Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Wir danken Alina Li und Seiko Benno für ihre technische Unterstützung. Wir danken auch Frau Harumi Watanabe für die administrative Unterstützung und Dr. Peter Karagiannis für die Bearbeitung des Papiers. Diese Arbeit wurde vom Core Center for iPS Cell Research of Research Center Network for Realization of Regenerative Medicine von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) [M.K.S.], dem Programm für Insentasierbare Krankheiten, unterstützt. Verwendung. Krankheitsspezifische iPS-Zellen von AMED (17935423) [M.K.S.] und Center for Innovation Program der Japan Science and Technology Agency (JST) [R.O. und M.K.S.].

1. Reagenzien
<ol><li>Zelllinien (menschliche PSK): erhalten entweder embryonale Stammzellen (ESCs) oder iPSC-Linien 409B2 und 201B7(317-9)) und CBA11.</li>
	<li>
Reagenz-Präparation
	<ol>
<li>PSC-Beschichtungsmedium: PSC-Wartungsmedium mit 10 'M Y-27632 mischen und bei 4 °C lagern.</li>
		<li>PSC Spheroid-Fliesenmedium: Mischen Sie das PSC-Wartungsmedium mit 625–1.250 ng/ml menschlichem rekombinantem Laminin-511 E8-Fragment (LM511-E8)(je nach Zelllinie) kurz vor der Verwendung. HINWEIS: LM511-E8 kann in Medien15gemischt werden. Andere Matrix wie Volllängen-Laminin-511 muss vorbeschichtet werden, und sogar, sie tragen nicht mesodermale Organoide während des Differenzierungsprozesses haften.</li>
		<li>Tag 0 Differenzierungsmedium: Mischen Sie mesodermales Basalmedium mit 2 'M CHIR99021, 80 ng/mL Knochenmorphogenetischem Protein 4 (BMP4) und 80 ng/mL Vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).</li>
		<li>Tag 2 Differenzierungsmedium: Mischen Sie hämogenes Basalmedium mit 1 M SB431542, 80 ng/mL VEGF und 100 ng/mL Stammzellfaktor (SCF).</li>
		<li>Phosphatpuffer-Saline (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium vorbereiten (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer: 1 ml 0,5 M EDTA zu 500 ml PBS hinzufügen.</li>
		<li>EHT-Medium: Mischen Hematopoietic Basalmedium mit 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL Thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-bezogene Tyrosinkinase 3 Liganden (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6-Rezeptor alpha (IL-6/IL-6R), Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B.</li>
		<li>FACS-Puffer: PBS mit 2% fetalem Kalbsserum und 1 mM EDTA mischen.</li>
		<li>Vorbereiten des magnetischen Trennpuffers (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Vorbereiten von Methylcellulose-basierten Medien (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSC-Koloniebildung
<ol><li>HPSCs auf 70 – 80 % Konfluenkation auf einer 0,5 g cm-2 LM511-E8-beschichteten 6-Well-Platte in mTeSR1 in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2anbauen.</li>
	<li>
PSC-Dissoziation (Tag -4)
	<ol>
<li>Das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung. Inkubieren Bei 37 °C für 15 min (Zellen werden in dieser Zeit nicht ausgeimpft).</li>
		<li>Die Zellen im PSC-Wartungsmedium aussetzen, die Suspension auf ein entsprechend großes Rohr übertragen und die Zellen 3 min bei 200 x g zentrifugieren. Den Überstand ansaugen und die Zellen im PSC-Beschichtungsmedium aussetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die PSC-Suspension mit einer Dichte von 48.000 – 70.000 Zellen cm-2 (je nach Zelllinie) auf ein mikrogefertigtes Kunststoffgefäß aufteilenund über Nacht im 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 bebrüten. HINWEIS: Wir empfehlen 100 l well-1 der Zellsuspension in einem 96-well mikrogefertigten Kunststoffgefäß. Sie säen in der Regel 20.000 Zellen gut-1 in einer 96-Well-Platte, um etwa 100 Sphäroide zu ergeben.</li>
	<li>
Fliesen PSC Sphäroide auf LM511-E8 (Tag -3)
	<ol>
<li>Sammeln Sie die PSC-Sphäroide in einem 15 ml konischen Rohr, indem Sie vorsichtig Pipettieren mit P1000 Mikropipetter und lassen Sie die Sphäroide bei Raumtemperatur für 2 min stehen, um durch die Schwerkraft zu fallen. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
		<li>In Sphäroid-Beschichtungsmedium aufsetzen, die Suspension drei Tage lang in eine unbeschichtete 6-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 4-Sphäroidencm-2 und Kultur im 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 geben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Hämogene Induktion (Tag 0)
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie Day0 Differenzierungsmedium und Kultur im 37 °C Inkubator mit 5% O2 und 5% CO2 (hypoxischer Inkubator) hinzu. </li>
