Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
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我们感谢李爱丽和本诺精工的技术援助。我们还要感谢渡边昭一女士提供行政援助,感谢彼得·卡拉吉安尼斯博士编辑了这份文件。这项工作得到了日本医学研究和发展机构(AMED)(M.K.S.)的再生医学实现研究中心网络iPS细胞研究中心的核心支持。利用。AMED (17935423) [M.K.S.] 和日本科学技术厅创新中心项目 (R.O. 和 M.K.S.) 的特异性 iPS 细胞。

1. 试剂
<ol><li>细胞系(人类PSCs):获得胚胎干细胞(ESCs)或iPSC系409B2和201B7(317-9)和CBA11。</li>
	<li>
试剂制备
	<ol>
<li>PSC 电镀介质:将 PSC 维护介质与 10 μM Y-27632 混合,并储存在 4°C 下。</li>
		<li>PSC 类球形切片介质:在使用前将 PSC 维护介质与 625*1,250 纳克/mL 人体重组拉米宁-511 E8 片段(LM511-E8)(取决于细胞系)混合。 注:LM511-E8 可在介质15中混合。其他基质,如全长拉米宁-511需要预涂,即使这样做,它们也不会维持在分化过程中粘附的中皮器官。</li>
		<li>第 0 天分化介质:将美生皮基础培养基与 2 μM CHIR99021、80 纳克/mL骨形态遗传蛋白 4 (BMP4) 和 80 纳克/mL 血管内皮生长因子 (VEGF) 混合。</li>
		<li>第2天分化介质:将造血基基培养基与1μM SB431542、80纳克/mL VEGF和100纳克/mL干细胞因子(SCF)混合。</li>
		<li>在没有钙或镁的情况下制备磷酸盐缓冲盐(PBS)(参见材料表)。</li>
		<li>1 mM 乙烯二甲酸 (EDTA) 缓冲液:将 1 mL 的 0.5 m EDTA 添加到 500 mL 的 PBS 中。</li>
		<li>EHT介质:将血泊基基介质与50纳克/mL SCF、20纳克/mL血栓形成素(TPO)、50纳克/mL Fms相关的酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、20纳克/mL白细胞介素-6/英莱金-6受体(α(IL-6/IL-IL-6R)混合使用。胰岛素转移-硒-乙醇胺、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素/氨热素B。</li>
		<li>FACS缓冲液:将PBS与2%的胎儿小牛血清和1 mM EDTA混合。</li>
		<li>准备磁分离缓冲器(见材料表)。</li>
		<li>制备甲基纤维素基培养基(见材料表)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSC殖民地形成
<ol><li>在 mTeSR1 中,在 mTeSR1 中,在具有5% CO2的培养箱中将 hPSC 增长至 70 ± 80% 的汇合。</li>
	<li>
PSC 分离(第 4 天)
	<ol>
<li>吸出介质,用PBS清洗细胞两次。用解散溶液冲洗细胞。在37°C孵育15分钟(细胞在此期间不会干燥)。</li>
		<li>将细胞悬浮在PSC维护介质中,将悬浮液转移到适当大小的管中,并在200 x g下离心3分钟。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将PSC悬浮液以48,000~70,000个细胞cm-2(取决于细胞系)的密度镀在微造塑料容器上,并在37°C培养箱中孵育过夜,CO2为5%。 注:我们建议在96孔微制塑料容器中100μL孔-1的细胞悬浮液。你通常会在96孔的盘子里播种20,000个细胞-1,以产生大约100个球体。</li>
	<li>
平铺 PSC 球形LM511-E8(第-3天)
	<ol>
<li>使用 P1000 微管轻轻移液,将 PSC 球体收集到 15 mL 锥形管中,让球体在室温下站立 2 分钟,以重力沉淀。吸气上清液。</li>
		<li>悬浮在球形电镀介质中,将悬浮液放入密度为4球体厘米-2的非涂层6孔培养板中,在37°C培养箱中培养5%CO2三天。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 造血诱导(第0天)
<ol><li>吸气介质,在37°C培养箱中加入Day0分化介质和培养,5%O2和5%CO2(缺氧培养箱)。</li>
