Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה לאלינה לי ו Seiko Benno על הסיוע הטכני שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לגברת הרמי וואטאנאבה על מתן סיוע מינהלי וד ר פיטר קארגיאניס על עריכת העיתון. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מרכז ליבה של iPS מחקר התא של רשת מרכז המחקר למימוש של רפואה רגנרטיבית מהסוכנות יפן למחקר ופיתוח רפואי (M.K.S.), התוכנית לחקר מחלות סורר ניצול. מחלות ספציפיות כדוריות ה-iPS של M.K.S. (17935423) [] ו המרכז לחדשנות תוכנית של יפן מדע וטכנולוגיה הסוכנות (JST) [R.O. ו M.K.S.].

1. ריאגנטים
<ol><li>קווי תא (אדם PSCs): להשיג תאים גזע עובריים (ESCs) או הקווים iPSC 409B2 ו 201B7 (317-9)) ו CBA11.</li>
	<li>
הכנה מגיב
	<ol>
<li>ציפוי PSC בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 10 μM Y-27632 ולאחסן ב 4 ° c.</li>
		<li>PSC ספרואיד ריצוף בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 625 – 1250 ng/mL אדם רקומביננטי למינציה-511 E8 קטע (LM511-E8) (בהתאם לקו התא) רק לפני השימוש. הערה: LM511-E8 ניתן לערבב ב-media15. מטריצה אחרת כגון באורך מלא-511 צריך להיות מצופה מראש, ואף עשה זאת, הם אינם מקיימים עיבוד מזונואידים בתהליך הבידול.</li>
		<li>יום 0 בידול בינוני: לערבב בינונית בסיס מזועורי עם 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL העצם מורמורגנטית חלבון 4 (BMP4) ו 80 Ng/ml כלי הגידול האנדותל (מנשא).</li>
		<li>יום 2 בידול בינוני: לערבב מדיום בסיס הומוגניים עם 1 μM SB431542, 80 ng/mL ו100 ng/mL תא גזע גורם (SCF).</li>
		<li>הכנת תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>1 מ"מ (EDTA) מאגר החומצה של התרופה: להוסיף 1 מ ל של 0.5 M EDTA כדי 500 mL של PBS.</li>
		<li>Eht בינוני: לערבב המטפיאה מדיום בסיס עם 50 ng/mL scf, 20 ng/ml (tpo), 50 ng/ml fms-הקשורים טירולך קינאז 3 ליגנד (טיסה-3l), 20 ng/mL interleukin-6/אינטרלוקין-6 הקולטן אלפא (il-6/il-6rα), אינסולין-מועבר-סלניום-אתיאנאמין, L-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוריטיצין B.</li>
		<li>מאגר FACS: מערבבים PBS עם סרום עגל עוברי 2% ו 1 מ"מ EDTA.</li>
		<li>הכן מאגר הפרדה מגנטית (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>הכנת מתילצלולוזה מדיה מבוססת (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מבנה המושבה PSC
<ol><li>לגדול hPSCs 70 – 80% שליטה על 0.5 μg ס"מ-2 LM511-E8 מצופה צלחת 6-באר ב mTeSR1 בחממה 37 ° c עם 5% CO2.</li>
	<li>
PSC דיסוציאציה (יום-4)
	<ol>
<li>מטפי את המדיום ושוטף. את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. דגירה ב 37 ° צ' עבור 15 דקות (התאים לא להתייבש בזמן הזה).</li>
		<li>להשעות את התאים במדיום תחזוקה PSC, להעביר את ההשעיה שפופרת בגודל מתאים וצנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. לבשל את הסופרנטאנט ולהשעות את התאים במדיום ציפוי PSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צלחת ההשעיה PSC בצפיפות של 48,000 – 70,000 תאים cm-2 (בהתאם לקו התא) אל כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ו דגירה לילה בחממה 37 ° c עם 5% CO2. הערה: אנו ממליצים 100 μL היטב1 של השעיית תא בכלי פלסטיק 96-היטב מיקרו מפוברק. אתה בדרך כלל זרע 20,000 תאים היטב-1 בצלחת 96-באר כדי להניב כ 100 spheroids.</li>
