Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) e pela Fundação Batchelor para pesquisa Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Os camundongos C57BL/6 e BALB/c utilizados neste estudo foram criados em nossas instalações ou fornecidos por Jackson Labs ou Taconic.

Todos os estudos foram conduzidos protocolos de pesquisa de roedores revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina da Universidade de Miami Miller, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela associação americana para laboratório de Zootecnia (AALAS).
1. preparação de soluções
<ol><li>
Conforme descrito na tabela 1, prepare o buffer de cólon, mídia de separação de densidade baseada em sílica 100...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Este protocolo Visual descreve métodos bem tolerados para a isolação de pilhas mononucleares Colônica que incluem linfócitos do própria do lamina (LPL). Dado que este protocolo foi otimizado na avaliação de modelos graves de colite pós-transplante de camundongo, onde citocinas inflamatórias e lesão tecidual se prestam à má viabilidade da MNC recuperada, prevemos que esses métodos podem ser traduzidos para outros aplicações que exigem a análise fenotípica do MNC relativo ao cólon. Estes incluem, mas, n?...

Embora o trato gastrointestinal (GI) é principalmente dedicado ao processamento e reabsorção de nutrientes de alimentos, o trato gastrointestinal também mantém papéis centrais na integridade dos sistemas vasculares, linfáticos e nervosos e de numerosos outros órgãos através seu sistema imunológico mucoso e submucoso1. O sistema imunológico Gi tem um papel influente na saúde gastrointestinal e sistêmica, devido à sua exposição constante a antígenos estrangeiros de alimentos, bactérias comensais ou agentes invasores1,2. Assim, o sistema imunológico gastrointestinal deve manter um equilíbrio delicado no qual tolera antígenos não patogênicos enquanto respondesse apropriadamente aos antígenos patogênicos1,2. Quando o equilíbrio de tolerância e defesa é interrompido, a desregulação imune localizada ou sistêmica e a inflamação podem ocorrer resultando em uma infinidade de doenças1,2,3.
O intestino abriga pelo menos 70% de todas as células linfóides no corpo4. A maioria de interações imunológicas preliminares envolvem pelo menos uma de três estações imunes no intestino: 1) Peyer ' remendos de s, 2) linfócitos intraepithelial (IEL) e 3) linfócitos do própria do lamina (LPL). Cada uma delas é composta por uma complexa rede interconectada de células imunes que respondem rapidamente aos desafios imunes normais no intestino5. Restrita ao estroma acima da musculatura Mucosae, a lâmina própria vagamente estruturada é o tecido conjuntivo da mucosa intestinal e inclui andaimes para o villus, a vasculatura, drenagem linfática e sistema nervoso mucoso, bem como muitos inatos e subconjuntos imunes adaptativos6,7,8,9. As LPL são compostas por células T CD4+ e CD8+ em uma proporção aproximada de 2:1, células plasmáticas e células de linhagem mielóide, incluindo células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e macrófagos6.
Há um interesse crescente em compreender o desregulação imune e a inflamação do intestino como pertence aos vários Estados da doença. Tais condições como a doença de Crohn e colite ulcerosa todos manifestam diferentes níveis de inflamação do cólon10,11,12. Adicionalmente, os pacientes com desordens malignos ou não-malignos da medula ou do sistema imune que se submetem a uma transplantação allogeneic da medula (Allo-BMT) podem desenvolver várias formas da colite que incluem 1) toxicidade direta dos regimes condicionantes antes de BMT,2) infecções causadas por imunossupressão após BMT e 3) doença do enxerto versus hospedeiro (DECH) impulsionada por células T do tipo doador reagindo a antígenos de Allo nos tecidos após o BMT13,14,15. Todas essas complicações pós-BMT resultam em alterações significativas no ambiente imunológico dos intestinos16,17,18. O método proposto permite uma avaliação confiável do acúmulo de células imunes no cólon do camundongo e, quando aplicado aos receptores murinos após a TMO, facilita um ensaio eficiente de células imunes de doadores e receptores envolvidas na tolerância ao transplante19 ,20. Causas adicionais de inflamação intestinal incluem malignidades, alergias alimentares, ou perturbação do microbioma intestinal. Este protocolo permite o acesso de pilhas mononucleares do intestino do cólon e, com modificações, aos leucócito do intestino pequeno em alguns destes modelos murino pré-clínicos.
Uma pesquisa PubMed usando os termos de pesquisa "intestino e célula imune e isolamento" revela mais de 200 publicações descrevendo métodos para a digestão do intestino delgado para extrair células imunes. Entretanto, uma busca similar da literatura para dois pontos não rende nenhuns protocolos bem delineados que especificam a isolação de pilhas imunes dos dois pontos. Isto pode ser porque o cólon tem mais camadas musculares e intersticiais, tornando-o mais difícil de digerir completamente do que o intestino delgado. Diferentemente dos protocolos existentes, este protocolo utiliza especificamente a Collagenase E de Clostridium histolyticum sem outras colagenases bacterianas (Collagenase D/Collagenase I). Nós demonstramos que, usando este protocolo, a digestão do tecido relativo ao cólon pode ser conseguida ao preservar a qualidade de pilhas imunes mononucleares isoladas do intestino (MNC) sem a adição de reagentes antiaglutonantes tais como o versenate do sódio (EDTA), Dispase II, e desoxirribonuclease i (DNase i)21,22,23. Este protocolo é aperfeiçoado para permitir a extração robusta reprodutível de MNC viável do cólon murino para uns estudos dirigidos mais adicionais e deve emprestar-se ao estudo da imunologia do cólon ou (com modificações) o intestine pequeno24, a 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