	<li>在Day0分化介质中经过两天的培养,吸出介质,然后在缺氧培养箱中加入Day2分化介质和文化。</li>
</ol>4. 血原内皮分离(第4天)
<ol><li>两天后,吸气中,用PBS清洗细胞两次。用解散溶液冲洗细胞。在 37°C 培养箱中孵育,用 5% CO2孵育 30 分钟。</li>
	<li>轻轻悬浮1 mM EDTA中的细胞,使其分离到单细胞水平,将悬浮液转移到50 mL锥形管中,并在200 x g下离心细胞3分钟。缓冲区。</li>
	<li>加入100 μL的CD34+微珠,轻轻移液。在室温下孵育30分钟。每100μL CD34+珠子可使用多达2000万个细胞。</li>
	<li>通过 40 μm 细胞过滤器过滤悬浮液。</li>
	<li>使用磁性分离器分离 CD34+细胞。</li>
</ol>5. 内皮到造血转化的诱导
<ol><li>
纤维内丁涂层
	<ol>
<li>通过在PBS中稀释1mg/mL纤维化剂,制备所需的5μg/mL纤维化涂层溶液。</li>
		<li>将 0.5 mL 的涂层溶液分配到 24 孔培养板的每个孔中。在室温下孵育板30分钟。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在200 x g下将分类的CD34+细胞离心3分钟,将细胞颗粒悬浮在1 mL的EHT培养基中。</li>
	<li>使用细胞计数器确定可行的细胞密度。通过添加 EHT 培养基将细胞密度调整到 200,000 个细胞 mL-1。</li>
	<li>吸气并丢弃纤维内膜涂层良好的涂层溶液。将 0.5 mL 的 CD34+细胞悬浮液放入每个纤维素涂层孔中。</li>
	<li>在缺氧培养箱中孵育一周。</li>
</ol>6. 造血细胞的流细胞测定分析
<ol><li>
浮动单元格集合:将培养基转移到15 mL锥形管中。在200 x g下离心介质3分钟。吸气上清液。</li>
	<li>
坚持单元格集合
	<ol>
<li>用0.5 mL的PBS清洗细胞两次。</li>
		<li>用分离溶液冲洗细胞,吸出多余的液体。</li>
		<li>在37°C培养箱中孵育板5分钟。</li>
		<li>在 1 mL 的 FACS 缓冲区中重新悬浮细胞。</li>
	</ol>
</li>
	<li>混合浮动细胞和附着细胞。</li>
	<li>在200 x g下使细胞离心3分钟。吸气上清液。在 50 μL 的 FACS 缓冲器中重新悬浮。在黑暗中,用抗CD34和抗CD45抗体孵育细胞1小时。</li>
	<li>用PBS清洗细胞两次,在200 x g下离心3分钟。吸气下清液,用0.5 μg/mL 4',6-二酰胺-2-苯林醇重新悬浮在0.5 mL的FACS缓冲液中。</li>
	<li>通过流量细胞计测量 CD34 和 CD45 表达式。</li>
</ol>7. 细胞形成单元(CFU)血细胞测定
<ol><li>
造血细胞集合:将培养基从培养体转移到 15 mL 锥形管。用 PBS 轻轻冲洗井两次。</li>
	<li>在200 x g下使细胞离心3分钟。吸气上清液。在 1 mL 的 EHT 介质中重新悬浮。使用单元格计数器确定单元格编号。</li>
	<li>将相当于10,000个细胞的悬浮量添加到3 mL的甲基纤维素基培养基中,辅以抗生素,并与16G或18 G注射器混合5次。</li>
	<li>将整个甲基纤维素基介质悬浮液放入6孔板的每个孔中。</li>
	<li>在37°C培养箱中孵育,用5%CO2孵育两周,同时保持湿润。请勿打扰盘子。殖民地对运动敏感。</li>
	<li>两周后,在显微镜下数殖民地。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells.">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+HSCs+in+vitro:+don't+forget+the+hemogenic+endothelium.">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li><li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li><li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors.">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261 (2011).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