	<li>
ריצוף PSC הרואידים ב LM511-E8 (יום-3)
	<ol>
<li>לאסוף את PSC spheroids ב 15 מ"ל שפופרת חרוט על ידי ליטוף בעדינות באמצעות P1000 microפיפיטר ולהשאיר את spheroids לעמוד בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות כדי לזרז על ידי כוח הכבידה. . ומכה את הסופרנטאנט</li>
		<li>השהה במדיום ציפוי ספרואיד, לוותר על ההשעיה לתוך הלוח מצופה 6-היטב התרבות בצפיפות של 4-spheroids ס"מ-2 ותרבות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שלושה ימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מעבר הומוגניים (יום 0)
<ol><li>מDay0 את המדיום, להוסיף בינוני ותרבות ב37 ° c בחממה עם 5% O2 ו 5% CO2 (חממה ארוי).</li>
	<li>לאחר יומיים של תרבות ב Day0 בידול בינוני, מרוב המדיום, לאחר מכן להוסיף Day2 בידול בינוני ותרבות בחממה ארוי.</li>
</ol>4. בידוד הומוגניים אנדותל (יום 4)
<ol><li>יומיים לאחר מכן, מטפי את המדיום. ושוטף את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 30 דקות.</li>
	<li>בעדינות להשעות את התאים ב 1 מ"מ EDTA כדי לנתק את הרמה תא בודד, להעביר את ההשעיה לתוך שפופרת 50 mL ו צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. ומתה את supernatant ולהשעות את הגלולה תא עם 300 μl של הפרדה מגנטית אגר.</li>
	<li>הוסף 100 μL של CD34+ מיקרוחרוזי ובעדינות pipet. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להשתמש עד 20,000,000 תאים לכל 100 μL CD34+ חרוזים.</li>
	<li>לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 40 יקרומטר.</li>
	<li>הפרד את התאים CD34+ באמצעות מפריד מגנטי.</li>
</ol>5. אינדוקציה של מעבר אנדותל (EHT)
<ol><li>
ציפוי פיברוטין
	<ol>
<li>הכן את הנפח הנדרש של 5 μg/mL fibronectin פתרון ציפוי על ידי דילול 1 מ"ג/mL fibronectin ב PBS.</li>
		<li>מדבקות 0.5 mL של פתרון הציפוי לתוך כל טוב של לוחית של 24 היטב תרבות. מודקת את הצלחת בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה את CD34+ תאים ממוינים ב 200 x g עבור 3 דקות. השהה מחדש את התא גלולה ב 1 מ ל של מדיום eht.</li>
	<li>קבע את צפיפות התא הקיימא עם מונה התא. כוונן את צפיפות התא ל-200,000 תאים mL-1 על-ידי הוספת מדיום eht.</li>
	<li>מפחית ומפחית את הפתרון ציפוי מתוך הבאר מצופה fibronectin. מדבקות 0.5 mL של CD34+ תא הבולם לתוך כל fibronectin מצופה היטב.</li>
	<li>מודטה בחממה הארוי. לשבוע אחד</li>
</ol>6. הזרמת כדוריות התאים
<ol><li>
אוסף תאים צף: העבר את מדיום התרבות לצינורית חרוטית בגודל 15 מ"ל. צנטריפוגה את המדיום ב 200 x g עבור 3 דקות.. ומכה את הסופרנטאנט</li>
	<li>
אוסף תאים מחסיד
	<ol>
<li>שטוף את התאים עם 0.5 מ ל של PBS פעמיים.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם פתרון הנתק ומכה את הנוזל העודף.</li>
		<li>מודקת את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 5 דקות.</li>
		<li>השהה מחדש את התאים ב-1 mL של מאגר FACS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לערבב את התאים צף תאים חסיד.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב-50 μL של מאגר FACS. דגירה את התאים עם אנטי CD34 ואנטי CD45 נוגדנים עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות. מרוב הסופרנטאנט ולהשעות מחדש ב 0.5 mL של מאגר facs עם 0.5 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול.</li>
