Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd #1K08HL088260 og #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), og Batchelor Foundation for pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 og BALB/c mus som brukes i denne studien ble enten avlet i vårt anlegg eller levert av Jackson Labs eller Taconic.

Alle studier var gjennomførte under gnager forskning protokoller anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av universitetet av Miami møllen skolen av medisin, hvilke møter det Veterinary standarder sette av amerikaneren forening for laboratorium dyr vitenskap (AALAS).
1. utarbeidelse av løsninger
<ol><li>
Som beskrevet i tabell 1, forberede Colon buffer, silica-baserte Density separasjon Media 100%, silica-basert tetthet separasjon Media 66%,...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Denne visuelle protokollen beskriver godt tolerert metoder for isolering av colonic mononukleære celler inkludert lamina propria lymfocytter (LPL). Gitt at denne protokollen ble optimalisert i å evaluere alvorlig post-transplantasjon mus kolitt modeller hvor inflammatorisk cytokiner og vevsskade egner seg til dårlig levedyktighet av utvinnes MNC, forventer vi at disse metodene kan oversettes til andre applikasjoner som krever fenotypiske analyse av colonic MNC. Disse inkluderer, men, er ikke begrenset til å vurdere k...

Selv om Gastrointestinal (GI)-kanalen er primært dedikert til behandling og reabsorpsjon av næringsstoffer fra mat, opprettholder GI veiene også sentrale roller i integriteten av vaskulære, lymfatisk, og nervøse systemer og av mange andre organer gjennom sin slimhinne og submucosal immunsystem1. GI immune systemet har en innflytelsesrik rolle i både Gastrointestinal og systemisk helse på grunn av sin konstante eksponering for utenlandske antigener fra mat, Commensal bakterier, eller invadere patogener1,2. Dermed må gi immunforsvaret opprettholde en delikat balanse der det tåler ikke-patogene antigener mens svarer hensiktsmessig til patogene antigener1,2. Når balansen av toleranse og forsvar er forstyrret, lokaliserte eller systemisk immune feilregulering og betennelse kan oppstå som resulterer i en myriade av sykdommer1,2,3.
Tarmen havner minst 70% av alle lymfoide celler i kroppen4. De fleste primære Immunologic interaksjoner innebære minst én av tre uimottakelig stasjoner i tarmen: 1) Peyer ' s patcher, 2) intraepithelial-lymfocytter (IEL) og 3) lamina propria-lymfocytter (LPL). Hver av disse består av et komplekst sammenhengende nettverk av immunceller som raskt reagerer på normale immun utfordringer i tarmen5. Begrenset til stroma over muscularis mucosae, løst strukturert lamina propria er bindevev i tarmen mucosa og inkluderer stillas for villus, den blodkar, lymfatisk drenering, og slimhinnen nervesystemet, samt mange medfødt og adaptive immune undergrupper6,7,8,9. LPL består av CD4+ og CD8+ T celler i et omtrentlig forhold på 2:1, plasma celler og myelogen avstamning celler inkludert, dendrittiske celler, mastceller, eosinofile og makrofager6.
Det er en økende interesse i å forstå immun feilregulering og betennelse i tarmen som det gjelder ulike sykdomstilstander. Slike forhold som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt manifesterer alle varierende nivåer av colonic betennelse10,11,12. I tillegg kan pasienter med ondartede eller ikke-ondartede forstyrrelser i margen eller immunsystemet som gjennomgår en allogene benmarg transplantasjon (Allo-BMT) utvikle ulike former for kolitt inkludert 1) direkte toksisitet fra condition regimer før BMT, 2) infeksjoner forårsaket av immunsuppresjon etter BMT og 3) pode-versus-host sykdom (GVHD) drevet av donor-type T-celler reagerer på donor Allo-antigener i vevet etter BMT13,14,15. Alle disse post-BMT komplikasjoner resultere i betydelige endringer i immun miljøet i tarmen16,17,18. Den foreslåtte metoden gjør det mulig for en pålitelig vurdering av immun celle akkumulering i musen kolon, og når den brukes til murine mottakere etter BMT, forenkler en effektiv analyse av både donor og mottaker immunceller involvert i transplantasjon toleranse19 ,20. Ytterligere årsaker til tarmbetennelse inkluderer ondartet, matallergier, eller forstyrrelse av tarmen mikrobiomet. Denne protokollen gir tilgang til gut mononukleære celler fra kolon og, med modifikasjoner, til leukocytter av tynntarmen i noen av disse prekliniske murine modeller.
