Name: isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Bu çalışma #1K08HL088260 ve #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ve Batchelor Pediatrik Araştırmalar Vakfı (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan C57BL/6 ve BALB/c fareleri ya tesisimizde yetiştirildi ya da Jackson Labs veya Taconic tarafından sağlandı.

Tüm çalışmalar, Amerikan Derneği tarafından belirlenen veterinerlik standartlarını karşılayan Miami Miller Tıp Fakültesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan kemirgen araştırma protokolleri kapsamında yürütülmüştür. Laboratuvar Hayvan Bilimi (AALAS) için.
1. Çözümlerin Hazırlanması
<ol><li>
Tablo 1'de açıklandığı gibi, Kolon Tamponu, Silika Tabanlı Yoğunluk Ayırma Ortamı %100, Silika Tabanlı Y...

<ol>
	<li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+physiology+and+functions.">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li><li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract.">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li><li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+intestinal+tract:+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut.">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+T+Cells+from+the+Gut.">Isolation of T Cells from the Gut.</a> T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System.">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria.">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li><li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity.">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li><li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+Bowel+Syndrome.">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li><li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+Disease+of+the+Colon,+Rectum,+and+Anus.">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li><li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulcerative+Colitis.">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li><li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+an+update.">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li><li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li><li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation.">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li><li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation.">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li><li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children.">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li><li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease:+Mechanisms+and+Management.">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li><li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+&#946;-thalassemia.">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine &#946;-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li><li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation.">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System.">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).</li><li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue.">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li><li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells.">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li><li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine.">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa.">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity,+Structures,+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases.">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li><li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease.">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li><li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+collagenases+-+A+review.">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li><li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function.">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis.">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>van der Heijden, P. j., Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine.">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li></ol>

Bu görsel protokol lamina propria lenfositler de dahil olmak üzere kolon mononükleer hücrelerin izolasyon için iyi tolere yöntemleri açıklar (LPL). Bu protokol, inflamatuar sitokinlerin ve doku yaralanmalarının kurtarılan MNC'nin yetersiz canlılığına katkıda bulunduğu ciddi nakil sonrası fare kolit modellerinin değerlendirilmesinde optimize edildiği göz önüne alındığında, bu yöntemlerin diğer kolon MNC'nin henotik analizini gerektiren uygulamalar. Bunlar arasında inflamatuar barsak hastalı?...

Gastrointestinal (GI) yolu öncelikle gıda besin işleme ve reabsorbsiyon adanmış olmasına rağmen, GI sistemi de vasküler bütünlüğü merkezi rolleri korur, lenfatik, ve sinir sistemleri ve çok sayıda diğer organların aracılığıyla mukozal ve submukozal bağışıklık sistemi1. GI bağışıklık sistemi gıda yabancı antijenlere sürekli maruz kalma nedeniyle hem gastrointestinal ve sistemik sağlık etkili bir role sahiptir, kommensal bakteriler, ya da işgal patojenler1,2. Böylece, GI bağışıklık sistemi patojenik antijenler uygun yanıt verirken patojenik olmayan antijenler tolere hangi hassas bir denge korumak gerekir1,2. Tolerans ve savunma dengesi bozulduğunda, lokalize veya sistemik immün disregülasyon ve inflamasyon hastalıkların sayısız neden oluşabilir1,2,3.
Bağırsak, vücuttaki tüm lenfoid hücrelerin en az %70'ini barındırır4. En primer immünolojik etkileşimler bağırsakta üç bağışıklık istasyonlarıen en az birini içerir: 1) Peyer's Patches, 2) İntraepitelyal lenfositler (IEL) ve 3) lamina propria lenfositler (LPL). Bunların her biri hızlabağırsak5 normal bağışıklık sorunlarına yanıt bağışıklık hücrelerinin karmaşık bir birbirine bağlı ağ oluşur . Muscularis mukoza üzerinde stroma sınırlı, gevşek yapılandırılmış lamina propria bağırsak mukozasının bağ dokusu ve villus için iskele içerir, vaskülatür, lenfatik drenaj, ve mukozal sinir sistemi, yanı sıra birçok doğuştan ve adaptif bağışıklık alt kümeleri6,7,8,9. LPL 2:1 yaklaşık oranda CD4+ ve CD8+ T hücrelerinden, plazma hücreleri ve miyeloid soy hücreleri, dendritik hücreler, mast hücreleri, eozinofiller ve makrofajlar6dahil olmak üzere oluşur.