	<li>מדידת CD34 ו-CD45 ביטוי על ידי cytometer זרימה.</li>
</ol>7. המושבה היחידה (CFU) שיטת היווצרות תאים מהמטפאות
<ol><li>
מתחת לאוסף התאי המטכיפת: העבירו את המדיום מהתרבות לצינור החרוט בגודל 15 מ"ל. שטוף בעדינות את הבאר פעמיים עם PBS.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב 1 מ ל של מדיום EHT. קבע מספר תא עם מונה התא.</li>
	<li>הוסף נפח השעיה המקבילה של 10,000 תאים 3 מ ל של מתילתאית מדיה מבוססת בתוספת אנטיביוטיקה ומערבבים היטב 5 פעמים עם 16 G או 18 גרם מזרק.</li>
	<li>לוותר על כל מתילתאית מבוססי התקשורת מושעה לתוך כל טוב של צלחת 6-היטב.</li>
	<li>מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שבועיים תוך שמירה על לח. . אל תפריע לצלחת . המושבות רגישות לתנועה</li>
	<li>אחרי שבועיים, תספור את. המושבות מתחת למיקרוסקופ</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells.">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+HSCs+in+vitro:+don't+forget+the+hemogenic+endothelium.">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li><li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li><li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors.">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261 (2011).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

שיטת האינדוקציה שלנו מזינה-ו-xeno-חינם מציעה פלטפורמה מדויקת וחסכונית כדי לגרום לתאים באופן מדרגי. היווצרות נאמן של הומוגניים אנדותל בפרוטוקולים קונבנציונליים10,11,12,13,14 כבר הושפע על ידי חוסר שליטה מדויקת של PSC מושבת צפיפות וגודל, אשר משפיע על היעילות של המורפולדור/cytokine מבוססי בידול מונחה. . בכל אצווה עצמאית מפרוטוקולים קונבנציונליים הפרוטוקול החדש מאפשר רגולציה הדוקה של צפיפות וגודל המושבה של PSC, וכך מתגבר על חוסר העקביות של האינדוקציה האנדוגנית.
אנחנו לנצל את היווצרות במדים של spheroids ולאחר מכן הועברו מזינה-ו-xeno מוגדר תנאי הגדרה לטופס הוא בסך הכל 4 ימים. שהמערך הספרואיד מבטיח. את היווצרות התאים העקביים כתוצאה מייצגת, קווי התא 409B2 הניבו 20.5%-23.6% CD34+ תא יעילות על בסיס שלושה ניסויים עצמאיים. הגורם הקריטי לאריח PSC spheroids הוא LM511-E8. אנחנו לא ממליצים להחליף את זה עם מטריקס אחרים, כגון מטריצות או באורך מלא של מוצרים בחוויות שלנו. הצלחנו להתנתק בקלות ממטג. ולאיבוד בתהליך הבידול וגם לא מטריצות או באורך מלא למינציה לא עוגן תאים ללא ציפוי מראש.
המגבלה הפוטנציאלית של פרוטוקול זה היא שאנחנו תלויים במדיום תחזוקה PSC כדי לשמור על PSCs. , בדקנו מדיה אחרת כגון סטפי. אבל סיכנת השראה כנראה תאים היו עמידים ליציאה ממצב pluripotent בזמן הקצר שלנו (4 ימים) הפרוטוקול האינדוקציה. אם אדם שומר PSCs במדיה אחרת, אנו ממליצים על התאמת תאים במדיום תחזוקה PSC ולנהל כמה מעברים לפני בידול. פלטפורמה זו תאפשר מניפולציה שיטתית וניתוח של תאים, ואת ייצור מחוץ למדף, אינדוקציה בקנה מידה גדול של תאים המטפאות לשימוש קליני פוטנציאלי. מטרה ארוכת טווח של מערכת זו היא לדגמן מחלות כשל חיסוני בדגמי עכבר הומניזציה כדי לחקור את המנגנון הסלולר והמולקולרי האחראי ולבצע הקרנות סמים.

