Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
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이 작품은 #1K08HL088260 및 #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) 및 소아 연구를위한 배치 재단 (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.)에 의해 지원되었습니다. 이 연구에서 사용된 C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 우리 시설에서 사육되었거나 잭슨 연구소 또는 타코닉에서 제공했습니다.

모든 연구는 미국 협회가 정한 수의학적 기준을 충족하는 마이애미 밀러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인된 설치류 연구 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실험실 동물 과학 (AALAS)에 대 한.
1. 솔루션 준비
<ol><li>
표 1에 기재된 바와 같이, 결장 완충제, 실리카 계 밀도 분리 매체 100%, 실리카 계 밀도 분리 매체 66%, 실리카 계 밀도 ?...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. 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J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

이 시각적 프로토콜은 라미나 프로피아 림프구(LPL)를 포함하는 결장 단핵 세포의 분리를 위한 잘 용납되는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 염증성 사이토카인과 조직 손상이 회복 된 MNC의 가난한 생존력에 자신을 빌려 심각한 이식 후 마우스 대장염 모델을 평가에 최적화 된 것을 감안할 때, 우리는 이러한 방법이 다른 것으로 번역 될 수 있음을 예상 결장 MNC의 현상학적 분석을 요구하는 응용 프...

위장 (GI) 관은 주로 음식에서 영양소의 처리 및 재흡수에 전념하지만, 위관은 또한 혈관, 림프, 신경계 및 수많은 다른 장기의 무결성에 중심 적인 역할을 유지합니다. 그것의 점막 및 점막 면역 계통1. GI 면역 계통은 음식, 공생 박테리아, 또는 침입 병원체에서 외국 항원에 그것의 일정한 노출 때문에 위장 및 전신 건강 둘 다에 있는 영향력 있는 역할을 합니다1,2. 따라서, GI 면역 계통은 병원성 항원1,2에적절히 반응하면서 비병원성 항원을 용인하는 섬세한 균형을 유지해야 한다. 관용과 방어의 균형이 중단되면, 국소화 또는 전신 면역 dysregulation 및 염증은 질병의 무수한 의 결과로 발생할 수 있습니다1,2,3.
창자 항구 적어도 70% 본문에 있는 모든 림프 세포의4. 대부분의 1 차적인 면역학 상호 작용은 창자에 있는 3개의 면역 국중 적어도 1개를 관련시킵니다: 1) Peyer의 패치, 2) 상피 내 림프구 (IEL) 및 3) 라미나 프로피아 림프구 (LPL). 이들의 각각은 창자5에있는 일반적인 면역 도전에 급속하게 반응하는 면역 세포의 복잡한 상호 연결된 네트워크로 이루어져 있습니다. 근육 점막 위의 기질로 제한되는 느슨하게 구조화 된 라미나 프로프리아는 창자 점막의 결합 조직이며 융모, 혈관 구조, 림프 배수 및 점막 신경계뿐만 아니라 많은 선천성 신경 조직에 대한 비계를 포함합니다. 및 적응 면역 하위 집합6,7,8,9. LPL은CD4+ 및CD8+ T 세포로 구성되며, 약 2:1의 비율로, 혈장 세포 및 골수성 혈통 세포, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및 대식세포6을포함한다.
다양한 질병 상태에 관련되어 있는 면역 dysregulation 및 창자의 염증을 이해에 있는 증가하는 관심사가 있습니다. 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 조건은 모두 대장염증10,11,12의다양한 수준을 나타낸다. 추가적으로, 동종 골수 이식 (allo-BMT)를 겪는 골수 또는 면역 계통의 악성 또는 비 악성 무질서를 가진 환자는 1) 조건정 식이요법에서 직접 독성을 포함하여 대장염의 각종 양식을 개발할 수 있습니다 BMT 전, 2) BMT 및 3) 이식편 대 숙주 질환(GVHD)에 의해 유발된 감염은 BMT13,14,15이후 조직에서 공여자 알로항원에 반응하는 기증자 형 T 세포에 의해 구동된다. 이 모든 포스트 BMT 합병증은 장의 면역 군대에 있는 중요한 변경 귀착됩니다16,17,18. 제안된 방법은 마우스 결장에서 면역 세포 축적의 신뢰할 수 있는 평가를 허용하고, BMT 후 뮤린 수용자에 적용될 때, 이식 내성 19에 관여하는 기증자 및 수용자 면역 세포 둘 다의 효율적인 분석법을 용이하게한다. ,20. 창 자 염증의 추가 원인은 악성 포함, 음식 알레르기, 또는 창 자 미생물의 중단. 이 프로토콜은 결장에서 창자 단핵 세포의 접근을 허용하고, 수정으로, 이 전임상 뮤린 모형의 소장의 백혈구에.
"내장 및 면역 세포 및 격리"라는 검색어를 사용한 PubMed 검색은 면역 세포를 추출하기 위해 소장 소화 방법을 설명하는 200 개 이상의 간행물을 보여줍니다. 그러나, 결장에 대 한 유사한 문학 검색 콜론에서 면역 세포의 격리를 지정 하는 잘 설명 된 프로토콜을 산출. 이것은 결장이 더 많은 근육과 간질 층을 가지고 있기 때문일 수 있습니다, 그것을 더 어렵게 소장 보다는 소화하기 위하여 렌더링합니다. 기존 프로토콜과 달리, 이 프로토콜은 다른 세균성 콜라게나제(콜라게나제 D/콜라게나아제 I)없이 클로스트리디움 의 콜라주나아제 E를 사용합니다. 우리는 이 프로토콜을 사용하여, 결장 조직의 소화가 나트륨 versenate (EDTA), Dispase II및 와 같은 반대로 응집 시약의 추가 없이 고립된 창자 단핵 면역 세포 (MNC)의 질을 보존하면서 달성될 수 있다는 것을 보여줍니다 deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. 이 프로토콜은 추가 지시 된 연구를 위해 뮤린 결장에서 생존 가능한 MNC의 재현 가능한 강력한 추출을 허용하도록 최적화되어 있으며 결장의 면역학 또는 소장 (수정)의 연구에 자신을 빌려주어야합니다24, 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