Çeşitli hastalık durumları ile ilgili olarak bağışıklık disregülasyonu ve bağırsak iltihabı anlamada artan bir ilgi vardır. Crohn hastalığı ve ülseratif kolit gibi koşullar tüm kolonik inflamasyon10,11,12değişen düzeylerde tezahür . Ayrıca, allojenik kemik iliği nakli (allo-BMT) geçiren ilik veya bağışıklık sisteminin malign veya malign olmayan bozuklukları olan hastalar, klima rejimlerinden doğrudan toksisite dahil olmak üzere çeşitli kolit formları gelişebilir. BMT önce, 2) BMT ve 3 sonra immünsupresyon neden enfeksiyonları) greft-versus-host hastalığı (GVHD) BMT sonra dokularda donör allo-antijenlere tepki donör tipi T hücreleri tarafından tahrik13,14,15. Tüm bu post-BmT komplikasyonları bağırsakların bağışıklık ortamında önemli değişikliklere neden16,17,18. Önerilen yöntem fare kolon bağışıklık hücre birikiminin güvenilir bir değerlendirme sağlar ve, BMT sonra murin alıcılara uygulandığında, organ toleransı dahil hem donör ve alıcı bağışıklık hücreleri etkili bir tahsin kolaylaştırır19 ,20. Bağırsak iltihabı ek nedenleri maligniteler dahil, gıda alerjileri, ya da bağırsak mikrobiyom bozulması. Bu protokol kolon dan bağırsak mononükleer hücrelerin inerişimini sağlar ve değişiklikler ile, bu preklinik murine modellerinin herhangi bir ince bağırsak lökositler için.
"Bağırsak ve bağışıklık hücresi VE izolasyon" arama terimlerini kullanarak bir PubMed arama bağışıklık hücreleri ayıklamak için ince bağırsak sindirim yöntemleri açıklayan 200'den fazla yayınlar ortaya koymaktadır. Ancak, kolon için benzer bir literatür arama kolon bağışıklık hücrelerinin izolasyon belirten iyi kalibre protokolleri verir. Kolon daha kas ve interstisyel tabakaları vardır, çünkü bu daha zor tamamen ince bağırsak daha sindirimi için render olabilir. Mevcut protokollerin aksine, bu protokol özellikle diğer bakteriyel kollajenazlar olmadan Clostridium histolyticum kollajenaz E kullanır (Kollajenaz D / Kollajenaz I). Bu protokol kullanılarak, izole bağırsak mononükleer bağışıklık hücrelerinin (MNC) kalitesini koruyarak, sodyum versenaton (EDTA), Dispase II ve deoksiribonuklease I (DNAse I)21,22,23. Bu protokol daha fazla yönlendirilmiş çalışmalar için murine kolon canlı MNC tekrarlanabilir sağlam çıkarma sağlamak için optimize edilmiş ve kolon immünoloji sinması çalışmasına kendini ödünç vermelidir veya (modifikasyonlar ile) ince bağırsak24, 25. yıl.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>60 mm Petri DIsh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>BW17-517Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL Non-Sterile Conical Tubes</td>
			<td>TruLine</td>
			<td>TR2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18- gauge Blunt Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micrometer pore size Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M Sterile Solution</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E177-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo /Fisher Scientific -HyCLone</td>
			<td>SV30014.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare-HyClone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare-Life Sciences</td>
			<td>1708901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR Life Science Amresco</td>
			<td>97064-646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e

