Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Alina Li og Seiko Benno for deres tekniske assistance. Vi vil også gerne takke fru Harumi Watanabe for at yde administrativ bistand og Dr. Peter Karagiannis til at redigere papiret. Dette arbejde blev støttet af Core Center for iPS Cell Research af Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin fra Japan Agency for medicinsk forskning og udvikling (AMED) [M.K.S.], programmet for Intractable sygdomme Research Udnytte. Sygdomsspecifikke iPS-celler af AMED (17935423) [M.K.S.] og Center for innovation-programmet for Japans videnskabs-og teknologi agentur (JST) [R.O. og M.K.S.].

1. reagenser
<ol><li>Cellelinjer (menneskelige kvikskranker): få enten embryonale stamceller (Esc'er) eller iPSC-linjer 409B2 og 201B7 (317-9)) og CBA11.</li>
	<li>
Klargøring af reagens
	<ol>
<li>PSC plating medium: Bland PSC vedligeholdelses medium med 10 μM Y-27632 og opbevares ved 4 °C.</li>
		<li>PSC Spheroid flisebelægning medium: Bland PSC vedligeholdelses medium med 625 – 1250 ng/mL humant rekombinant Laminin-511 E8 fragment (LM511-E8) (afhængigt af cellelinje) lige før brug. Bemærk: LM511-E8 kan blandes i medie15. Andre matrix såsom fuld længde Laminin-511 skal være præ-belagt, og selv gjorde det, de ikke opretholde mesodermal organoider holdes under differentierings processen.</li>
		<li>Dag 0 differentialmedium: Bland Mesodermal basal medium med 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL knogle morfogenetisk protein 4 (BMP4) og 80 ng/ml vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF).</li>
		<li>Dag 2 differentierings medium: Bland Hemogenic basal medium med 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF og 100 ng/mL stamcellefaktor (SCF).</li>
		<li>Klargør fosfatbuffer salt (PBS) uden calcium eller magnesium (Se tabel over materialer).</li>
		<li>1 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) buffer: Tilsæt 1 mL 0,5 M EDTA til 500 mL PBS.</li>
		<li>EHT medium: Bland hæmatopoietisk basal medium med 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL trombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-relateret tyrosin kinase 3 ligand (flt-3L), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6-receptor Alpha (IL-6/IL-6Rα), insulin-transferrin-selenium-ethanolamin, L-glutamin og penicillin/streptomycin/amphotericin B.</li>
		<li>FACS buffer: Bland PBS med 2% føtalt kalv serum og 1 mM EDTA.</li>
		<li>Forbered magnetisk separations buffer (Se tabel over materialer).</li>
		<li>Forbered methylcellulose-baserede medier (Se tabel over materialer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSC koloni formation
<ol><li>Forøg hPSCs til 70 – 80% sammenløbet på en 0,5 μg cm-2 LM511-E8-coated 6-brønd plade i mTeSR1 i en 37 °c-inkubator med 5% Co2.</li>
	<li>
PSC-afkobling (dag-4)
	<ol>
<li>Aspirer mediet, og vask cellerne med PBS to gange. Skyl cellerne med dissociations opløsning. Der inkuperes ved 37 °C i 15 minutter (cellerne vil ikke tørre i dette tidsrum).</li>
		<li>Afbryd cellerne i PSC-vedligeholdelses mediet, Overfør suspensionen til et passende mellemstort rør og centrifuge cellerne ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, og Afbryd CELLERNE i PSC plating medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Den PSC-suspensioner fastholdes med en densitet på 48.000 – 70.000 celler cm-2 (afhængigt af celle linjen) på et mikro-fabrikeret plastic fartøj, og der inkuleeres natten i en 37 °c-inkubator med 5% Co2. Bemærk: Vi anbefaler 100 μL brønd-1 af cellesuspension i et 96-godt mikro-fabrikeret plastikbeholder. Du vil typisk frø 20.000 celler godt-1 i en 96-brønd plade til at give ca 100 sfæroider.</li>
	<li>
Flisebelægning af PSC-sfæroider på LM511-E8 (Dag-3)
	<ol>
<li>Saml de PSC-sfæroider i et 15 mL konisk rør ved forsigtigt at pipette ved hjælp af P1000-Mikropipetter, og lad sfærooiderne stå ved stuetemperatur i 2 minutter for at udløse tyngdekraften. Aspirer supernatanten.</li>
		<li>Suspension i sfæroide plating medium, dispensere suspensionen i en ikke-belagt 6-brønd kultur plade med en tæthed på 4-spheroids cm-2 og kultur i 37 °c inkubator med 5% Co2 i tre dage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hemogen induktion (dag 0)