En PubMed søk ved hjelp av søkeordene "tarmen og immun celle og isolasjon" avslører over 200 publikasjoner som beskriver metoder for tynntarmen fordøyelsen å trekke ut immunceller. Men en lignende litteratursøk for kolon gir ingen godt avgrenset protokoller spesifisere isolering av immunceller fra kolon. Dette kan være fordi kolon har mer muskuløse og interstitiell lag, rendering det vanskeligere å fullstendig fordøye enn tynntarmen. I motsetning til eksisterende protokoller, bruker denne protokollen spesifikt Kollagenase E fra histolyticum uten andre bakterielle Collagenases (kollagenase D/kollagenase I). Vi viser at ved hjelp av denne protokollen, fordøyelsen av colonic vev kan oppnås samtidig bevare kvaliteten på isolerte gut mononukleære immunceller (MNC) uten tilsetning av anti-klumper reagenser som natrium versenate (EDTA), Dispase II, og deoxyribonuclease i (DNAse i)21,22,23. Denne protokollen er optimalisert for å tillate reproduserbar robust utvinning av levedyktige MNC fra murine kolon for videre rettet studier og bør låne seg til studiet av immunologi av kolon eller (med modifikasjoner) i tynntarmen24, 25på.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

Tarmen er hjemmet til det største antall immunceller i kroppen. Det liten og stor intestinal immun systemer politiet avsøring å eksogene antigener og modulere Svar å potent mikrobielt avledet immun stimuli. Av denne grunn er tarmen et viktig målområde for immun feilregulering og betennelse i mange sykdommer, inkludert men, ikke begrenset til inflammatoriske tarm sykdommer som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, pode-versus-host sykdom (GVHD) etter bein marg transplantasjon (BMT), og mange allergiske og smittsomme tilstander. Murine-modeller av gastrointestinal betennelse og kolitt er mye brukt til å studere GI komplikasjoner og til pre-klinisk optimalisere strategier for forebygging og behandling. Data samlet fra disse modellene via isolasjon og fenotypiske analyse av immunceller fra tarmen er avgjørende for ytterligere immun forståelse som kan anvendes for å forbedre Gastrointestinal og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne rapporten beskriver en svært effektiv protokoll for isolering av mononukleære celler (MNC) fra kolon ved hjelp av en blandet silica-basert tetthet gradient grensesnitt. Denne metoden reproduserbar isolerer et betydelig antall levedyktige leukocytter samtidig minimere forurensende rusk, slik at påfølgende immune bestemmelse av fenotype ved flyt flowcytometri eller andre metoder.

Når du arbeider med murine Colon sykdom modeller, er det nyttig å kunne både kvantifisere og kvalitativt vurdere, blant MNC i tykktarmen, flere immun celle delsett involvert i den inflammatoriske prosessen. Den single-celle suspensjon av MNC innhentet gjennom anvendelsen av denne protokollen Letter slike fenotypiske karakterisering i en robust og reproduserbar måte. Som et bevis på prinsippet for anvendelsen av denne isolasjons metoden under diverse eksperimentelle innstillinger, vi ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Målet med denne protokollen er å isolere mononukleære celler som ligger i lamina propria i tykktarmen ved enzymatisk fordøyelse av vevet ved hjelp av kollagenase. Denne protokollen gjør det mulig for effektiv isolering av mononukleære celler som resulterer i en enkelt celle suspensjon som i sin tur kan brukes til robuste immunfenotyping.