הפיתוח של therapeutics חדש עבור הפרעות המטולוגית והחיסונית כבר הושפע מהעדר פלטפורמות חזקות עבור דוגמנות מחלות והקרנות תפוקה גבוהה ההקרנה עם תאי גזע המטולוגיים אוטולוגיים (HSCs) נגזר מהמטופל תאי גזע פלוריפוטנטי (PSCs). פריצת הדרך של המושרה (i) PSC הטכנולוגיה מחזיקה הבטחה למודל מחלות מתאי המטופלים, אבל הקמתה של HSCs פונקציונלי מiPSCs החולה היה חמקמק. על מנת להפיק HSCs מן האדם PSCs, האינדוקציה הנכונה של החשיבה העובריים ותוכניות הטרנססקריפט הוא מפתח1,2,3,4,5,6, 7,8. ההתקדמות האחרונה בהתפתחות המטתית הוכיחה את תפקידה של הומוגניים (הוא) בפיתוח HSC9. הוא יכול להיגרם מPSCs והוא נוטה להתערבות במורד הזרם כגון העברת גנים10,11,12,13. באמצעות הוא כפלטפורמה, את השילוב של 5 גורמי שעתוק (Erg, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) המושרה בהצלחה HSCs פונקציונלי כי חרט לטווח ארוך ולהבדיל לתוך מספר הגילאים14. עם זאת, הדור המשתנה והלא יעיל של הוא מ PSCs יש לבטח את מניפולציה שיטתית ניתוח של תאים יחד עם הייצור מחוץ למדף, אינדוקציה בקנה מידה גדול של תאים המטבטיים לשימוש קליני.
כאן, אנו מתארים שיטה חסכונית ומדויקת להפיק אותו ב 4 ימים עם מצב מזינה-ו-xeno-חינם מוגדר. בשיטה זו, היווצרות כספרואיד וספונטנית מחדש שיטוח ב iMarix-511 מבטיח צפיפות עקבית של מושבות PSC, אשר חיוני האינדוקציה יעיל של תאים הוא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

הנובעות גזע תפקודי המטופאות ומחולל קדמון (HSPCs) מתאי גזע האדם pluriפוטנטי (PSCs) היו מטרה חמקנית עבור השתלות אוטולוגיים לטיפול הפרעות המטולוגית וממאיר. אנדותל הומוגניים (הוא) היא פלטפורמה קלה לייצר HSPCs פונקציונלי על ידי שעתוק גורמים או כדי לגרום לימפוציטים בצורה איתנה. עם זאת, שיטות נוכחיות להפיק הוא יקר או משתנה בתשואה. בפרוטוקול זה, הקמנו שיטה חסכונית ומדויקת להפיק אותו בתוך 4 ימים במצב מזינה-ונטול xeno-מוגדר. התוצאה שהוא עבר המעבר אנדותל-אל-המטפי והופק CD34+CD45+ כclonogenic ושלתי. הקיבולת הפוטנציאלית של הפלטפורמה שלנו ליצירת HSPCs פונקציונלי יהיו יישומים נרחבים מידול מחלות והקרנה עבור תרכובות טיפוליות.