<ol><li>Aspirer mediet, tilsæt Day0 differentierings medium og-kultur i 37 °C-inkubatoren med 5% O2 og 5% Co2 (hypoxic-inkubator).</li>
	<li>Efter to dages kultur i Day0 differentierings medium, aspirerer mediet, tilsæt derefter Dag2 differentierings medium og-kultur i den hypoxiske inkubator.</li>
</ol>4. isolering af Hemogen endothelium (dag 4)
<ol><li>To dage senere, Aspirer mediet og vask cellerne med PBS to gange. Skyl cellerne med dissociations opløsning. Inkubator i 37 °C-inkubatoren med 5% CO2 i 30 min.</li>
	<li>Cellerne skal forsigtigt suspenderes i 1 mM EDTA for at dissociere til enkelt celleniveau, Overfør suspensionen til et 50 mL konisk rør og centrifuger cellerne ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, og Suspender celle pillen med 300 μl magnetisk separation Buffer.</li>
	<li>Tilsæt 100 μL CD34+ mikroperler og forsigtigt pipet. Der inkurueres i 30 minutter ved stuetemperatur. Der kan anvendes op til 20.000.000 celler pr. 100 μL CD34+ perler.</li>
	<li>Filtrer suspensionen gennem en 40 μm celle Strainer.</li>
	<li>Adskil CD34+ cellerne ved hjælp af en magnetisk separator.</li>
</ol>5. induktion af Endothelial til hæmatopoietisk overgang (EHT)
<ol><li>
Fibronectin belægning
	<ol>
<li>Den påkrævede volumen på 5 μg/mL fibronectin-coatingopløsning forberedes ved fortynding af 1 mg/mL fibronectin i PBS.</li>
		<li>Der dispenseres 0,5 mL af belægnings opløsningen i hver brønd af en 24-brønd kultur plade. Pladen inkupereres ved stuetemperatur i 30 minutter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge den sorterede CD34+ celler ved 200 x g i 3 min. resuspender cellen pellet i 1 ml EHT medium.</li>
	<li>Bestem den levedygtige celletæthed med celle tælleren. Juster celletætheden til 200.000 celler mL-1 ved at tilføje EHT-medium.</li>
	<li>Udsug og kassér coatingopløsningen fra den fibronectin-belagte brønd. Dispenserer 0,5 mL CD34+ cellesuspension i hver fibronectin-belagt brønd.</li>
	<li>Inkubere i den hypoxiske inkubator i en uge.</li>
</ol>6. flow cytometri analyse af hæmatopoietiske celler
<ol><li>
Flydende celle samling: Dyrkningsmediet overføres til et 15 mL konisk rør. Mediet centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten.</li>
	<li>
Vedklædet celle samling
	<ol>
<li>Cellerne vaskes med 0,5 mL PBS to gange.</li>
		<li>Skyl cellerne med dissocierende opløsning og Aspirer overskuds væsken.</li>
		<li>Pladen inkurueres i en 37 °C-inkubator i 5 min.</li>
		<li>Cellerne tilbage stoppes i 1 mL FACS-buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bland de flydende celler og vedklædige celler.</li>
	<li>Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten. Resuspension i 50 μL af FACS-bufferen. Cellerne inkupereres med anti-CD34 og anti-CD45 antistoffer i 1 time ved stuetemperatur i mørke.</li>
	<li>Cellerne vaskes med PBS to gange, og centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, og resuspér i 0,5 ml FACS-buffer med 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol.</li>
	<li>Mål CD34 og CD45 udtryk ved flow cytometer.</li>
</ol>7. koloni danner enhed (CFU) analyse af hæmatopoietiske celler
<ol><li>
Hæmatopoietisk celle samling: Mediet overføres fra kulturen til et 15 mL konisk rør. Skyl forsigtigt brønden to gange med PBS.</li>
	<li>Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 3 min. Aspirér supernatanten. Opslæk i 1 mL EHT-medium. Bestem celle nummer med celle tælleren.</li>
	<li>Der tilsættes en suspension volumen svarende til 10.000 celler til 3 mL methylcellulose-baserede medier suppleret med antibiotika og bland godt 5 gange med en 16 G eller 18 G sprøjte.</li>
	<li>Dispenserer hele den methylcellulose baserede medie affjedring i hver brønd af en 6-brønd plade.</li>
	<li>Inkubator i 37 °C-inkubatoren med 5% CO2 i to uger, mens den holdes fugtig. Forstyr ikke skålen. Kolonier er bevægelsesfølsomme.</li>