提交人声明没有利益冲突。

我们的无馈线和异种定义感应方法提供了一个精确且经济高效的平台,以可扩展的方式诱导 HE 细胞。在常规协议10、11、12、13、14中,由于对PSC菌群密度和大小缺乏精确控制,血原内皮形成的忠实形成,影响形态原/细胞因子定向分化的效率。从常规协议中,我们在每个独立批次中都经历了造血内皮诱导的不一致。新方案对PSC菌群密度和尺寸进行严格调节,克服了造血内皮诱导的不一致性。
我们利用球体的制服形成,随后在总共4天内传达了无馈线和异种的确定条件,形成HE。我们确认使用三个独立的细胞系,球形形成确保HE细胞的一致形成。作为代表性的结果,409B2细胞系在三个独立实验的基础上产生了12.7%-23.6%CD34+细胞效率。平铺 PSC 球体的关键因素是 LM511-E8。我们不建议用其他矩阵替换,例如在我们的经验中,Matrigel 或全长拉米宁产品。我们体验到,间皮器官很容易从母体分离,并在分化过程中丢失。而且,没有预涂层,Matrigel 或全长拉米宁都不会锚定细胞。
该协议的潜在限制是,我们依靠 PSC 维护介质来维护 PSC。我们已经测试了其他介质,如StemFit,但我们妥协了造血诱导。在我们的短时间(4天)诱导协议中,细胞可能抵抗从多能状态退出。如果在其他介质中维护PSC,我们建议在PSC维护介质中调整细胞,并在分化前进行几个通道。该平台将允许对细胞进行系统操作和分析,并生产出现成和大规模诱导造血细胞,供潜在的临床使用。该系统的一个长期目标是在人化小鼠模型中模拟免疫缺陷疾病,以研究负责任的细胞和分子机制,并进行药物筛选。

血液学和免疫学疾病新疗法的开发因缺乏可靠的疾病建模平台和来自患者的自体造血干细胞 (HSC) 的高通量药物筛查而受阻多能干细胞。诱导(i)PSC技术的突破有望从患者细胞中模拟疾病,但从患者iPSC中建立功能性HSC一直难以实现。为了从人类PSC获得HSC,胚胎模式和转录程序的正确诱导是关键1,2,3,4,5,6, 7,8.造血发育的最新进展表明,造血内皮(HE)在HSC开发中的作用9。他可以从PSC诱导,并适合下游干预,如基因转移10,11,12,13。以HE为平台,结合5个转录因子(ERG、HOXA5、HOXA9、LCOR、RUNX1)的组合,成功地诱导了长期移植并分化成多个谱系的功能HSC。然而,从PSC生成多变和低效的HE,阻碍了细胞的系统操作和分析,以及现成的生产和大规模诱导用于临床的造血细胞。
在这里,我们描述了一种经济高效且精确的方法,在 4 天内通过无进料和异种定义条件得出 HE。在这种方法中,在iMarix-511上球形形成和自发再扁平化可确保PSC菌落的一致密度,这对HE细胞的有效诱导至关重要。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

从人类多能干细胞(PSCs)中提取功能性造血干细胞和祖细胞(HSPCs),是治疗血液学和恶性疾病的自体移植的一个难以捉摸的目标。造血内皮(HE)是一个可调节的平台,通过转录因子产生功能性HSPCs或以稳健的方式诱导淋巴细胞。然而,目前派生HE的方法要么成本高,要么产量变化。在此协议中,我们建立了一种经济高效、精确的方法,在无馈线和异种定义的条件下在 4 天内得出 HE。由此产生的HE经历了内皮到造血的过渡,并产生了CD34+CD45+造血造物原代。我们平台在生成功能性HSPCs方面的潜在能力将在疾病建模和治疗化合物筛查方面得到广泛应用。