	<li>Nach zwei Tagen Kultur in Day0 Differenzierung medium, aspirieren Sie das Medium, dann fügen Sie Day2 Differenzierung Medium und Kultur im hypoxischen Inkubator.</li>
</ol>4. Isolierung des hämogen Endothel (Tag 4)
<ol><li>Zwei Tage später das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung. Inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für 30 min.</li>
	<li>Die Zellen in 1 mM EDTA vorsichtig aufhängen, um sich von der einzelzelligen Ebene zu trennen, die Suspension in ein 50 ml konisches Rohr zu übertragen und die Zellen bei 200 x g für 3 min zentrieren. stoßdämpfer.</li>
	<li>Fügen Sie 100 L CD34+ Mikroperlen und sanft Pipetten. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Es können bis zu 20 Millionen Zellen pro 100 L CD34+ Perlen verwendet werden.</li>
	<li>Filtern Sie die Suspension durch ein 40-m-Zellensieb.</li>
	<li>Trennen Sie die CD34+ Zellen mit einem magnetischen Separator.</li>
</ol>5. Induktion des endotheliaalen zu hämatopoetischen Übergangs (EHT)
<ol><li>
Fibronectin-Beschichtung
	<ol>
<li>Bereiten Sie das erforderliche Volumen von 5 g/ml Fibronectin-Beschichtungslösung vor, indem Sie 1 mg/ml Fibronectin in PBS verdünnen.</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml der Beschichtungslösung in jeden Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die sortierten CD34+ Zellen bei 200 x g für 3 min. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml EHT-Medium wieder auf.</li>
	<li>Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte mit dem Zellzähler. Passen Sie die Zelldichte auf 200.000 Zellen mL-1 an, indem Sie EHT-Medium hinzufügen.</li>
	<li>Die Beschichtungslösung aus dem fibronectinbeschichteten Brunnen ansaugen und entsorgen. Geben Sie 0,5 ml CD34+ Zellsuspension in jeden fibronectinbeschichteten Brunnen.</li>
	<li>Inkubieren Sie im hypoxischen Inkubator für eine Woche.</li>
</ol>6. Durchflusszytometrie Analyse hämatopoetischer Zellen
<ol><li>
Floating-Zell-Sammlung: Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine 15 ml kegelförmige Röhre. Zentrifugieren Sie das Medium bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>
Adherent-Zellsammlung
	<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,5 ml PBS.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen mit dissoziierender Lösung und aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte im 37 °C Inkubator für 5 min.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer wieder aus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie die schwebenden Zellen und anhaftenden Zellen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend in 50 L FACS-Puffer. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD34- und Anti-CD45-Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Den Überstand ansaugen und in 0,5 ml FACS-Puffer mit 0,5 g/ml 4',6-Diamidino-2-Phenylindole wieder aufsetzen.</li>
	<li>Messen Sie die EXPRESSION CD34 und CD45 nach Durchflusszytometer.</li>
</ol>7. Colony Forming Unit (CFU) Assay von hämatopoetischen Zellen
<ol><li>
Hämatopoetische Zellsammlung: Übertragen Sie das Medium von der Kultur auf eine 15 ml kegelförmige Röhre. Spülen Sie den Brunnen zweimal mit PBS ab.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend in 1 ml EHT Medium. Bestimmen Sie die Zellennummer mit dem Zellenzähler.</li>
	<li>Fügen Sie ein Suspensionsvolumenäquivalent von 10.000 Zellen zu 3 ml Methylcellulose-basierten Medien hinzu, die mit Antibiotika ergänzt werden, und mischen Sie sie gut 5 Mal mit einer 16 G- oder 18 G-Spritze.</li>
	<li>Geben Sie die gesamte Methylcellulose-basierte Mediensuspension in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für zwei Wochen unter Feuchte. Stören Sie das Gericht nicht. Kolonien sind bewegungsempfindlich.</li>
	<li>Zählen Sie nach zwei Wochen die Kolonien unter dem Mikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Unsere feeder- und xenofreie definierte Induktionsmethode bietet eine präzise und kostengünstige Plattform, um HE-Zellen skalierbar zu induzieren. Die getreue Bildung von hämogenem Endothel in konventionellen Protokollen10,11,12,13,14 wurden durch das Fehlen einer präzisen Kontrolle der PSC-Koloniedichte und -größe behindert, die die Effizienz der morphogenen/zytokinbasierten gerichteten Differenzierung beeinflusst. Wir hatten in jeder unabhängigen Charge von herkömmlichen Protokollen eine Inkonsistenz der hämogenen Endothel-Induktion erfahren. Das neue Protokoll ermöglicht eine strenge Regulierung der PSC-Koloniedichte und -größe und überwindet so die Inkonsistenz der hämogenen Endothelinduktion.