	<li>Efter to uger, tælle kolonierne under et mikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells.">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+HSCs+in+vitro:+don't+forget+the+hemogenic+endothelium.">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li><li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li><li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors.">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261 (2011).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Vores feeder-og Xeno-fri definerede induktions metode tilbyder en præcis og omkostningseffektiv platform til at inducere HE-celler på en skalerbar måde. Den trofaste dannelse af hemogen endotelet i konventionelle protokoller10,11,12,13,14 er blevet hæmmet af manglen på præcis kontrol af PSC koloni tæthed og størrelse, som påvirker effektiviteten af morphogen/cytokin baseret målrettet differentiering. Vi havde oplevet inkonsistens af hemogen endotelet induktion i hver uafhængig batch fra konventionelle protokoller. Den nye protokol giver mulighed for stram regulering af PSC koloni tæthed og størrelse, dermed overvinder den inkonsekvente af hemogenic endotelinduum induktion.
Vi udnyttede den uniformerede dannelse af sfæroider og overbragte efterfølgende en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand til at danne HE i alt 4 dage. Vi bekræftede ved hjælp af tre uafhængige cellelinjer, at sfæoide dannelsen forsikrer den konsekvente dannelse af HE celler. Som et repræsentativt resultat gav 409B2-celle linjerne 12,7%-23,6% CD34+ celle effektivitet baseret på tre uafhængige eksperimenter. Den kritiske faktor for Tile-sfæroider er LM511-E8. Vi anbefaler ikke at erstatte dette med andre matrix, såsom Matrigel eller fuld længde Laminin produkter i vores erfaringer. Vi oplevede, at mesodermal organoider let blev løsrevet fra Matrigel og tabte under differentierings processen. Og hverken Matrigel eller fuld-længde Laminin ikke forankre celler uden præ-belægning.
Den mulige begrænsning af denne protokol er, at vi er afhængige af PSC-vedligeholdelses mediet for at vedligeholde kvikskrankerne. Vi har testet andre medier som StemFit, men vi kompromitteret hemogenic induktion. Formentlig celler var resistente over for at forlade pluripotente tilstand i vores korte tid (4 dage) induktion protokol. Hvis man vedligeholder kvikskrankerne i andre medier, anbefaler vi at tilpasse cellerne i PSC-vedligeholdelses mediet og gennemføre et par passager før differentiering. Denne platform vil tillade systematisk manipulation og analyse af celler, og off-the-shelf produktion og storstilet induktion af hæmatopoietiske celler til potentiel klinisk brug. Et langsigtet mål med dette system er at modellere immundefekt sygdomme i humaniserede musemodeller for at undersøge de ansvarlige cellulære og molekylære mekanismer og gennemføre lægemiddel screeninger.

Udviklingen af nye lægemidler til hæmatologiske og immunologiske lidelser er blevet hæmmet af manglen på robuste platforme til sygdoms modellering og høj gennemstrømning af lægemiddel screening med autologe hæmatopoietiske stamceller (HSCs) afledt af patientens pluripotente stamceller (kvikskranker). Gennembruddet i den inducerede (i) PSC-teknologi lover at modellere sygdomme fra patienternes celler, men etableringen af funktionelle Hsc'er fra patient-iPSCs har været undvigende. For at kunne udlede hscs fra menneskelige kvikskranker er den korrekte induktion af embryonale mønster-og transskriptionelle programmer nøgle1,2,3,4,5,6, 7,8. Nylige fremskridt inden for hæmatopoietisk udvikling har vist den rolle, som hemogen endotelet (HE) i HSC udvikling9. Han kan induceres fra kvikskrankerne og er i stand til at gribe ind i nedstrømsinterventioner såsom genoverførsel10,11,12,13. Ved hjælp af HE som en platform, kombinationen af 5 transkription faktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) med succes inducerede funktionelle hscs at indpode langsigtede og differentiere i flere slægter14. Variabel og ineffektiv generering af HE fra kvikskrankerne har imidlertid hæmmet den systematiske manipulation og analyse af celler sammen med den off-the-shelf produktion og store induktion af hæmatopoietiske celler til klinisk brug.