O intestino é a casa para o maior número de células imunes no corpo. A exposição da polícia intestinal de pequenos e grandes sistemas imunológicos a antígenos exógenos e modulam respostas a potentes estímulos imunológicos derivados microbialmente. Por esta razão, o intestino é um local principal alvo de desregulação imune e inflamação em muitas doenças, incluindo mas, não limitado a doenças inflamatórias intestinais, como a doença de Crohn e colite ulcerosa, doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) após o osso transplante de medula óssea (TMO) e muitas condições alérgicas e infecciosas. Os modelos murinos de inflamação e colite gastrintestinal são fortemente utilizados para estudar as complicações do GI e para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento pré-clinicamente. Os dados recolhidos destes modelos através da isolação e da análise fenotípica de pilhas imunes do intestino são críticos para uma compreensão imune mais adicional que possa ser aplicada para amenizar desordens inflamatórios gastrintestinais e sistemáticas. Este relatório descreve um protocolo altamente eficaz para a isolação de pilhas mononucleares (MNC) dos dois pontos usando uma relação sílica-baseada misturada do inclinação da densidade. Este método isola revisivelmente um número significativo de leucócito viáveis ao minimizar contaminando restos, permitindo o fenótipo imune subseqüente pela citometria do fluxo ou pelos outros métodos.

Ao trabalhar com modelos de doença de cólon murino, é útil ser capaz de quantificar e avaliar qualitativamente, entre os MNC do cólon, múltiplos subconjuntos de células imunes envolvidas no processo inflamatório. A suspensão de uma única célula de MNC obtida através da aplicação deste protocolo facilita a caracterização fenotípica de forma robusta e reprodutível. Como prova de princípio para a aplicação deste método de isolamento diversas configurações experimentai...

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Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.

Isolamento de células mononucleares de lamina propria de cólon murino usando Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