Wir nutzten die uniformierte Formation von Sphäroiden und transportierten anschließend in insgesamt 4 Tagen eine feeder- und xenofreie definierte Bedingung zur Bildung von HE. Wir bestätigten anhand von drei unabhängigen Zelllinien, dass die Sphäroidbildung die konsistente Bildung von HE-Zellen sicherstellung. Als repräsentatives Ergebnis ergaben die 409B2-Zelllinien 12,7%-23,6% CD34+ Zelleffizienz basierend auf drei unabhängigen Experimenten. Der entscheidende Faktor für die Kachel nerieren PSC Sphäroide ist LM511-E8. Wir empfehlen nicht, dies durch andere Matrix, wie Matrigel oder vollwertige Laminin-Produkte in unseren Erfahrungen zu ersetzen. Wir haben erlebt, dass mesodermale Organoide leicht von Matrigel gelöst wurden und während des Differenzierungsprozesses verloren gingen. Und weder Matrigel noch Vollglasin verankern Zellen ohne Vorbeschichtung.
Die potenzielle Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass wir auf das PSC-Wartungsmedium angewiesen sind, um PSCs zu warten. Wir haben andere Medien wie StemFit getestet, aber wir haben die hämogene Induktion kompromittiert. Vermutlich waren Zellen in unserem kurzen (4 Tage) Induktionsprotokoll resistent gegen den Ausstieg aus dem pluripotenten Zustand. Wenn man PSCs in anderen Medien unterhält, empfehlen wir, Zellen in PSC-Wartungsmedium anzupassen und einige Passagen vor der Differenzierung durchzuführen. Diese Plattform wird die systematische Manipulation und Analyse von Zellen sowie die handelsübliche Produktion und großflächige Induktion hämatopoetischer Zellen für eine mögliche klinische Anwendung ermöglichen. Ein langfristiges Ziel dieses Systems ist es, Immunschwächeerkrankungen in humanisierten Mausmodellen zu modellieren, um die verantwortlichen zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen und Arzneimittelscreenings durchzuführen.

Die Entwicklung neuer Therapeutika für hämatologische und immunologische Erkrankungen wurde durch das Fehlen robuster Plattformen für die Krankheitsmodellierung und das Screening von Medikamenten mit hohem Durchsatz mit autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) behindert, die von Patienten abgeleitet wurden. pluripotente Stammzellen (PSCs). Der Durchbruch der induzierten (i)PSC-Technologie verspricht, Krankheiten aus Patientenzellen zu modellieren, aber die Etablierung funktioneller HSCs aus Patienten-iPSCs war schwer fassbar. Um HSCs aus menschlichen PSCs abzuleiten, ist die richtige Induktion embryonaler Muster- und Transkriptionsprogramme der Schlüssel1,2,3,4,5,6, 7,8. Jüngste Fortschritte in der hämatopoetischen Entwicklung haben die Rolle des hämogen Endothel (HE) in der HSC-Entwicklung9gezeigt. HE kann aus PSPsinduziert werden und ist für nachgeschaltete Interventionen wie Gentransfer10,11,12,13zugänglich. Mit HE als Plattform induzierte die Kombination von 5 Transkriptionsfaktoren (ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) erfolgreich funktionelle HSCs, die langfristig engraft und in mehrere Linien differenzieren14. Die variable und ineffiziente Erzeugung von HE aus PSCs hat jedoch die systematische Manipulation und Analyse von Zellen sowie die Standardproduktion und großflächige Induktion hämatopoetischer Zellen für den klinischen Einsatz behindert.