Her beskriver vi en omkostningseffektiv og præcis metode til at udlede HE i 4 dage med en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand. I denne metode sikrer sfæroide dannelse og spontan re-samkopiering på imarix-511 en konsistent tæthed af PSC-kolonier, hvilket er afgørende for effektiv induktion af HE-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

Afledte funktionelle hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller (Hspc'er) fra humane pluripotente stamcelle (kvikskrankerne) har været et flygtigt mål for autologe transplantationer til behandling af hæmatologiske og maligne lidelser. Hemogenic endothel (HE) er en genstand platform til at producere funktionelle hspc'er ved transkription faktorer eller til at inducere lymfocytter på en robust måde. Men de nuværende metoder til at udlede HE er enten dyrt eller variable i udbyttet. I denne protokol etablerede vi en omkostningseffektiv og præcis metode til at udlede HE inden for 4 dage i en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand. Den resulterende han gennemgik en Endothelial-til-hæmatopoietisk overgang og producerede CD34+CD45+ clonogenic hæmatopoietiske progenitorer. Den potentielle kapacitet af vores platform til at generere funktionelle Hspc'er vil have brede applikationer i sygdoms modellering og screening for terapeutiske forbindelser.

En skematisk dannelse af PSC-kolonier er afbildet i figur 1a. PSC-sfæroider dannes på en mikro-fabrikeret plastikbeholder for en dag. Som et repræsentativt resultat, 20.000 409B2 celler kunne håndteres pr 96-brønd af mikro-fabrikeret plastic fartøj, selv om andre cellelinjer kan kræve en højere tæthed (30000-40000 celler pr 96-brønd af mikro-fabrikeret plastic fartøj). Disse kugler er spontant fladtrykt til en næsten todimensionel kultur, når belagt på en kultur skål i nærværelse af LM511-E8.
En skematisk af hemogen induktion er illustreret i figur 1b. Når PSC-kolonier vokser til en diameter på 750 μm, ændres mediet sekventielt til at inducere mesodermal organoider. De PSC kolonier vil gradvist blive en solrig side op struktur under differentiering til mesodermal organoider ved sekventiel medium forandring indtil dag 4. På dag 4 er hemogen endothelia specificeret fra mesodermal organoider ved magnetisk sortering og efterfølgende belagt på fibronectin i EHT medium. 5-10 millioner CD34+CD45- celler forventes fra sfæroider indeholdende 1.000.000 kvikskranker (figur 1c).
Det bemærkes, at cellerne morfologisk skifte fra endotel til hæmatopoietiske celler (supplerende video 1). Et repræsentativt fasekontrast billede af hæmatopoietiske stamceller efter stimulering med hæmatopoietisk cocktail på dag 7 er vist i figur 2a. Hæmatopoietiske celle kolonier dukkede op i kulturen.
Et repræsentativt flow cytometri plot er vist i figur 2b. Hele kulturen stimuleres med hæmatopoietisk cocktail og på dag 7 analyseres for udtrykket af CD34 og CD45 ved flow cytometri. Hæmatopoietiske progenitorceller udtrykker CD34 og CD45.
