Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones #1K08HL088260 y #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), y la Fundación Batchelor para la Investigación Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Los ratones C57BL/6 y BALB/c utilizados en este estudio fueron criados en nuestras instalaciones o proporcionados por Jackson Labs o Taconic.

Todos los estudios se llevaron a cabo bajo protocolos de investigación de roedores revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina Miller de la Universidad de Miami, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la Asociación Americana para Ciencias Animales de Laboratorio (AALAS).
1. Preparación de soluciones
<ol><li>
Como se describe en la Tabla 1, prepare el búfer de colon, los medios de separaci?...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Este protocolo visual describe métodos bien tolerados para el aislamiento de células mononucleares colónicas, incluidos linfocitos de lamina propria (LPL). Dado que este protocolo se optimizó en la evaluación de modelos graves de colitis de ratón post-trasplante donde las citoquinas inflamatorias y las lesiones tisulares se prestan a la mala viabilidad de la MNC recuperada, anticipamos que estos métodos pueden traducirse a otros aplicaciones que requieren análisis fenotípicos del MNC colonico. Estos incluyen per...

Aunque el tracto gastrointestinal (GI) se dedica principalmente al procesamiento y reabsorción de nutrientes de los alimentos, el tracto gastrointestinal también mantiene roles centrales en la integridad de los sistemas vascular, linfático y nervioso y de numerosos otros órganos a través de su sistema inmunológico mucoso y submucoso1. El sistema inmunitario GASTROINTESTINAL tiene un papel influyente en la salud gastrointestinal y sistémica debido a su exposición constante a antígenos extraños de alimentos, bacterias comensales o patógenos invasores1,2. Por lo tanto, el sistema inmunitario GI debe mantener un delicado equilibrio en el que tolera antígenos no patógenos, respondiendo adecuadamente a los antígenos patógenos1,2. Cuando se interrumpe el equilibrio de tolerancia y defensa, se puede localizar o sistémicamente la desregulación inmune y la inflamación, lo que resulta en una miríada de enfermedades1,2,3.
El intestino alberga al menos el 70% de todas las células linfoides del cuerpo4. La mayoría de las interacciones inmunológicas primarias involucran al menos una de las tres estaciones inmunitarias en el intestino: 1) Parches de Peyer, 2) linfocitos intraepiteliales (IEL) y 3) linfocitos de lamina propria (LPL). Cada uno de ellos se compone de una compleja red interconectada de células inmunitarias que responden rápidamente a los desafíos inmunes normales en el intestino5. Restringida al estroma por encima de las mucosas musculares, la lámina propria de estructura suelta es el tejido conectivo de la mucosa intestinal e incluye andamios para la vellosidad, la vasculatura, el drenaje linfático y el sistema nervioso de la mucosa, así como muchos innatos y subconjuntos inmunes adaptativos6,7,8,9. LPL se componen de células CD4+ y CD8+ T en una proporción aproximada de 2:1, células plasmáticas y células de linaje mieloides incluyendo, células dendríticas, células de mástil, eosinófilos y macrófagos6.
Hay un creciente interés en entender la desregulación inmune y la inflamación del intestino, ya que se refiere a varios estados de la enfermedad. Tales condiciones como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa todos manifiestan diferentes niveles de inflamación del colon10,11,12. Además, los pacientes con trastornos malignos o no malignos de la médula o del sistema inmunitario que se someten a un trasplante alogénico de médula ósea (alo-BMT) pueden desarrollar diversas formas de colitis, incluyendo 1) toxicidad directa por regímenes de acondicionamiento antes de BMT, 2) infecciones causadas por inmunosupresión después de la Enfermedad contra huésped de injerto contra huésped (EICH) impulsadapor por células T de tipo donante reaccionando a los antígenos alógenos de donantes en los tejidos después de BMT13,14,15. Todas estas complicaciones post-BMT resultan en alteraciones significativas en el ambiente inmune de los intestinos16,17,18. El método propuesto permite una evaluación fiable de la acumulación de células inmunitarias en el colon del ratón y, cuando se aplica a los receptores murinos después de la BMT, facilita un ensayo eficiente de las células inmunitarias de los donantes y receptores implicadas en la tolerancia al trasplante19 ,20. Otras causas de inflamación intestinal incluyen neoplasias malignas, alergias alimentarias o alteración del microbioma intestinal. Este protocolo permite el acceso de células mononucleares intestinales desde el colon y, con modificaciones, a leucocitos del intestino delgado en cualquiera de estos modelos murinos preclínicos.
Una búsqueda de PubMed utilizando los términos de búsqueda "intestino y aislamiento de células inmunitarias Y" revela más de 200 publicaciones que describen métodos para la digestión del intestino delgado para extraer células inmunitarias. Sin embargo, una búsqueda de literatura similar para el colon no produce protocolos bien delineados que especifican el aislamiento de las células inmunitarias del colon. Esto puede deberse a que el colon tiene más capas musculares e intersticiales, lo que hace más difícil digerir completamente que el intestino delgado. A diferencia de los protocolos existentes, este protocolo utiliza específicamente la colagenasa E de Clostridium histolyticum sin otras colagenasas bacterianas (Collagenasa D/Collagenasa I). Demostramos que, utilizando este protocolo, se puede lograr la digestión del tejido colonico preservando la calidad de las células inmunitarias mononucleares intestinales aisladas (MNC) sin la adición de reactivos anti-aglutinantes como el alfrente de sodio (EDTA), Dispase II, y desoxirribonuclea I (DNAse I)21,22,23. Este protocolo está optimizado para permitir la extracción robusta reproducible de MNC viable del colon murino para estudios más dirigidos y debe prestarse al estudio de la inmunología del colon o (con modificaciones) del intestino delgado24, 25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