창 자 본문에 면역 세포의 가장 큰 수에 가정. 작고 큰 장 내 면역 계통은 외인성 항원에 노출하고 강력한 미생물 유래 면역 자극에 대한 반응을 조절합니다. 이러한 이유로, 장은 크론병및 궤양성 대장염, 이식편 대 숙주질환(GVHD)과 같은 염증성 장질환을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 질병에서 면역 조절 및 염증의 주요 표적 부위이다. 골수 이식 (BMT), 그리고 많은 알레르기 및 전염성 조건. 위장 염증과 대장염의 뮤린 모델은 GI 합병증을 연구하고 예방 및 치료를 위한 전략을 전임상적으로 최적화하는 데 많이 사용됩니다. 장에서 면역 세포의 격리 및 phenotypic 분석을 통해 이러한 모델에서 수집 된 데이터는 위장 및 전신 염증 성 질환을 개량 할 수있는 추가 면역 이해에 중요하다. 이 보고서는 혼합 실리카 기반 밀도 구배 계면을 사용하여 결장으로부터 단핵 세포(MNC)를 분리하기 위한 매우 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 오염 된 파편을 최소화하면서 생존 가능한 백혈구의 상당수를 재현하여 유세포 분석 또는 다른 방법에 의해 후속 면역 자형법을 허용합니다.

뮤린 결장 질환 모델로 작업할 때, 염증 과정에 관여하는 결장의 MNC, 다중 면역 세포 서브세트를 정량화하고 질적으로 평가할 수 있는 것이 도움이 된다. 이 프로토콜의 적용을 통해 얻은 MNC의 단세포 현탁액은 강력하고 재현 가능한 방식으로 이러한 현상형 특성화를 용이하게 한다. 다양한 실험 설정하에서 이러한 격리 방법의 적용에 대한 원리의 증거로서, 우리는 이 방?...

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Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