En CFU-analyse viste dannelsen af granulocytter/makrofag kolonier fra CD34+ CD45+ hæmatopoietiske progenitorceller (figur 2c). Det anslåede koloni nummer er 38 CFU-G/M pr. 10.000 celler (figur 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> Figur 1: skematisk flisebelægning af PSC-kolonier og efterfølgende hæmatopoietisk differentiering via hemogen endothelia. (A) skematisk proces med at danne PSC-kolonier. Kvikskrankerne vedligeholdes på en LM511-E8-belagt 6-brønd plade i PSC-vedligeholdelses medium. På dag-4 er cellerne løsrevet og dissocieret til enkelt celleniveau ved hjælp af dissocierende opløsning, efterfølgende belagt på mikrofabrikeret plastikbeholder i PSC-vedligeholdelses medium med Y-27632 og kultiveret natten for at danne sfæroider. På dag-3 er sfæroider belagt med PSC-vedligeholdelses medium med LM511-E8 og kultiveret i tre dage. Ved dag 0 er sfæroider spontant fladtrykt til en næsten todimensional kultur. Skala stænger = 200 μm. (B) på dag 0, mediet er erstattet med Day0 differentierings medium og kultiveret i hypoksiske inkubator. På dag 2 af differentieringen, mediet erstattes med Dag2 differentierings medium. På dag 4 af den hemogene endotelet berigelse, CD34+ celler er magnetisk sorteret og kultiveret på en fibronectin-belagt 12-brønd plade i EHT medium i 6 dage. C) repræsentativt flowcytometri plot af CD45 og CD34, der er udtryk for dag 4-celler sorteret efter CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> Figur 2: analyse af hæmatopoietisk ejendom. (A) repræsentativt fasekontrast billede af hæmatopoietiske stamceller efter stimulation med hæmatopoietisk cocktail på dag 7. Skala stang = 200 μm. (B) repræsentativt flow cytometri plot af CD45 og CD34 udtryk for hele kulturen efter stimulering med hæmatopoietisk cocktail på dag 7. C) repræsentativ fasekontrast-billede af en granulocyt/macrophage-koloni, der er genereret fra dag 11 hæmatopoietiske progenitorceller. Skaleringsbar = 500 μm. (D) antal cfus pr. 10.000 celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> Supplerende video 1: EHT-video. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogen endothelium differentiering fra humane pluripotente stamceller i en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand

Her præsenterer vi en protokol til præcist at danne hemogen endotelet fra humane pluripotente stamceller i en feeder-og Xeno-fri tilstand. Denne metode vil have brede anvendelsesmuligheder i sygdom modellering og screening for terapeutiske forbindelser.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Vi tilbyder producere blodceller fra menneskelige pluripotente stamceller. Den største fordel ved denne teknik er, at vi får konsekvent og præcis udbytte af hemogene endotelceller. Vi forventer, at vores platform vil muliggøre brede anvendelser i sygdomsovervågning og screening for terapeutiske forbindelser.Denne teknik er især gavnligt for hæmatologi og immunologi forskning. Metoden kan anvendes til genetisk intervention eller genredigering af humane blodlegemer. Det giver mulighed for nem induktion af vektorer i hemogene endotelceller.Det mest afgørende punkt er LM511-E8 belægning til at skrive PSC kolonier. Vi anbefaler ikke at springe belægningen over eller erstatte med en anden matrix. Visuelle demonstrationer er vigtige, fordi vi ønsker at vise, hvordan man skyller cellerne med en dissociationsbuffer, og hvordan man frakker plader med LM511-E8.Dyrk humane pluripotente stamceller eller hPSCs til mellem 70 og 80%sammenløbet på en LM511-E8-belagt seks-brønd plade i mTeSR1 medium. Fire dage før hemogen induktion, aspirere mediet og vask to gange med PBS. Skyl cellerne med dissociationsopløsning, og inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter.Opslæm cellerne i PSC vedligeholdelsesmediet og overfør suspensionen til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Centrifuge cellerne ved 200 gange G i tre minutter. Inspirer supernatanten, og opspjæn cellerne i PSC plating medium.Plade PSC suspension i henhold til manuskriptet retninger på en mikrofabrikeret plast beholder, og inkubere natten over. Tre dage før hemogen induktion, forsigtigt pipette PSC sfæroider i en 15 milliliter konisk rør og lad dem i to minutter ved stuetemperatur at udfælde ved tyngdekraften. Inspirer supernatanten og resuspend spheroids i sfæroid plating medium.Fordel suspensionen i en LM511-E8 belagt 10 centimeter kultur parabol på en tæthed af fire sfæroider per kvadratcentimeter og inkubere i tre dage. Efter tre dage, aspirere mediet, tilsæt dag nul differentiering medium, og kultur cellerne i to dage i en hypoxisk inkubator. Derefter aspirere dag nul medium, tilføje dag to differentiering medium, og kultur i yderligere to dage.To dage senere, aspirere mediet og vask cellerne to gange med PBS. Skyl cellerne med dissociationsopløsning og inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid. Efter inkubationen skal cellerne adskilles ved forsigtigt at opsbruge dem i en millimolar EDTA.Suspensionen overføres til et konisk rør på 50 milliliter, og cellerne centrifugeres ved 200 gange G i tre minutter. Inspirer supernatanten og opslæmp cellepellet med 300 mikroliter magnetisk separationsbuffer. Tilsæt 100 mikroliter CD34-positive mikroperler til cellerne, og bland forsigtigt ved pipettering.Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter, og brug derefter en 40 mikrometercellestud for at belaste suspensionen og adskille cd34-positive celler ved hjælp af en magnetisk separator. Der dispenseres 0,5 milliliter 5 mikrogram pr. milliliter fibronectinbelægningsopløsning i hver brønd af en 24 brøndkulturplade, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. I mellemtiden centrifuge de sorterede CD34-positive celler ved 200 gange G i tre minutter, og resuspend pellet i en milliliter EHT medium.Bestemme den levedygtige celletæthed med en celletæller, og juster celletætheden til 200.000 celler pr. milliliter ved at tilføje EHT-mediet. Aspirere og kassér belægningsopløsningen fra de fibronectinbelagte brønde, og dispenser 0,5 milliliter CD34-positiv cellesuspension i hver brønd. Inkuber cellerne i hypoxisk inkubator i en uge.For at indsamle de flydende celler, overføre kulturmediet til en 15 milliliter konisk rør, og centrifuge ved 200 gange G i tre minutter. Derefter aspirere supernatant. For at indsamle de klæbende celler vaskes de to gange med 0,5 milliliter PBS, og skyl dem med dissocierende buffer.Inspirer den overskydende væske og inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem minutter. Opslæmme cellerne i en milliliter Facs-buffer, og bland de flydende og klæbende celler. Centrifuge de blandede celler ved 200 gange G i tre minutter, derefter aspirere supernatant og resuspend cellerne i 50 mikroliter af Facs buffer.Fortyndet anti-CD34 og anti-CD45 antistoffer i 50 mikroliter af Facs buffer;tilføje dem til cellerne og inkubere cellerne i en time ved stuetemperatur i mørke. Derefter vaskes cellerne to gange med PBS, centrifugering ved 200 gange G i tre minutter efter hver vask. Inspirer supernatanten og resuspend cellerne i 0,5 milliliter Facs buffer med 0,5 mikrogram pr. milliliter dappy.Mål CD34- og CD45-udtryk efter flowcytometri. For at indsamle hæmatopoietiske celler, overføre kulturmediet til en 15 milliliter konisk rør. De resterende celler opsamls ved forsigtigt at skylle brønden to gange med PBS.Centrifuge cellerne ved 200 gange G i tre minutter derefter aspirere supernatant og resuspend i en milliliter EHT medium. Efter optælling af cellerne, tilsættes 10,000 celler til tre milliliter methylcellulose afstand medier, suppleret med antibiotika, og bruge en 16 gauge sprøjte til at blande fem gange. Dispenser hele mediesuspensionen i hver brønd af en seks-brøndplade.For at holde cellerne fugtige, tilsæt vand eller PBS til de tomme brønde på pladen. Inkuber cellerne i to uger, og sørg for ikke at forstyrre skålen som kolonier er bevægelsesfølsomme. Efter to uger tælles kolonierne under et mikroskop.Celle morfologisk skifte fra endotel til hæmatopoietiske celler ved stimulation med hæmatopoietiske cocktail. Hæmatopoietiske cellekolonier dukker op i kulturen. Hæmatopoietiske progenitorceller udtrykker CD34 og CD45, så flowcytometri bruges til at bekræfte tilstedeværelsen af hæmatopoietiske cellekolonier ved at analysere ekspressionen af CD34 og CD45.En koloni danner enhed assay demonstreret generation af granulocytter eller makrofag kolonier fra CD34-positive og CD45-positive hæmatopoietiske progenitor celler. Koloninummeret blev anslået til 38 kolonidannende enheder pr. 10.000 celler. De mest afgørende skridt er optælling PSC sfæroider.Vi fandt, at overfladen metriske er den mest deterministiske faktor i effektiviteten af denne protokol. Denne procedure kan efterfølges af off-the-shelf produktion af inergiske celler såsom naturligt forekommende celler og makrofager. Denne platform giver forskerne mulighed for at udforske vigtige deterministiske faktorer i menneskets hæmatopoietiske udvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkte Induktion af Hemogenic Endothelium og Blood af Overekspression af transkriptionsfaktorer i Human pluripotente stamceller

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering af induceret pluripotente stamceller fra humane perifere T-celler Brug af Sendai Virus i Feeder-fri Betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiering af humane pluripotente stamceller til trofoblastceller

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definerede Xeno-fri og Feeder-fri kultur betingelser for den Generation af menneskelige iPSC-afledte Retinal Cell modeller

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...