El intestino es el hogar del mayor número de células inmunitarias en el cuerpo. Los sistemas inmunitarios intestinales pequeños y grandes controlan la exposición a antígenos exógenos y modulan las respuestas a potentes estímulos inmunes derivados microbianamente. Por esta razón, el intestino es un sitio objetivo importante de la desregulación inmune y la inflamación en muchas enfermedades, incluyendo pero, no limitado a enfermedades inflamatorias intestinales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, enfermedad injerto-versus-huésped (GVHD) después de hueso hueso trasplante de médula (BMT), y muchas afecciones alérgicas e infecciosas. Los modelos murinos de inflamación gastrointestinal y colitis se utilizan en gran medida para estudiar las complicaciones gastrointestinales y para optimizar previamente las estrategias para la prevención y el tratamiento. Los datos obtenidos de estos modelos a través del aislamiento y el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino son fundamentales para una mayor comprensión inmune que se puede aplicar para mejorar los trastornos inflamatorios gastrointestinales y sistémicos. Este informe describe un protocolo altamente eficaz para el aislamiento de células mononucleares (MNC) del colon utilizando una interfaz de gradiente de densidad basada en sílice mixta. Este método aísla reproduciblemente a un número significativo de leucocitos viables al tiempo que minimiza los desechos contaminantes, permitiendo el fenotipado inmune posterior por citometría de flujo u otros métodos.

Cuando se trabaja con modelos de enfermedad de colon murino, es útil ser capaz de cuantificar y evaluar cualitativamente, entre el MNC del colon, múltiples subconjuntos de células inmunitarias implicados en el proceso inflamatorio. La suspensión de una sola célula de MNC obtenida a través de la aplicación de este protocolo facilita dicha caracterización fenotípica de una manera robusta y reproducible. Como prueba de principio para la aplicación de este método de aislamiento baj...