Hier beschreiben wir eine kostengünstige und präzise Methode, um HE in 4 Tagen mit einem feeder- und xeno-freien definierten Zustand abzuleiten. Bei dieser Methode sorgt die Sphäroidbildung und spontane Reflattenierung auf iMarix-511 für eine gleichbleibende Dichte von PSC-Kolonien, was für die effiziente Induktion von HE-Zellen entscheidend ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

Die Ableitung funktioneller hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSCs) war ein schwer fassbares Ziel für autologe Transplantationen zur Behandlung hämatologischer und bösartiger Störungen. Hämogenes Endothel (HE) ist eine amenable-Plattform, um funktionelle HSPCs durch Transkriptionsfaktoren zu produzieren oder Lymphozyten auf robuste Weise zu induzieren. Die derzeitigen Methoden zur Ableitung von HE sind jedoch entweder kostspielig oder variabel. In diesem Protokoll haben wir eine kostengünstige und präzise Methode etabliert, um HE innerhalb von 4 Tagen in einem feeder- und xeno-freien definierten Zustand abzuleiten. Der daraus resultierende ER unterzog sich einem endotheliaal-hematopoetischen Übergang und produzierte CD34+CD45+ clonogene hämatopoetische Vorläufer. Die potenzielle Kapazität unserer Plattform zur Erzeugung funktioneller HSPCs wird breite Anwendungen bei der Krankheitsmodellierung und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Ein Schaltplan der Bildung von PSC-Kolonien ist in Abbildung 1Adargestellt. PSC-Sphäroide werden einen Tag lang auf einem mikrogefertigten Kunststoffgefäß geformt. Als repräsentatives Ergebnis könnten 20.000 409B2-Zellen pro 96-Well mikrogefertigten Kunststoffgefäßes behandelt werden, obwohl andere Zelllinien eine höhere Dichte erfordern können (30.000-40.000 Zellen pro 96-Well aus mikrogefertigtem Kunststoffgefäß). Diese Sphären werden spontan zu einer fast zweidimensionalen Kultur abgeflacht, wenn sie in Gegenwart von LM511-E8 auf ein Kulturgericht plattiert werden.
Ein Schema der hämogenen Induktion ist in Abbildung 1Bdargestellt. Wenn PSC-Kolonien bis zu einem Durchmesser von 750 m wachsen, wird das Medium sequenziell geändert, um mesodermale Organoide zu induzieren. Die PSC-Kolonien werden allmählich zu einer sonnigen Seitenstruktur während der Differenzierung zu mesodermalen Organoiden durch sequenzielle mittlere Veränderung bis Tag 4. An Tag 4 werden hämogene Endothelien aus mesodermalen Organoiden durch magnetische Sortierung spezifiziert und anschließend im EHT-Medium auf Fibronectin plattiert. 5-10 Millionen CD34+CD45- Zellen werden von Sphäroiden erwartet, die 1 Million PSCs enthalten (Abbildung 1C).
Es wird beobachtet, dass sich die Zellen morphologisch von endothelialer zu hämatopoetischen Zellen verändern (Ergänzendes Video 1). Ein repräsentatives Phasenkontrastbild hämatopoetischer Vorläuferzellen bei Stimulation mit hämatopoetischem Cocktail am 7. Tag ist in Abbildung 2Adargestellt. Hematopoetische Zellkolonien entstanden in der Kultur.
Ein repräsentatives Strömungszytometriediagramm ist in Abbildung 2Bdargestellt. Die gesamte Kultur wird mit hämatopoetischem Cocktail stimuliert und am 7. Tag auf den Ausdruck von CD34 und CD45 durch Flow-Zytometrie analysiert. Hämatopoetische Vorläuferzellen drücken CD34 und CD45 aus.