סכמטית של יצירת מושבות PSC מתוארת באיור 1A. PSC spheroids נוצרות על כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ליום אחד. כתוצאה מייצגת, 20,000 409B2 תאים יכול להיות מטופל לכל 96-גם של כלי פלסטיק מיקרו מפוברק, למרות קווי תאים אחרים עשויים לדרוש צפיפות גבוהה יותר (30000-40000 תאים לכל 96-טוב של כלי פלסטיק מיקרו מפוברק). התחומים הללו משוטחים באופן ספונטני לתרבות כמעט דו-ממדית כאשר הם מצופים בתבשיל תרבות בנוכחות LM511-E8.
תרשים של אינדוקציה הומוגניים מומחש באיור 1B. כאשר PSC מושבות לגדול בקוטר של 750 μm, המדיום שונה ברציפות כדי לגרום לאורגנואידים מזועורי. מושבות PSC יהיה בהדרגה להיות בצד שטוף שמש למעלה מבנה במהלך הבידול כדי מזונואידים הגוף על ידי שינוי בינוני רציפה עד יום 4. ביום 4, הומוגניים אנדותאליה מצוינים באמצעות מיון מגנטי ומצופה לאחר מכן על fibronectin במדיום EHT. 5-10 מיליון CD34+CD45- תאים צפויים מפני spheroids המכיל 1,000,000 PSCs (איור 1c).
הוא ציין כי התאים מורפולוגית לשנות מאנדותל לתאים המטבטיים (וידאו משלים 1). דמות ייצוגית בעלת ניגודיות מלאה של התאים המטבטיים על גירוי בקוקטייל המטפאות ביום 7 מוצג באיור 2A. מושבות התא המטפאות. הופיעו בתרבות
זרם מייצג cy, התוויה העלילה מוצג באיור 2B. התרבות כולה מגורה עם קוקטייל המטופאות וביום 7 מנותח עבור הביטוי של CD34 ו-CD45 על ידי הזרמת cy try. . CD34 וCD45
שיטת CFU הראה את הדור של גרנולוציטים/מקרופאג מושבות מתוך CD34+ CD45+ המטפאות בתאי קדמון (איור 2c). מספר המושבה המשוערת הוא 38 CFU-G/M לתאים 10,000 (איור 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> איור 1: סכמטית של ריצוף מושבות PSC ובידול המטפאות הבאים באמצעות הומוגניים אנדותאליה. (א) תהליך סכמטי של יצירת מושבות PSC. PSCs מתוחזקים על צלחת מצופה מLM511 בגודל 6-E8 במדיום תחזוקה PSC. ביום-4, תאים מנותקים מתנתק לרמה בודדת תא באמצעות פתרון הניתוק, מצופה לאחר מכן על כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ב PSC בינוני תחזוקה עם Y-27632 ומתורבת לילה כדי spheroids טופס. ביום -3, spheroids מצופים במדיום תחזוקה PSC עם LM511-E8 ומתורבת למשך שלושה ימים. לפי יום 0, הספרואידים משוטחים באופן ספונטני לתרבות כמעט דו-ממדית. קנה מידה ברים = 200 μm. (ב) ביום 0, המדיום מוחלף Day0 בידול בינוני ותרבותי בחממה ארוי. ביום השני של הבידול, המדיום מוחלף בDay2 בידול. ביום 4 של העשרה הומוגניים אנדותל, CD34+ תאים הם מיון מגנטית ומתורבת על fibronectin מצופה בצלחת 12-באר ב eht בינונית במשך 6 ימים. (ג) הנציג flowcyCD45 try העלילה של ביטוי CD34 של יום 4 תאים מיון על ידי CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> איור 2: ניתוח של רכוש המטפי. (א) דמות ייצוגית מייצגת בתאי מחולל מצוי לאחר גירוי בקוקטייל המטופאות ביום 7. סרגל בקנה מידה = 200 μm. (ב) זרם מייצג cy, לנסות העלילה של CD45 ו CD34 ביטוי של תרבות שלמה על גירוי עם קוקטייל המטופאות ביום 7. (ג) דמות מייצגת של מושבה של גרנולוציט/מקרופאג שנוצרו מיום 11 בתאי מחולל המטפאות. סרגל קנה מידה = 500 μm. (D) מספר התאים של cfus לכל 10,000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> וידאו משלימים 1: וידאו EHT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