O isolamento na análise fenotípica das células imunes do intestino usando este protocolo tem se mostrado aplicável à compreensão de GI e distúrbios inflamatórios sistêmicos. Este método isola um número significativo de células mononucleares viáveis minimizando detritos contaminantes permitindo fenotipagem imunológica subsequente pela Atomistry de Fleur ou outros métodos. Como o intestino é um dos principais alvos de inflamação em muitas doenças, esse protocolo pode ser útil para o estudo de populações imunes intestinais em modelos de camundongos de câncer, alergia, transplante e autoimunidade.Para otimizar o rendimento e a eficiência deste protocolo, recomenda-se que as principais soluções e materiais sejam preparados com antecedência, como observado. Depois de eutanásia do mouse e fazer uma incisão vertical midline, use uma tesoura de dissecção fina para abrir o peritônio. Usando fórceps, mova o intestino delgado para um lado e exponha o cólon descendente.Puxe ligeiramente para cima sobre o cólon descendente para expor ao máximo a porção reta do cólon. Em seguida, corte o reto distal profundo na pélvis e disseque todo o cólon como uma unidade do reto distal até a tampa cecal. Primeiro, coloque o cólon sobre uma toalha de papel umedecido e use a extremidade cega de um par de tesouras ou fórceps para aplicar uma pressão leve na parede intestinal e extrair as fezes sólidas.Em seguida, coloque o cólon em uma placa de petri e use uma seringa de 10 mililitros com uma agulha enchada de calibre 18 para lavar o intestino com 10 mililitros de tampão de cólon resfriado. Coloque o cólon em uma placa de petri cheia de 5-10 mililitros de tampão de cólon resfriado e agitar manualmente para lavar o conteúdo colonial restante. Repita esta lavagem 2-3 vezes, usando uma nova placa de petri contendo tampão fresco para cada lavagem.Depois disso, transfira o cólon para uma nova placa de petri contendo tampão de cólon fresco refrigerado. Corte o cólon longitudinalmente de sua extremidade retal mais muscular para o cólon proximal, para gerar uma única peça retangular de cólon aberto. Descarte a mediana no prato e substitua-a por um tampão de cólon resfriado limpo.Coloque o tecido retangular do cólon sobre uma toalha de papel que é umedecido com tampão de cólon e corte-o cortando-o horizontalmente e, em seguida, em pequenos fragmentos. Use fórceps finos para coletar os fragmentos de cólon em um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros contendo 20 mililitros de tampão de cólon refrigerado. Em seguida, lave os fragmentos girando vigorosamente o tubo por 30 segundos.Após a lavagem, deixe os fragmentos de tecido se acomodarem na parte inferior do tubo antes de decantar ou aspirar o aspirador do supernadante, certificando-se de evitar perder fragmentos de tecido, repita todo esse processo de lavagem 3 vezes usando tampão de cólon fresco para cada lavagem. Para começar, adicione 20 mililitros de tampão de digestão de colagenase ao tubo contendo os fragmentos de cólon lavados. Sele o tubo e coloque-o em um agitador orbital a 37 graus Celsius com uma taxa de rotação de 2 vezes G por 60 minutos.Certifique-se de que os fragmentos de tecido estão em constante movimento durante a agitação. Primeiro, despeje 5 mililitros de 66% de mídia de separação de densidade à base de sílica em cada um dos 3 tubos de polipropileno separados de 15 mililitros. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 25 mililitros para coletar apenas o supernatante da Digestão De Colagenase 1.Filtre o supernatante através de um coador de células de tecido de filtragem de 40 microliteres pobres colocado em um tubo concético de polipropileno limpo de 50 mililitros. Encha o tubo completamente com tampão de cólon refrigerado para saciar o tampão de digestão da colagemnase. Em seguida, gire as células, aspire o supernante, e mantenha a pelota no gelo.Continue a executar a Digestão de Colagem 2 conforme descrito no protocolo de texto. Depois que a Digestão de Colagenase 2 for concluída, lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mililitros através de uma agulha final sem calibre de 18. Repita esta descarga por pelo menos 7-8 passagens, continuando até que nenhum fragmento de tecido bruto ou debri seja visível.Em seguida, passe a suspensão de desagregação do tecido através de um coador de células de tecido de filtragem de 40 micrômetros colocado em um tubo limpo de polipropileno de 50 mililitros. Encha o tubo até a borda com tampão de cólon resfriado para saciar a digestão e centrífuga a 800 vezes G em 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o supernatante através da aspiração de vácuo e puxe a pelota suspensa de Colagenase Digestion 1 para o tubo correspondente.Depois disso, suspenda cada pelota em 24 mililitros de 44% de mídia de separação de densidade baseada em sílica por cólon. Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para lentamente colocar 8 mililitros desta mídia em cada um dos 3 tubos contendo mídia de separação de densidade baseada em 66% de sílica. Equilibre cuidadosamente os tubos dentro de baldes centrífugas usando uma balança de pesar ou um equilíbrio.Centrifugar a 859 vezes G em 20 graus Celsius por 20 minutos sem o intervalo. Deixe que os roders se concluam antes de remover os tubos, tomando cuidado para não interromper as células na interface gradiente. Primeiro, visualize a interface gradiente perto da marca de 5 mililitros, onde tipicamente uma faixa branca de 1-2 mililitros de espessura está presente.Aspirar a vácuo e descartar os 7 mililitros superiores do gradiente para permitir um acesso mais fácil à pipeta à interface. Usando sucção manual contínua e movimento de pulso rotativo constante, colete a camada de interface das células. Colete até que a interface entre os dois gradientes esteja clara e refrátil e transfira a interface para um novo tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros.Em seguida, adicione o TAMPÃO FACS a esta banheira até que a suspensão total atinja 50 mililitros. Centrifugar a 800 vezes G em 4 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, aspire o supernatante via aspiração de vácuo e suspenda novamente a pelota em 1 mililitro de TAMPÃO FACS.O procedimento descrito neste vídeo pode ser usado para isolar células mononucleares do cólon ou, com modificações, do intestino delgado. Além disso, a citometria e a análise de dados são realizadas para comparar as frações de linfócitos apoptóticos e necrotóticos/mortos ao usar colagenase E ou D para o isolamento, com o nosso tratamento sem DNAse 1. Após o Anexo 5 e a coloração de corante azul morto fixável em suspensões de células únicas após cada isolamento, a Collagenase E sem DNAse mostrou uma porcentagem significativamente maior de células vivas após o isolamento quando comparada com a Colagenase D sem DNAse.Mesmo quando comparado com qualquer colagenase com DNAse. Além disso, identificamos células necróticas em um percentual mediano de 41,0% no grupo Colagenase E contra 90,0% no grupo Colagenase D. 75,9% no grupo Collagenase E DNAse e 80,3% no grupo Colagenase DNAse.A citometria de fluxo multiimétrico é então aplicada à MNC isolada de camundongos receptores de válvula CD45.2 no dia 7 após receber modelos de BMT ou BMT aogênicos ou sinagênicos. Os números absolutos médios de células T positivas do CD4 doador e CD8 extraídos do cólon do receptor de BMT são calculados e comparados. Por isso, pode ser importante identificar e/ou quantificar populações raras de células imunes nesses modelos de camundongos.Subconjuntos raros, incluindo células reguladoras T positivas FOX-P3 derivadas de doadores são avaliados em modelos de BMT síngênico e alogênico. Usando este método, até mesmo subconjuntos raros, como o cólon colonico derivado de doador, infiltrando-se no cólon do rato receptor, após o BMT, podem ser analisados. Deve-se notar que a Colagenase E está ativa a 37 graus Celsius.Assim, todas as soluções de colagenase devem ser pré-aquecidas para atividade de colagem adequada e completamente saciadas para encerrar a atividade. Este protocolo permite um grande número de células mononucleares que podem ser usadas para caracterização subsequente por uma citometria fleur, técnicas de biologia molecular, microscopia, cultura e local de, entre outros. Este protocolo forneceu uma avaliação confiável da inflamação no cólon de camundongos experimentais versus controlados em um modelo de transplante de medula óssea.Facilitando assim a descoberta de novos mecanismos imunológicos regulatórios da tolerância ao transplante. Collagenase de Clostridium Istoliticum é um reagente que deve ser tratado com técnicas de segurança de laboratório. Representa um risco para a saúde quando inalado e pode causar irritação na pele e nos olhos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Imunologia e Infecção

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Isolamento, processamento e análise de células gengivais murino

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...