图1A描述了形成PSC菌落的示意图。PSC球体在微制塑料容器上形成一天。作为代表性的结果,每96孔微制造塑料容器可以处理20,000个409B2细胞,尽管其他细胞系可能需要更高的密度(每96孔微制造塑料容器30,000-40,000个细胞)。当在 LM511-E8 的存在下被镀在培养皿上时,这些球体会自发地扁平化为几乎二维的培养体。
图1B显示了造血诱导原理图。当PSC菌落增长到直径为750μm时,介质按顺序改变以诱导中皮器官。PSC菌落将在分化至中皮器官过程中逐渐成为阳光向上的结构,通过连续的介质变化,直到第4天。在第4天,血源内皮从中皮有机体中通过磁分法指定,随后在EHT介质中镀到纤维素上。5-1000万CD34+CD45-细胞预计来自含有100万个PSC的球体(图1C)。
观察细胞形态从内皮细胞向造血细胞变化(补充视频1)。图2A显示了造血原细胞在第7天用造血鸡尾酒刺激时的代表性相对比图像。造血细胞群落在培养中出现。
具有代表性的流式细胞测定图如图2B所示。整个文化被造血鸡尾酒刺激,并在第7天通过流式细胞学分析CD34和CD45的表达。造血祖细胞表达CD34和CD45。
CFU测定显示,从CD34+ CD45+ 造血祖细胞(图2C)生成颗粒细胞/巨噬菌落。 估计菌群数为每10,000个细胞38 CFU-G/M(图2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> 图1:平铺PSC菌落的原理图,以及随后通过造血内皮的造血性分化。(A) 形成PSC殖民地的原理过程.PSC 维护在 PSC 维护介质中的 LM511-E8 涂层 6 孔板上。在第-4天,细胞分离并分离到单细胞水平,使用分离溶液,随后在PSC维护介质中用Y-27632镀在微制造塑料容器上,并在一夜之间培养成球体。在第 3 天,球体在 PSC 维护介质中镀有 LM511-E8,并培养三天。到了第 0 天,球体被自发地扁平化为几乎二维的文化。刻度条 = 200 μm . (B) 在第 0 天,介质被 Day0 分化介质替换,并在低氧培养箱中培养。在分化的第 2 天,介质被第 2 天分化介质替换。在造血内皮富集的第4天,CD34+细胞在EHT培养基纤维涂层12孔板上进行磁分和培养,为期6天。(C) CD45和CD34表达的代表性流细胞学图,第4天细胞按CD34排序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> 图2:造血性特性分析。(A) 第7天用造血鸡尾酒刺激后造血祖细胞的代表性相对比图像。刻度棒 = 200 μm . (B) CD45 的代表性流式细胞学图,CD34 在第 7 天用造血鸡尾酒刺激时表达整个文化。(C) 第11天造血原细胞产生的粒细胞/巨噬细胞群的代表性相对比图像。刻度条 = 500 μm . (D) 每 10,000 个细胞的 CCF 数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> 补充视频 1:EHT 视频。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">请点击此处下载此文件。</a>

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Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