Bağırsak vücutta bağışıklık hücrelerinin en çok sayıda ev sahipliği yapmaktadır. Küçük ve kalın bağırsak bağışıklık sistemleri polis eksojen antijenlere maruz kalma ve güçlü mikrobiyal türetilmiş bağışıklık uyaranları yanıtları modüle. Bu nedenle bağırsak, crohn hastalığı ve ülseratif kolit, kemik sonrası greft-versus-host hastalığı (GVHD) gibi inflamatuar barsak hastalıkları ile sınırlı olmamak üzere birçok hastalıkta immün disregülasyon ve iltihabın önemli bir hedef alanıdır. ilik nakli (BmT) ve birçok alerjik ve enfeksiyöz durum. Gastrointestinal inflamasyon ve kolit Murine modelleri yoğun GI komplikasyonları çalışma ve ön klinik önleme ve tedavi için stratejiler optimize etmek için kullanılır. Bağırsaktan bağışıklık hücrelerinin izolasyon ve henotipik analizi ile bu modellerden toplanan veriler, gastrointestinal ve sistemik inflamatuar hastalıkların iyileştirilmesiiçin uygulanabilecek daha fazla bağışıklık anlayışı için önemlidir. Bu rapor, karışık silika bazlı yoğunluk gradyan arabirimi kullanarak kolondan mononükleer hücrelerin (MNC) izolasyonu için son derece etkili bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntem, önemli sayıda canlı lökositi izole ederken, enkazı kirleten enkazı en aza indirir, akış sitometrisi veya diğer yöntemlerle sonraki immün fenotitiplemesağlar.

Minür kolon hastalığı modelleri ile çalışırken, hem nicel ve nitel değerlendirmek edebilmek için yararlıdır, kolon MNC arasında, inflamatuar süreçte yer alan birden fazla bağışıklık hücresi alt kümeleri. Bu protokolün uygulanması ile elde edilen MNC'nin tek hücreli süspansiyonu, bu tür henotypik karakterizasyonu sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde kolaylaştırır. Bu izolasyon yönteminin farklı deneysel ayarlar altında uygulanması için bir ilke kanıt?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E at JoVE.com

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

Bu protokolün amacı kollajenaz kullanarak dokunun enzimatik sindirimi ile kolon lamina propria bulunan mononükleer hücreleri izole etmektir. Bu protokol, mononükleer hücrelerin verimli bir şekilde izolasyonuna olanak sağlar ve bu da sağlam immünhenototipleme için kullanılabilir tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanır.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bu protokol kullanılarak bağırsaktan bağışıklık hücrelerinin henotipik analizinde izolasyon GI ve sistemik inflamatuar bozuklukların anlaşılması için geçerli olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem Fleur's Atomistry veya diğer yöntemlerle sonraki immün fenotipleme sağlayan kirletici enkaz en aza indirerek canlı mononükleer hücrelerin önemli sayıda izole eder. Bağırsak birçok hastalıkta iltihabın önemli bir hedef alanı olduğundan, bu protokol kanser, alerji, transplantasyon ve otoimmünite fare modellerinde bağırsak bağışıklık popülasyonlarının incelenmesi için yararlı olabilir.Bu protokolün verimini ve verimliliğini optimize etmek için, önemli çözümlerin ve malzemelerin önceden hazırlanması tavsiye edilir. Fare ötenazi ve dikey bir orta hat kesi yaptıktan sonra, periton açmak için ince diseksiyon makas kullanın. Forceps kullanarak, bir tarafa ince bağırsak hareket ve azalan kolon ortaya çıkarmak.Kolon rektal kısmını maksimum maruz bırakmak için azalan kolon üzerinde hafifçe yukarı çekin. Daha sonra, pelvis derin distal rektum kesmek ve sekal kap distal rektum bir birim olarak tüm kolon incelemek. İlk olarak, nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerinde kolon yerleştirin ve bağırsak duvarına hafif basınç uygulamak ve katı dışkı ayıklamak makas veya forceps bir çift künt ucunu kullanın.Sonra, bir petri kabında kolon yerleştirin ve soğutulmuş kolon tampon 10 mililitre ile bağırsak floş için 18-gauge künt dolgulu iğne ile 10 mililitreşli şırınga kullanın. Bir petri kabına bir petri kabına yerleştirin 5-10 soğutulmuş kolon tampon mililitre ve kalan kolon içeriğini yıkamak için elle ajite. Her yıkama için taze tampon içeren yeni bir petri kabı kullanarak bu yıkamayı 2-3 kez tekrarlayın.Bundan sonra, taze soğutulmuş kolon tampon içeren yeni bir petri kabına kolon aktarın. Tek bir dikdörtgen açık kolon parçası oluşturmak için, proksimal kolon için daha kasrekrek sonundan uzunlamasına kolon kesin. Çanak ortanca atın ve temiz soğutulmuş kolon tampon ile değiştirin.Kolon tampon ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu üzerine dikdörtgen kolon doku yerleştirin ve yatay ve daha sonra küçük parçalar halinde dilimleyerek kesti. Soğutulmuş kolon tampon 20 mililitre içeren 50 mililitrelik polipropilen konik tüp içine kolon parçaları toplamak için ince forceps kullanın. Daha sonra, 30 saniye boyunca güçlü bir şekilde tüpü döndürerek parçaları yıkayın.Yıkamadan sonra, doku parçaları decanting veya vakum supernatant aspirating önce tüpün altına yerleşmek izin, Doku parçaları kaybetmeönlemek için emin olun, her yıkama için taze kolon tampon kullanarak bu tüm yıkama işlemini 3 kez tekrarlayın. Başlamak için, yıkanmış kolon parçaları içeren tüp kollajenaz sindirim tampon 20 mililitre ekleyin. Tüpü kapatın ve 60 dakika boyunca 2 kez G dönüş hızı ile 37 santigrat derecede bir yörünge shaker yerleştirin.Ajitasyon sırasında doku parçalarının sürekli hareket halinde olduğundan emin olun. İlk olarak, 3 ayrı 15 mililitre polipropilen tüplerin her içine% 66 silika bazlı yoğunluk ayırma medya 5 mililitre dökün. Sonra, Kollajenaz Sindirim 1 sadece supernatant toplamak için 25 mililitre serolojik pipet kullanın.Temiz bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüp içine yerleştirilen 40 mikrolitre zayıf filtrasyon kumaş hücresüzlük süzgeç ile supernatant filtre. Kollajenaz sindirim tampon uğrama için soğutulmuş kolon tampon ile tüp tamamen doldurun. Sonra hücreleri döndürün, süpernatant aspire, ve buz üzerinde pelet tutmak.Metin protokolünde belirtildiği gibi Kollajenaz Sindirim 2 gerçekleştirmeye devam edin. Kollajenaz Sindirim 2 tamamlandıktan sonra, 18-gauge künt uç iğne ile tüp ve 10 mililitreşli şırınga arasında şiddetle ileri ve geri doku parçaları floş. En az 7-8 pasajlar için bu floş tekrarlayın, hiçbir brüt doku parçaları veya enkaz görünür kadar devam.Daha sonra, temiz bir 50 mililitrelik polipropilen tüp içine yerleştirilen 40 mikrometre zayıf filtrasyon kumaş hücresüzlük süzgeç yoluyla doku ayrıştırma süspansiyon geçmek. 5 dakika boyunca 4 santigrat derecede 800 kez G de sindirim ve santrifüj söndürmek için soğutulmuş kolon tampon ile kenarına tüp doldurun. Vakum aspirasyon yoluyla supernatant atın ve ilgili tüp kollajenaz Sindirim 1 re askıya pelet çekin.Bundan sonra, kolon başına% 44 silika bazlı yoğunluk ayırma medya 24 mililitre her pelet askıya. %66 silika bazlı yoğunluk ayırma ortamı içeren 3 tüpün her birine bu ortamın 8 mililitresini yavaşça katmanlamak için 10 mililitrelik serolojik pipet kullanın. Bir tartma terazisi veya bir denge kullanarak