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Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

El aislamiento en el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino utilizando este protocolo ha demostrado ser aplicable a la comprensión de los trastornos inflamatorios sistémicos y gastrointestinales. Este método aísla un número significativo de células mononucleares viables al minimizar los desechos contaminantes permitiendo el posterior fenotipado inmune por la Atomistry de Fleur u otros métodos. Como el intestino es un sitio objetivo principal de inflamación en muchas enfermedades, este protocolo puede ser útil para el estudio de poblaciones inmunes intestinales en modelos de ratón de cáncer, alergia, trasplante y autoinmunidad.Para optimizar el rendimiento y la eficiencia de este protocolo, se recomienda que las soluciones y materiales clave se preparen con antelación como se ha señalado. Después de eutanasiar el ratón y hacer una incisión vertical de línea media, utilice tijeras de disección fina para abrir el peritoneo. Usando fórceps, mueva el intestino delgado a un lado y exponga el colon descendente.Tire hacia arriba ligeramente sobre el colon descendente para exponer al máximo la porción rectal del colon. Luego, corta el recto distal en lo profundo de la pelvis y disecciona todo el colon como una unidad desde el recto distal hasta la tapa del cecal. Primero, coloca el colon sobre una toalla de papel humedecida y usa el extremo romo de un par de tijeras o fórceps para aplicar una presión leve en la pared intestinal y extraer las heces sólidas.A continuación, coloque el colon en una placa de petri y use una jeringa de 10 mililitros con una aguja llena de contundentes de calibre 18 para lavar el intestino con 10 mililitros de tampón de colon refrigerado. Coloque el colon en un plato de petri lleno de 5-10 mililitros de tampón de colon refrigerado y agitar manualmente para lavar el contenido de colon restante. Repita este lavado de 2 a 3 veces, utilizando una nueva placa de petri que contenga tampón fresco para cada lavado.Después de esto, transfiera el colon a una nueva placa de petri que contenga tampón de colon frío fresco. Corte el colon longitudinalmente desde su extremo rectal más musculoso hasta el colon proximal, para generar una sola pieza rectangular de colon abierta. Deseche la mediana en el plato y reemplácela con un tampón de colon frío limpio.Coloque el tejido rectangular del colon sobre una toalla de papel que esté humedecida con tampón de colon y córtelo cortando horizontalmente y luego en pequeños fragmentos. Utilice fórceps finos para recoger los fragmentos de colon en un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de tampón de colon refrigerado. A continuación, lave los fragmentos girando vigorosamente el tubo durante 30 segundos.Después del lavado, deje que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo antes de decantar o aspirar al vacío el sobrenadante, Asegurándose de evitar la pérdida de fragmentos de tejido, repita todo este proceso de lavado 3 veces usando tampón de colon fresco para cada lavado. Para comenzar, agregue 20 mililitros de tampón de digestión de colagenasa al tubo que contiene los fragmentos de colon lavados. Selle el tubo y colóquelo en un agitador orbital a 37 grados celsius con una velocidad de rotación de 2 veces G durante 60 minutos.Asegúrese de que los fragmentos de tejido estén en constante movimiento durante la agitación. En primer lugar, vierta 5 mililitros de medios de separación de densidad basados en sílice al 66% en cada uno de 3 tubos de polipropileno separados de 15 mililitros. A continuación, utilice una pipeta serológica de 25 mililitros para recoger sólo el sobrenadante de la digestión de colagenasa 1.Filtrar el sobrenadante a través de un colador de células de tejido de filtración deficiente de 40 microlitros colocado en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 mililitros. Llene el tubo completamente con tampón de colon frío para apagar el tampón de digestión de colagenasa. Luego gira las células, aspira el sobrenadante, y mantén el pellet en hielo.Continúe realizando la digestión de la colagenasa 2 como se describe en el protocolo de texto. Una vez completada la digestión de la colagenasa 2, enjuague los fragmentos de tejido vigorosamente hacia adelante y hacia atrás entre el tubo y una jeringa de 10 mililitros a través de una aguja de extremo romo de calibre 18. Repita este rubor durante al menos 7-8 pasajes, continuando hasta que no se visiblen fragmentos de tejido bruto o debri.A continuación, pase la suspensión de desagregación de tejido a través de un colador celular de tejido de filtración deficiente de 40 micrómetros colocado en un tubo de polipropileno limpio de 50 mililitros. Llene el tubo hasta el borde con tampón de colon frío para saciar la digestión y centrifugar a 800 veces G en 4 grados Celsius durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío y tire del pellet re suspendido de la digestión de la colagenasa 1 a su tubo correspondiente.Después de esto, vuelva a suspender cada pellet en 24 mililitros de medios de separación de densidad basados en 44%sílice por colon. Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para colocar lentamente 8 mililitros de este medio en cada uno de los 3 tubos que contienen 66%medios de separación de densidad basados en sílice. Equilibre cuidadosamente los tubos dentro de los cubos centrífugos con una báscula de pesaje o una balanza.Centrifugar a 859 veces G en 20 grados Celsius durante 20 minutos sin el descanso. Deje que las varillas vengan a descansar antes de retirar los tubos, teniendo cuidado de no interrumpir las células en la interfaz de gradiente. En primer lugar, visualice la interfaz de gradiente cerca de la marca de 5 mililitros, donde normalmente está presente una banda blanca de 1-2 mililitros de espesor.Aspirar al vacío y desechar los 7 mililitros superiores del gradiente para facilitar el acceso de la pipeta a la interfaz. Usando la succión manual continua y el movimiento constante de la muñeca giratoria, recoja la capa de interfaz de las células. Recoger hasta que la interfaz entre los dos gradientes sea clara y refractista y transferir la interfaz a un nuevo tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros.A continuación, agregue FACS Buffer a esta bañera hasta que la suspensión total alcance los 50 mililitros. Centrifugar a 800 veces G en 4 grados Celsius durante 5 minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante a través de la aspiración al vacío y suspender el pellet en 1 mililitro de FACS Buffer.El procedimiento descrito en este video se puede utilizar para aislar células mononucleares del colon o, con modificaciones, del intestino delgado. Además, se realiza citometría y análisis de datos para comparar las fracciones de linfocitos apoptóticos y necróticos/muertos cuando se utiliza la Collagenasa E o D para el aislamiento, con nuestro sin tratamiento DNAse 1. Después de la suposición 5 y la tinción fijable de colorante azul muerto vivo en suspensiones de una sola célula después de cada aislamiento, la collagenasa E sin DNAse mostró un porcentaje significativamente mayor de células vivas después del aislamiento en comparación con la colagenasa D sin DNAse.Incluso en comparación con cualquiera de las colagenasas con DNAse. Además, identificamos células necróticas en un porcentaje medio del 41,0% en el grupo Collagenase E frente al 90,0% en el grupo Collagenase D. 75,9% en el grupo Collagenase E DNAse y 80,3% en el grupo Collagenase D DNAse.A continuación, la citometría de flujo perimétrico múltiple se aplica a MNC aislado de ratones receptores de válvula CD45.2 C el día 7 después de recibir BMT o modelos BMT alogénicos o singéneos. Se calculan y comparan los números absolutos medios de células T positivas CD4 del donante y CD8 positivas extraídas del colon del receptor BMT. Por lo tanto, puede ser importante identificar y/o cuantificar poblaciones raras de células inmunitarias en estos modelos de ratón.Los subconjuntos raros, incluidas las células reguladoras T positivas FOX-P3 derivadas del donante, se evalúan en modelos BMT singéneos y alogénicos. Usando este método, incluso se pueden analizar subconjuntos raros, como el regulador del T del colon derivado del donante que se infiltra en el colon del ratón receptor, después de BMT. Cabe señalar que la collagenasa E está activa a 37 grados centígrados.Por lo tanto, todas las soluciones de colagenasa deben ser precaleadas para una actividad adecuada de la colagenasa y completamente apretadas para terminar la actividad. Este protocolo permite un gran número de células mononucleares que se pueden utilizar para la posterior caracterización por una citometría Fleur, técnicas de biología molecular, microscopía, cultivo, y sitio de, entre otros. Este protocolo proporcionó una evaluación confiable de la inflamación en el colon de ratones experimentales frente a ratones controlados en un modelo de trasplante de médula ósea.Facilitando así el descubrimiento de nuevos mecanismos inmunológicos reglamentarios de tolerancia a trasplantes. La colagenasa de Clostridium Istoliticum es un reactivo que debe manipularse con técnicas de seguridad de laboratorio. Supone un riesgo para la salud cuando se inhala y puede causar irritación de la piel y los ojos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Investigación

Inmunología e Infección

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

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The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

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