Ein CFU-Assay zeigte die Erzeugung von Granulozyten/Makrophagenkolonien aus den CD34+ CD45+ hämatopoetischen Vorläuferzellen (Abbildung 2C). Die geschätzte Koloniezahl beträgt 38 KBE-G/M pro 10.000 Zellen (Abbildung 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Fliesen-PSC-Kolonien und anschließende hämatopoetische Differenzierung über hämogene Endothelie. (A) Schematischer Prozess der Bildung von PSC-Kolonien. PSCs werden auf einer LM511-E8-beschichteten 6-Well-Platte in PSC-Wartungsmedium gewartet. Am Tag -4 werden die Zellen mit einer dissoziierenden Lösung auf mikrogefertigtes Kunststoffgefäß im PSC-Wartungsmedium mit Y-27632 abgetrennt und mit der einzelzelligen Ebene dissoziiert und über Nacht zu Sphäroiden kultiviert. Am Tag -3 werden Sphäroide in PSC-Wartungsmedium mit LM511-E8 plattiert und drei Tage lang kultiviert. Bis Zum 0. Tag werden Sphäroide spontan zu einer fast zweidimensionalen Kultur abgeflacht. Skalenbalken = 200 m . (B) Am Tag 0 wird das Medium durch Day0-Differenzierungsmedium ersetzt und im hypoxischen Inkubator kultiviert. Am zweiten Tag der Differenzierung wird das Medium durch das Tag2-Differenzierungsmedium ersetzt. An Tag 4 der hämogen Endothelanreicherung werden CD34+ Zellen 6 Tage lang magnetisch sortiert und auf einer fibronectinbeschichteten 12-Well-Platte im EHT-Medium kultiviert. (C) Repräsentative Flusszytometrie-Plot von CD45 und CD34 Expression von Tag 4 Zellen sortiert nach CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> Abbildung 2: Analyse der hämatopoetischen Eigenschaft. (A) Repräsentatives Phasenkontrastbild hämatopoetischer Vorläuferzellen nach Stimulation mit hämatopoetischem Cocktail am 7. Tag. Scale bar = 200 m. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie Plot von CD45 und CD34 Ausdruck der ganzen Kultur bei Stimulation mit hämatopoetischen Cocktail an Tag 7. (C) Repräsentatives Phasenkontrastbild einer Granulozyten-/Makrophagenkolonie, die aus tag11 hämatopoetischen Vorläuferzellen erzeugt wird. Scale bar = 500 m (D) Anzahl der KBE pro 10.000 Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> Ergänzendes Video 1: EHT-Video. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Wir bieten produzierende Blutzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir konsistente und präzise Erträge hämogener Endothelzellen erhalten. Wir erwarten, dass unsere Plattform breite Anwendungen bei der Überwachung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen ermöglichen wird.Diese Technik ist besonders vorteilhaft für die Hämatologie und ImmunologieForschung. Die Methode kann auf genetische Interventionen oder Genbearbeitung menschlicher Blutkörperchen angewendet werden. Es ermöglicht eine einfache Induktion von Vektoren in hämogene Endothelzellen.Der wichtigste Punkt ist die LM511-E8-Beschichtung zur Eingabe von PSC-Kolonien. Wir empfehlen nicht, die Beschichtung zu überspringen oder durch eine andere Matrix zu ersetzen. Visuelle Demonstrationen sind wichtig, da wir zeigen möchten, wie die Zellen mit einem Dissoziationspuffer abspült werden und wie Platten mit LM511-E8 beschichtet werden.Wachsen Sie menschliche pluripotente Stammzellen oder hPSCs auf eine LM511-E8-beschichtete Sechs-Well-Platte in mTeSR1-Medium auf 70 bis 80 % Konfluenz. Vier Tage vor der hämogenen Induktion das Medium ansaugen und zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.Setzen Sie die Zellen im PSC-Wartungsmedium wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in PSC-Beschichtungsmedium wieder aus.Die PSC-Aufhängung entsprechend den Manuskriptanweisungen auf ein mikrofabriziertes Kunststoffgefäß aufteilen und über Nacht inkubieren. Drei Tage vor der hämogenen Induktion die PSC-Sphäroide vorsichtig in ein 15-Milliliter-Konikonrohr pipetten und zwei Minuten bei Raumtemperatur ausstoßen, um durch die Schwerkraft auszufallen. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Sphäroide in Sphäroid-Beschichtungsmedium wieder auf.Verteilen Sie die Suspension in eine LM511-E8 beschichtete 10-Zentimeter-Kulturschale mit einer Dichte von vier Sphäroiden pro Quadratzentimeter und brüten für drei Tage. Nach drei Tagen, aspirieren Sie das Medium, fügen Sie Tag Null Differenzierung Medium, und Kultur der Zellen für zwei Tage in einem hypoxischen Inkubator. Dann aspirieren Sie das Tages-Null-Medium, fügen Sie Tag zwei Differenzierung medium, und Kultur für weitere zwei Tage.Zwei Tage später das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach der Inkubation dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sie sanft in einem Millimolar EDTA wieder aufsetzen.