Isolering av lamina propria mononukleære celler fra murine Colon bruke Kollagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolasjon i fenotypisk analyse av immunceller fra tarmen ved hjelp av denne protokollen har vist seg å være gjeldende for forståelsen av GI og systemiske inflammatoriske lidelser. Denne metoden isolerer et betydelig antall levedyktige mononukleære celler ved å minimere forurensende rusk slik at etterfølgende immunfenotyping av Fleurs Atomistry eller andre metoder. Siden tarmen er et viktig mål for betennelse i mange sykdommer, kan denne protokollen være nyttig for studiet av intestinale immunpopulasjoner i musemodeller av kreft, allergi, transplantasjon og autoimmunitet.For å optimalisere utbyttet og effektiviteten til denne protokollen, anbefales det at viktige løsninger og materialer tilberedes på forhånd som nevnt. Etter euthanizing musen og lage en vertikal midtlinje snitt, bruk fin disseksjon saks for å åpne bukhinnen. Bruk tang, flytt tynntarmen til den ene siden og utsett det synkende tykktarmen.Trekk litt oppover på det synkende tykktarmen for å maksimalt utsette den rektale delen av tykktarmen. Klipp deretter det distale endetarmen dypt i bekkenet og dissekere hele tykktarmen som en enhet fra det distale endetarmen til cecal cap. Først legger du tykktarmen på et fuktet papirhåndkle og bruker den stumpe enden av en saks eller tang for å bruke mildt trykk på tarmveggen og trekke ut den faste avføringen.Deretter plasserer du tykktarmen i en petriskål og bruker en 10 milliliter sprøyte med en 18-gauge stump fylt nål for å skylle tarmen med 10 milliliter kjølt kolonbuffer. Legg tykktarmen i en petriskål fylt med 5-10 milliliter kjølt kolonbuffer og agterett manuelt for å vaske det gjenværende koloninnholdet. Gjenta denne vasken 2-3 ganger, ved hjelp av en ny petriskål som inneholder frisk buffer for hver vask.Etter dette overfører du tykktarmen til en ny petriskål som inneholder fersk kjølt kolonbuffer. Klipp tykktarmen langsgående fra sin mer muskuløse rektal ende til proksimal kolon, for å generere en enkelt rektangulær åpen kolon stykke. Kast medianen i fatet og erstatt den med ren kjølt kolonbuffer.Plasser det rektangulære kolonvevet på et papirhåndkle som er fuktet med kolonbuffer og kutt det ved å kutte det horisontalt og deretter inn i små fragmenter. Bruk fine tang til å samle kolonfragmentene i et 50 milliliter polypropylen konisk rør som inneholder 20 milliliter kjølt kolonbuffer. Vask deretter fragmentene ved kraftig virvlende rør i 30 sekunder.Etter vasken, la vevfragmentene bosette seg til bunnen av røret før dekantering eller vakuum aspirerer det overnaturante, Sørg for å unngå å miste vevfragmenter, gjenta hele vaskeprosessen 3 ganger ved hjelp av fersk kolonbuffer for hver vask. For å begynne, tilsett 20 milliliter collagenase fordøyelsesbuffer til røret som inneholder de vasket kolonfragmentene. Forsegle røret og legg det i en orbital shaker ved 37 grader Celsius med en rotasjonshastighet på 2 ganger G i 60 minutter.Sørg for at vevsfragmentene er i konstant bevegelse under agitasjon. Hell først 5 milliliter med 66% silikabaserte tetthetsseparasjonsmedier i hver av 3 separate 15 milliliter polypropylenrør. Deretter bruker du en 25 milliliter serologisk pipette for å samle bare supernatant fra Collagenase Digestion 1.Filtrer supernatanten gjennom en 40 mikroliter dårlig filtreringsstoffcellesil plassert i et rent 50 milliliter polypropylen konisk rør. Fyll røret helt med kjølt kolonbuffer for å slukke collagenase fordøyelsesbufferen. Deretter spinner cellene, aspirerer supernatanten, og hold pelleten på is.Fortsett å utføre Collagenase Digestion 2 som beskrevet i tekstprotokollen. Etter at Collagenase Digestion 2 er fullført, skyll vevfragmentene kraftig frem og tilbake mellom røret og en 10 milliliter sprøyte gjennom en 18-gauge stump endenål. Gjenta denne flush for minst 7-8 passasjer, fortsetter til ingen brutto vev fragmenter eller rusk er synlige.Deretter passerer vev disaggregation suspensjon gjennom en 40 mikrometer dårlig filtrering stoff celle sil plassert i en ren 50 milliliter polypropylen rør. Fyll røret til felgen med kjølt kolonbuffer for å slukke fordøyelsen og sentrifugen ved 800 ganger G i ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Kast