이 프로토콜을 사용하여 장에서 면역 세포의 phenotypic 분석에서 격리는 GI및 전신 염증 장애의 이해에 적용 할 수 입증했다. 이 방법은 플뢰르의 아토미트리 또는 기타 방법에 의해 후속 면역 현상기를 허용하는 오염 된 파편을 최소화하여 실행 가능한 단일 핵 세포의 상당수를 격리합니다. 장이 많은 질병에 있는 염증의 주요 표적 사이트이기 때문에, 이 프로토콜은 암, 알레르기, 이식 및 자기 면역의 마우스 모형에 있는 장 면역 집단의 연구 결과에 유용할 지도 모릅니다.이 프로토콜의 수율과 효율성을 최적화하려면 주요 솔루션과 재료를 미리 준비하는 것이 좋습니다. 마우스를 안락사시키고 수직 중간선 절개를 한 후 미세 해부 가위를 사용하여 회랑을 엽니다. 집게를 사용하여 작은 창자를 한쪽으로 이동하고 내림차순 결장이 노출됩니다.내림차순 결장위로 약간 위로 당겨 결장의 직장 부분을 최대적으로 노출시합니다. 그런 다음, 골반 깊숙이 해회 직장을 잘라 세칼 캡에 실외 창자에서 하나의 단위로 전체 결장해. 첫째, 축축한 종이 타월에 결장들을 놓고 가위 나 집게 한 쌍의 무딘 끝을 사용하여 창자 벽에 가벼운 압력을 가하고 고체 대변을 추출하십시오.다음으로, 결장들을 페트리 접시에 놓고 18게이지 무딘 채워진 바늘로 10 밀리리터 주사기를 사용하여 차가운 결장 버퍼 10밀리리터로 용기를 플러시합니다. 콜론을 5-10 밀리리터의 차가운 결장 버퍼로 가득 찬 페트리 접시에 놓고 나머지 식민지 내용을 씻기 위해 수동으로 교반하십시오. 이 워시를 2-3회 반복하여 각 세척에 신선한 버퍼가 들어 있는 새로운 페트리 접시를 사용하십시오.그 후, 콜론을 신선한 냉장 결장 버퍼가 들어 있는 새로운 페트리 접시로 옮춥니다. 결장은 더 근육질의 직장 끝에서 근위 결장까지 세로로 잘라서 단일 직사각형 열린 결장 조각을 생성합니다. 접시의 중앙값을 버리고 깨끗한 차가운 결장 버퍼로 대체하십시오.직사각형 결장 조직을 결장 버퍼로 축화한 종이 타월에 놓고 수평으로 잘라서 작은 조각으로 자릅니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 콜론 조각을 수집 50 밀리 리터 폴리 프로필렌 원추형 튜브 포함 20 차가운 결 장 버퍼의 밀리 리터. 그런 다음 튜브를 30초 동안 적극적으로 소용돌이시켜 조각을 씻습니다.세척 후, 조직 조각이 차혈을 탈피하거나 진공 청소기 전에 튜브의 바닥에 정착하자, 조직 조각을 잃지 않도록확인, 각 세척에 대한 신선한 결장 버퍼를 사용하여이 전체 세척 과정을 3 번 반복. 시작하려면 세척된 결장 조각을 포함하는 튜브에 콜라게나아제 소화 버퍼 20 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 밀봉하고 60 분 동안 2 회 G의 회전 속도로 섭씨 37도에서 궤도 셰이커에 놓습니다.조직 파편이 교반 중에 일정한 움직임에 있는지 확인하십시오. 먼저, 66%의 실리카 기반 밀도 분리 매체를 각각 3개의 분리된 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 붓습니다. 다음으로, 콜라게나제 소화 1에서 상퍼만 수집하기 위해 25 밀리리터 세로지오티 파이펫을 사용합니다.깨끗한 50 밀리리터 폴리 프로필렌 원간 튜브에 배치 40 마이크로 리터 가난한 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 상체를 필터링합니다. 차가운 결장 버퍼로 튜브를 완전히 채우면 콜라게나아제 소화 버퍼를 담금질하십시오. 그런 다음 세포를 회전시키고, 슈퍼나티를 흡인하고, 펠릿을 얼음 위에 두십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜라게나아제 소화 2를 계속 수행합니다. 콜라게나아제 소화 2가 완료된 후, 18게이지 무딘 엔드 바늘을 통해 튜브와 10 밀리리터 주사기 사이에 조직 조각을 적극적으로 앞뒤로 플러시합니다. 적어도 7-8 개의 구절에 대한이 플러시를 반복, 총 조직 파편이나 debri가 볼 때까지 계속.다음으로, 40 마이크로미터 가난한 여과 직물 세포 스트레이너를 통해 조직 분리 현탁액을 깨끗한 50 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 넣습니다. 차가운 결장 버퍼로 튜브를 림에 채우고 소화와 원심분리기를 섭씨 4도에서 섭씨 4도에서 5분간 담금질합니다. 진공 포부를 통해 상체를 버리고 콜라게나제 소화 1에서 해당 튜브로 재 부유 한 펠릿을 당깁니다.그 후, 콜론당 44%실리카 기반 밀도 분리 매체의 24밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단한다. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 66% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 포함하는 3개의 튜브에 이 매체의 8 밀리리터를 천천히 층으로 부릅니다. 계량 스케일 또는 균형을 사용하여 원심분리기 버킷 내의 튜브의 균형을 신중하게 조정합니다.원심분리기는 섭씨 20도에서 859회 G로 20분간 쉬지 않고 휴식을 취합니다. 로더가 튜브를 제거하기 전에 휴식을 취하도록 허용하고 그라데이션 인터페이스에서 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오. 첫째, 일반적으로 1-2 밀리리터 두께의 흰색 밴드가 존재하는 5 밀리리터 마크 근처의 그라데이션 인터페이스를 시각화합니다.진공 흡인및 인터페이스에 쉽게 파이펫 액세스를 허용하기 위해 그라데이션의 상위 7 밀리리터를 폐기합니다. 연속 수동 흡입 및 꾸준한 회전 손목 모션을 사용하여 셀의 인터페이스 레이어를 수집합니다. 두 그라데이션 사이의 인터페이스가 명확하고 재구성될 때까지 수집하고 인터페이스를 새로운 50 밀리리터 폴리프로필렌 원내 튜브로 전송합니다.다음으로 총 서스펜션이 50밀리리터에 도달할 때까지 FACS 버퍼를 이 욕조에 추가합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 800배 G로 5분간. 그런 다음, 진공 포부를 통해 상류체를 흡인하고 FACS 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.이 비디오에 설명된 절차는 결장에서 단핵 세포를 분리하거나, 수정과 함께, 소장으로부터 분리하는 데 사용할 수 있다. 또한 세포측정및 데이터 분석은 분리를 위해 콜라게나아제 E 또는 D를 사용할 때 세포 및 괴사/죽은 림프구의 분획을 DNAse 1 치료 없이 당사와 비교하기 위해 수행됩니다. 별관 에 이어 5 각 절연 다음 단일 세포 현탁액에 고정 된 살아있는 죽은 푸른 염료 염색, DNAse없이 콜라게나아제 E는 DNAse없이 콜라게나아제 D에 비해 격리 후 라이브 셀의 상당히 높은 비율을 보였다.DNAse와 콜라게나아제에 비해 경우에도 마찬가지입니다. 또한 콜라게나아제 D군의 90.0%에 비해 콜라게나아제 E군에서 괴사 세포를 41.0%의 중간 비율로 확인하였다. 콜라게나세 E DNAse 그룹에서 75.9%, 콜라게나아제 DNAse 그룹에서 80.3%를 차지했다.다중 계측흐름 세포측정은 BMT 또는 동종 또는 합성 BMT 모델을 받은 후 7일째 CD45.2 밸브-C 수신자 마우스로부터 분리된 MNC에 적용된다. BMT 수령인의 결장에서 추출된 기증자 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포의 평균 절대 숫자는 계산되고 비교된다. 따라서 이러한 마우스 모델에서 희귀 면역 세포 집단을 식별 및/또는 수량화하는 것이 중요할 수 있습니다.기증자 유래 FOX-P3 양성 T 조절 세포를 포함하는 희귀 한 하위 세트는 합성 및 동종 BMT 모델 모두에서 평가됩니다. 이 방법을 사용하여, 심지어 희귀 한 하위 집합, 기증자 파생 된 대장 T 조절 수신자 마우스 결장에 침투, BMT 후, 분석 될 수있다. 콜라게나아제 E는 섭씨 37도에서 활동한다는 점에 유의해야 합니다.따라서 모든 콜라게나아제 솔루션은 적절한 콜라게나아제 활동을 위해 미리 데워지고 활동을 종료하도록 철저히 담금질해야 합니다. 이 프로토콜은 플뢰르 세포측정, 분자 생물학 기술, 현미경 검사법, 배양 및 그 외의 사이트에 의해 후속 특성화에 사용될 수 있는 많은 수의 단일 핵 세포를 허용합니다. 이 프로토콜은 골수 이식 모형에 있는 실험 대 통제마우스의 결장에 있는 염증의 믿을 수 있는 평가를 제공했습니다.따라서 이식 내성의 새로운 규제 면역 메커니즘의 발견을 촉진. 클로스트리디움 이스토리티쿰의 콜라게나제는 실험실 안전 기술로 처리해야 하는 시약입니다. 흡입시 건강에 해를 끼치고 피부와 눈 자극을 유발할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

연구

면역학 및 감염병학

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

쥐과 잇몸 세포의 분리, 처리 및 분석

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

부유 기반 T 세포 분리, 활성화 및 마이크로버블을 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 샘플로부터의 확장

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...