santrifüj kovaları içindeki tüpleri dikkatlice dengeleyin.Santrifüj 859 kez G 20 santigrat derece de 20 dakika ara vermeden. Degrade arabirimindeki hücreleri bozmamaya özen tarak, tüpleri çıkarmadan önce roders dinlenmek için gelmek için izin verin. İlk olarak, genellikle 1-2 mililitre kalınlığında beyaz bant mevcut olan 5 mililitrelik işareti, yakın degrade arayüzü görselleştirin.Vakum aspire ve arayüze daha kolay pipet erişim sağlamak için degrade üst 7 mililitre atın. Sürekli manuel emme ve sürekli dönen bilek hareketi kullanarak, hücrelerin arayüz katmanını toplayın. İki degrade arasındaki arayüz açık olana ve refractile olana kadar toplayın ve arayüzü yeni bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe aktarın.Ardından, toplam süspansiyon 50 mililitreye ulaşana kadar bu küvete FACS Tampon ekleyin. Santrifüj 800 kez G 4 santigrat derecede 5 dakika. Daha sonra, vakum aspirasyon yoluyla supernatant aspire ve FACS Tampon 1 mililitre pelet askıya.Bu videoda açıklanan prosedür kolon mononükleer hücreleri izole etmek için kullanılabilir veya, değişiklikler ile, ince bağırsak. Ayrıca, izolasyon için Kollajenaz E veya D kullanırken apoptotik ve nekrotik/ölü lenfositlerin fraksiyonlarını karşılaştırmak için sitometri ve veri analizi yapılır, dnase olmadan 1 tedavi. Annexin 5 ve her izolasyon dan sonra tek hücreli süspansiyonlar üzerinde düzeltilebilir canlı ölü mavi boya boyama aşağıdaki, DNAE olmadan Kollajenaz E dnaase olmadan Kollajenaz D ile karşılaştırıldığında izolasyon sonrası canlı hücrelerin önemli ölçüde daha yüksek bir yüzdesi gösterdi.Hatta dnase ile ya kollajenaz ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, Kollajenaz E grubunda %41.0 ortanca yüzdesinde nekrotik hücreler saptandı, Kollajenaz D grubunda ise %90.0. Kollajenaz E DNaase grubunda %75.9 ve Kollajenaz D DNae grubunda %80.3.Multi perimetrik akış sitometrisi, BMT veya allojenik veya syngeneic BmT modellerini aldıktan sonra 7. BmT alıcının kolon çıkarılan Donör CD4 pozitif ve CD8 pozitif T-hücrelerinin ortalama mutlak numaraları hesaplanır ve karşılaştırılır. Bu nedenle bu tür fare modellerinde nadir bulunan bağışıklık hücre popülasyonlarını belirlemek ve/veya quantitate etmek önemli olabilir.Donör kaynaklı FOX-P3 pozitif T düzenleyici hücreleri de dahil olmak üzere nadir alt kümeler hem syngeneic hem de allojenik BmT modellerinde değerlendirilir. Bu yöntem kullanılarak, bmt'den sonra alıcı fare kolonuna sızan donör türetilmiş kolon T düzenleyicisi gibi nadir alt kümeler bile analiz edilebilir. Bu Kollajenaz E 37 santigrat derece aktif olduğu unutulmamalıdır.Yani tüm kollajenaz çözeltileri yeterli kollajenaz aktivitesi için önceden ısıtılmış ve iyice aktiviteyi sona erdirmek için söndürdün olmalıdır. Bu protokol, fleur sitometri, moleküler biyoloji teknikleri, mikroskopi, kültür ve diğerleri arasında daha sonraki karakterizasyonu için kullanılabilecek mononükleer hücrelerin çok sayıda sağlar. Bu protokol, kemik iliği nakli modelinde deneysel ve kontrollü farelerin kolondaki iltihabın güvenilir bir değerlendirmesini sağlamıştır.Böylece organ nakli toleransı yeni düzenleyici bağışıklık mekanizmalarının keşfini kolaylaştırıyor. Clostridium Istoliticum kollajenaz laboratuvar güvenlik teknikleri ile ele alınması gereken bir reaktif olduğunu. Solunduğunda sağlık açısından tehlike oluşturur ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...