopo aver completato la digestione della collagenasi 2, sciacquare vigorosamente i frammenti di tessuto avanti e indietro tra il tubo e una siringa da 10 millilitri attraverso un ago contundente calibro 18. Ripetere questo lavaggio per almeno 7-8 passaggi, continuando fino a quando non sono visibili frammenti di tessuto lordo o debri.Successivamente, passare la sospensione di disaggregazione del tessuto attraverso un filtro cellulare in tessuto di filtrazione povero di 40 micrometri posto in un tubo di polipropilene pulito da 50 millilitri. Riempire il tubo sul bordo con tampone del colon refrigerato per spegnere la digestione e centrifugare a 800 volte G a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Scartare il supernatante tramite aspirazione sottovuoto e estrarre il pellet sospeso dalla digestione della collagenasi 1 al suo tubo corrispondente.Successivamente, sospendere ogni pellet in 24 millilitri di mezzi di separazione della densità a base di silice al 44% per colon. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per strato lento di 8 millilitri di questo supporto su ciascuno dei 3 tubi contenenti il 66% di mezzi di separazione della densità basati sulla silice. Bilanciare accuratamente i tubi all'interno di secchi di centrifuga utilizzando una bilancia di pesata o una bilancia.Centrifuga a 859 volte G a 20 gradi Celsius per 20 minuti senza pausa. Lasciare riposare completamente le aste prima di rimuovere i tubi, facendo attenzione a non interrompere le celle all'interfaccia del gradiente. In primo luogo, visualizzare l'interfaccia sfumato vicino al segno di 5 millilitri, dove in genere è presente una banda bianca spessa 1-2 millilitri.Aspirare e scartare i primi 7 millilitri della sfumatura per consentire un più facile accesso alla pipetta all'interfaccia. Utilizzando l'aspirazione manuale continua e il movimento costante del polso rotante, raccogliere lo strato di interfaccia delle cellule. Raccogliere fino a quando l'interfaccia tra le due sfumature è chiara e refrattaria e trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 millilitri.Aggiungere quindi FACS Buffer a questa vasca fino a quando la sospensione totale raggiunge i 50 millilitri. Centrifuga a 800 volte G a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Quindi, aspirare il supernatante tramite aspirazione sottovuoto e sospendere il pellet in 1 millilitro di FACS Buffer.La procedura descritta in questo video può essere utilizzata per isolare le cellule mononucleari dal colon o, con modifiche, dall'intestino tenue. Inoltre, la citometria e l'analisi dei dati vengono eseguite per confrontare le frazioni di linfociti apoptotici e necrotici / morti quando si utilizza collagenasi E o D per l'isolamento, con il nostro trattamento senza DNAse 1. In seguito all'allegato 5 e alla colorazione fissabile del colorante blu vivo vivo su sospensioni a singola cellula dopo ogni isolamento, la collagenasi E senza DNAsi ha mostrato una percentuale significativamente più elevata di cellule vive dopo l'isolamento rispetto alla collagenasi D senza DNAsi.Anche se confrontato con entrambe le collagenasi con DNASI. Inoltre, abbiamo identificato le cellule necrotiche con una percentuale mediana del 41,0% nel gruppo Collagenasi E rispetto al 90,0% nel gruppo Collagenasi D. 75,9% nel gruppo Collagenasi E DNAse e 80,3% nel gruppo Collagenasi DNAsi.La citometria a flusso multiperimetrico viene quindi applicata all'MNC isolato dai topi riceventi valvola-C CD45.2 il giorno 7 dopo aver ricevuto modelli BMT o BMT allogeneici o sigeneici. Vengono calcolati e confrontati i numeri assoluti medio delle cellule T positive del donatore CD4 e CD8 estratte dai due punti del ricevente BMT. Quindi può essere importante identificare e / o quantificare rare popolazioni di cellule immunitarie in tali modelli di topo.Sottoinsiemi rari, comprese le cellule regolatorie T positive FOX-P3 derivate dal donatore sono valutati sia nei modelli sigeneici che in quelli allogeni BMT. Utilizzando questo metodo, possono essere analizzati anche sottoinsiemi rari, come i due punti del topo riceventi che si infiltrano nel colon del topo del colon ricevente derivato dal donatore T, dopo BMT. Va notato che la collagenasi E è attiva a 37 gradi Celsius.Quindi tutte le soluzioni di collagenasi dovrebbero essere pre-riscaldate per un'adeguata attività della collagenasi e accuratamente tempre per terminare l'attività. Questo protocollo consente un gran numero di cellule mononucleari che possono essere utilizzate per la successiva caratterizzazione da parte di una citometria fleur, tecniche di biologia molecolare, microscopia, coltura e sito di, tra gli altri. Questo protocollo ha fornito una valutazione affidabile dell'infiammazione nel colon di topi sperimentali contro controllati in un modello di trapianto di midollo osseo.Facilitando così la scoperta di nuovi meccanismi immunitari normativi di tolleranza ai trapianti. La collagenasi del Clostridium Istoliticum è un reagente che dovrebbe essere maneggiato con tecniche di sicurezza di laboratorio. Rappresenta un pericolo per la salute quando inalato e può causare irritazione della pelle e degli occhi.

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