det supernatante via vakuumaspirasjon og trekk re suspendert pellet fra Collagenase Digestion 1 til tilsvarende rør.Etter dette, re suspendere hver pellet i 24 milliliter av 44% silika basert tetthet separasjon media per kolon. Bruk en 10 milliliter serologisk pipette til sakte lag 8 milliliter av dette mediet på hver av 3 rør som inneholder 66% silikabasert tetthetsseparasjonsmedie. Balansere rørene forsiktig i sentrifugebøtter ved hjelp av en veieskala eller en balanse.Sentrifuge ved 859 ganger G i ved 20 grader Celsius i 20 minutter uten pause. La stengene komme til å hvile før du fjerner rør, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellene i gradientgrensesnittet. Først visualisere gradientgrensesnittet nær 5 milliliter merket, hvor vanligvis en 1-2 milliliter tykk hvitt bånd er til stede.Støvsug aspirer og kast de 7 beste milliliter av gradienten for å gi enklere pipettetilgang til grensesnittet. Ved hjelp av kontinuerlig manuell suging og jevn roterende håndleddbevegelse, samle grensesnittlaget av celler. Samle til grensesnittet mellom de to gradientene er klart og bryte og overføre grensesnittet til en ny 50 milliliter polypropylen konisk rør.Deretter legger du til FACS Buffer i dette karet til den totale suspensjonen når 50 milliliter. Sentrifuge ved 800 ganger G i ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Deretter aspirerer du supernatanten via vakuumaspirasjon og re suspender pelleten i 1 milliliter FACS Buffer.Prosedyren som er beskrevet i denne videoen, kan brukes til å isolere mononukleære celler fra tykktarmen eller, med modifikasjoner, fra tynntarmen. I tillegg utføres cytometri og dataanalyse for å sammenligne fraksjonene av apoptotiske og nekrotiske/døde lymfocytter når du bruker enten Collagenase E eller D for isolasjonen, med vår uten DNAse 1-behandling. Etter vedlegg i 5 og fixable levende døde blå fargestoff farging på encellede suspensjoner etter hver isolasjon, Collagenase E uten DNAse viste en betydelig høyere prosentandel av levende celler etter isolasjon sammenlignet med Collagenase D uten DNAse.Selv sammenlignet med enten kollagenase med DNAse. I tillegg identifiserte vi nekrotiske celler med en median prosentandel på 41,0% i Collagenase E-gruppen versus 90,0% i Collagenase D-gruppen. 75,9% i Collagenase E DnAse-gruppen og 80,3% i Collagenase D DNAse-gruppen.Multi perimetrisk strømningscytometri påføres deretter MNC isolert fra CD45.2 ventil-C mottakermus på dag 7 etter å ha mottatt BMT eller enten allogene eller syngeneiske BMT-modeller. Gjennomsnittlig absolutt antall Donor CD4 positive og CD8 positive T-celler hentet fra BMT mottakerens kolon beregnes og sammenlignes. Så det kan være viktig å identifisere og / eller kvantate sjeldne immuncellepopulasjoner i slike musemodeller.Sjeldne undergrupper, inkludert donoravledede FOX-P3 positive T regulatoriske celler vurderes i både syngeneiske og allogene BMT-modeller. Ved hjelp av denne metoden kan selv sjeldne undergrupper, for eksempel donoravledet kolon T regulatoriske infiltrerende mottakermuskolon, etter BMT, analyseres. Det bør bemerkes at Collagenase E er aktiv ved 37 grader Celsius.Så alle kollagenaseløsninger bør være forvarmet for tilstrekkelig kollagenaseaktivitet og grundig slukket for å avslutte aktiviteten. Denne protokollen åpner for et stort antall mononukleære celler som kan brukes til påfølgende karakterisering av en Fleur cytometri, molekylærbiologi teknikker, mikroskopi, kultur, og stedet for blant andre. Denne protokollen ga en pålitelig vurdering av betennelse i tykktarmen av eksperimentelle versus kontrollerte mus i en benmargstransplantasjonsmodell.Dermed tilrettelegge oppdagelsen av nye regulatoriske immunmekanismer for transplantasjon toleranse. Collagenase fra Clostridium Istoliticum er en reagens som bør håndteres med laboratoriesikkerhetsteknikker. Det utgjør en helsefare ved innånding og kan forårsake hud- og øyeirritasjon.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolering, bearbeiding og analyse av Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolering av Murint Lymph Node stromale celler

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolering av Sertoli celler og Peritubular Celler fra Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...