Übertragen Sie die Suspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 300 Mikrolitern magnetischen Trennpuffer wieder auf. Fügen Sie 100 Mikroliter CD34-positive Mikroperlen zu den Zellen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren.Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten, dann verwenden Sie ein 40 Mikrometer Zellsieb, um die Suspension zu dehnen und trennen Sie die CD34-positiven Zellen mit einem magnetischen Separator. Geben Sie 0,5 Milliliter 5 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin-Beschichtungslösung in jeden Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie die sortierten CD34-positiven Zellen bei 200 mal G für drei Minuten, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter EHT-Medium wieder auf.Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte mit einem Zellzähler, und passen Sie die Zelldichte auf 200 000 Zellen pro Milliliter an, indem Sie EHT-Medium hinzufügen. Die Beschichtungslösung aus den fibronectinbeschichteten Brunnen ansaugen und entsorgen und 0,5 Milliliter CD34-positive Zellsuspension in jeden Brunnen geben. Inkubieren Sie die Zellen im hypoxischen Inkubator für eine Woche.Um die schwimmenden Zellen zu sammeln, übertragen Sie das Kulturmedium auf ein 15 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 200 mal G für drei Minuten. Dann den Überstand ansaugen. Um die anhaftenden Zellen zu sammeln, waschen Sie sie zweimal mit 0,5 Milliliter PBS und spülen Sie sie mit dissoziierendem Puffer.Die überschüssige Flüssigkeit ansaugen und die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Facs-Puffer wieder aus, und mischen Sie die schwebenden und anhaftenden Zellen. Zentrifugieren Sie die Mischzellen bei 200 mal G für drei Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 50 Mikroliter Facs Puffer.Anti-CD34- und Anti-CD45-Antikörper in 50 Mikroliter Facs-Puffer verdünnen; den Zellen hinzufügen und die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, Zentrifugieren bei 200 mal G für drei Minuten nach jeder Wäsche. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 0,5 Milliliter Facs Puffer mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Dappy wieder aus.Messen Sie den CD34- und CD45-Ausdruck nach Durchflusszytometrie. Um die hämatopoetischen Zellen zu sammeln, übertragen Sie das Kulturmedium auf eine 15 Milliliter konische Röhre. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen, indem Sie den Brunnen zweimal mit PBS abspülen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren in einem Milliliter EHT Medium. Nach dem Zählen der Zellen, fügen Sie 10 000 Zellen zu drei Millilitermethylcellulose-Raummedien, ergänzt mit Antibiotika, und verwenden Sie eine 16-Spur-Spritze, um fünfmal zu mischen. Geben Sie die gesamte Medienaufhängung in jeden Brunnen einer Sechs-Well-Platte.Um die Zellen feucht zu halten, fügen Sie Wasser oder PBS zu den leeren Brunnen auf der Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für zwei Wochen, um sicherzustellen, dass die Schale nicht gestört wird, da Kolonien bewegungsempfindlich sind. Zählen Sie nach zwei Wochen die Kolonien unter dem Mikroskop.Zell morphologisch wechseln von endothelialer zu hämatopoetischen Zellen bei Stimulation mit dem hämatopoetischen Cocktail. Hematopoetische Zellkolonien entstehen in der Kultur. Hämatopoetische Vorläuferzellen exprimieren CD34 und CD45, daher wird die Durchflusszytometrie verwendet, um das Vorhandensein von hämatopoetischen Zellkolonien durch die Analyse der Expression von CD34 und CD45 zu bestätigen.Ein koloniebildender Einheitstest zeigte die Erzeugung von Granulozyten oder Makrophagenkolonien aus den CD34-positiven und CD45-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen. Die Koloniezahl wurde auf 38 koloniebildende Einheiten pro 10.000 Zellen geschätzt. Die wichtigsten Schritte sind die Auszählung von PSC-Sphäroiden.Wir haben festgestellt, dass die Oberflächenmetrik der determinantesten Faktor für die Effizienz dieses Protokolls ist. Diesem Verfahren kann die standardisierende Produktion von inergischen Zellen wie natürlich vorkommenden Zellen und Makrophagen folgen. Diese Plattform ermöglicht es Forschern, wichtige deterministische Faktoren in der humanen hämatopoetischen Entwicklung zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...