在无进料和异种定义的条件下,从人类多能干细胞中血性内皮物分化

在这里,我们提出了一个协议,以精确形成血源内皮,从人类多能干细胞在馈送和异种条件下。该方法在治疗性化合物的疾病建模和筛选中有着广泛的应用。

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

我们提供从人类多能干细胞产生血细胞。这项技术的主要优点是，我们获得一致和精确的血源内皮细胞产量。我们期望我们的平台能够广泛应用治疗化合物的疾病监测和筛查。这项技术对血液学和免疫学研究特别有益。该方法可应用于人体血细胞的基因干预或基因编辑。它允许在血源内皮细胞中轻松诱导载体。最关键的一点是用于键入 PSC 菌落的 LM511-E8 涂层。我们不建议跳过涂层或用其他矩阵代替。视觉演示很重要，因为我们想演示如何使用分离缓冲液冲洗细胞，以及如何用 LM511-E8 涂覆板。在mTeSR1介质的LM511-E8涂层六井板上，将人类多能干细胞或hPSC生长到70%至80%的汇合点。致血诱导前四天，吸气介质，用PBS洗两次。用分离溶液冲洗细胞，在37摄氏度下孵育15分钟。在PSC维护介质中重新悬浮细胞，将悬浮液转移到1.5毫升微离心管。将细胞在200倍G下离心三分钟。吸制上一液，并在PSC电镀介质中重新暂停细胞。根据手稿指示将 PSC 悬浮板到微型润滑塑料容器上，并孵育过夜。在致血诱导前三天，轻轻地将PSC球体移液到15毫升锥形管中，并在室温下离开两分钟，由重力沉淀。吸上流剂，用球形电镀介质重新暂停球体。将悬浮液分配到 LM511-E8 涂层 10 厘米培养盘中，密度为每平方厘米四个球形，孵育三天。三天后，吸培养基，加入天零分化培养基，在缺氧培养箱中培养细胞两天。然后，吸气日零介质，添加第二天分化介质，再培养两天。两天后，吸气介质，用PBS洗两次细胞。用分离溶液冲洗细胞，在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育30分钟。孵育后，通过轻轻重新在一毫摩尔EDTA中重新育制细胞，分离细胞。将悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在200次G下将细胞离心3分钟。用300微升磁分离缓冲液吸进上一提液并重新悬浮细胞颗粒。将100微升CD34阳性微珠加入细胞，通过移液轻轻混合。在室温下孵育30分钟，然后使用40微米细胞过滤器对悬浮液进行应变，并使用磁性分离器分离CD34阳性细胞。将每毫升纤维素溶液 0.5 毫升 5 微克涂装溶液分配到 24 井培养板的每个井中，并在室温下孵育板 30 分钟。同时，将分拣的CD34阳性细胞以200倍G离心3分钟，并在一毫升EHT介质中重新产生颗粒。使用细胞计数器确定可行的细胞密度，通过添加 EHT 介质将细胞密度调整到每毫升 200，000 个细胞。从纤维素涂层井中吸气并丢弃涂层溶液，并在每口井中分配0.5毫升CD34阳性细胞悬浮液。在缺氧培养箱中孵育细胞一周。要收集浮式细胞，请将培养培养介质转移到15毫升锥形管，并在200次G下离心3分钟。然后吸上一道。要收集粘附细胞，请用0.5毫升PBS清洗两次，然后用分离缓冲液冲洗。吸制多余的液体，在37摄氏度下孵育板5分钟。将细胞重新在一毫升的Facs缓冲液中，混合浮动和粘附细胞。将混合细胞在200倍G下离心3分钟，然后吸升上流剂，并在50微升的Facs缓冲液中重新暂停细胞。在50微升Facs缓冲液中稀释抗CD34和抗CD45抗体;将它们添加到细胞中，在黑暗中室温下孵育细胞一小时。然后，用PBS清洗细胞两次，每次洗涤后以200次G离心，三分钟。吸上液，用每毫升0.5微克的Facs缓冲液重新暂停细胞。通过流式细胞测量 CD34 和 CD45 表达式。要收集造血细胞，请将培养基转移到15毫升锥形管中。使用 PBS 轻轻冲洗井两次，收集剩余的细胞。将细胞在200次G下离心3分钟，然后吸升液，再在一毫升EHT介质中重新产生。数数细胞后，将1万个细胞加入三毫升甲基纤维素的分体介质中，补充抗生素，并使用16个量表注射器混合5次。将整个介质悬架分配到六井板的每个井中。为了保持细胞湿润，在盘子的空井中加入水或PBS。孵育细胞两周，确保不要打扰菜，因为菌落对运动敏感。两周后，在显微镜下计算菌落。细胞形态在用造血鸡尾酒刺激后从内皮细胞到造血细胞变化。造血细胞菌落在文化中出现。造血前细胞表达CD34和CD45，因此流细胞学通过分析CD34和CD45的表达来确认造血细胞菌落的存在。菌落形成单元测定表明，从CD34阳性和CD45阳性造血原细胞生成粒细胞或巨噬细胞菌落。据估计，每1万个细胞的菌落数量为38个群落形成单位。最关键的步骤是清点PSC球体。我们发现表面公制是本协议效率的最决定性因素。这个过程可以遵循现成的内细胞生产，如自然发生的细胞和巨噬细胞。该平台使研究人员能够探索人类造血发育中的关键决定因素。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Hemogenic内皮细胞直接诱导和血液中转录因子在人多能干细胞表达

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

科研

发育生物学

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

从人外周T细胞无饲养条件下，使用仙台病毒诱导多能干细胞的生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

从人多能干细胞的黑素细胞的无饲养推导

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

从人多能干细胞使用高度可重复的小分子为基础的分化协议心肌细胞规模化生产

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

人多能干细胞对原始和最终造血祖细胞定向分化的研究

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

在人多能的体外干细胞向滋养层细胞

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

界定和由人多能干细胞的肝细胞样细胞的可扩展代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人胚胎或诱导多能干细胞对视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

定义的无异和无饲养培养条件的人 iPSC 视网膜细胞模型的生成

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

高效可扩展的人多潜能干细胞临床相容角膜缘上皮干细胞的定向分化

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...