אנו מציעים לייצר תאי דם מתאים גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו מקבלים תשואות עקביות ומדויקות של תאים אנדותל hemogenic. אנו מצפים כי הפלטפורמה שלנו תאפשר יישומים רחבים ניטור מחלות הקרנה עבור תרכובות טיפוליות.טכניקה זו מועילה במיוחד לחקר המטולוגיה ואימונולוגיה. השיטה יכולה להיות מיושמת על התערבות גנטית או עריכת גנים של תאי דם אנושיים. זה מאפשר אינדוקציה קלה של וקטורים בתאי אנדותל hemogenic.הנקודה הקריטית ביותר היא ציפוי LM511-E8 להקלדת מושבות PSC. איננו ממליצים לדלג על הציפוי או להחליף במטריצה אחרת. הדגמות חזותיות חשובות מכיוון שברצוננו להראות כיצד לשטוף את התאים במאגר דיסוציאציה וכיצד לצפות צלחות ב- LM511-E8.לגדל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים או hPSCs בין 70 ל 80%confluency על צלחת LM511-E8 מצופה שש בארות במדיום mTeSR1. ארבעה ימים לפני אינדוקציה hemogenic, שאפו את המדיום לשטוף פעמיים עם PBS. שוטפים את התאים בתת פתרון דיסוציאציה, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.תן שימוש חוזר בתאים במדיום תחזוקה PSC ולהעביר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. שאפו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים במדיום הציפוי של PSC.צלחת ההשעיה PSC על פי הוראות כתב היד על כלי פלסטיק microfabricated, ו דגירה לילה. שלושה ימים לפני אינדוקציה hemogenic, בעדינות pipette spheroids PSC לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולהשאיר אותם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרז על ידי כוח הכבידה. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הכדורואידים במדיום ציפוי כדורי.הפץ את ההשעיה לתוך צלחת תרבות LM511-E8 מצופה 10 ס"מ בצפיפות של ארבעה כדוריות לסנטימטר מרובע ודגירה במשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, שאפו את המדיום, הוסיפו מדיום התברואה של יום אפס, ותרבו את התאים במשך יומיים באינקובטור היפוקסי. לאחר מכן, שאפו את היום אפס בינוני, הוסיפו מדיום ההידול של היום השני, ותרבות ליומיים נוספים.יומיים לאחר מכן, שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS. שוטפים את התאים בתת דיסוציאציה ודולרים במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, נתק את התאים על ידי שימוש חוזר בעדינות בהם ב- EDTA מילימולרי אחד.מעבירים את ההשעיה לצינור חרוט 50 מיליליטר, וצנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. שאף את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת התא עם 300 מיקרוליטרים של חיץ הפרדה מגנטית. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיידקים חיוביים ל-CD34 לתאים, וערבבו בעדינות על-ידי צינורות.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן להשתמש מסננת תא 40 מיקרומטר כדי לאמץ את ההשעיה ולהפריד את התאים החיוביים CD34 באמצעות מפריד מגנטי. לוותר על 0.5 מיליליטר של 5 מיקרוגרם לכל מיליליטר פיברונקטין ציפוי פתרון לתוך כל באר של צלחת תרבות 24 היטב, ולהדקר את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. בינתיים, צנטריפוגה תאים חיוביים CD34 ממוין ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות, ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של מדיום EHT.קבע את צפיפות התאים בת קיימא באמצעות מונה תאים והתאם את צפיפות התא ל- 200, 000 תאים למיליליטר על-ידי הוספת מדיום EHT. שאפו והשליכו את תספורת הציפוי מה בארות מצופות הפיברונאטין, ופונו 0.5 מיליליטר של מתלי תאים חיוביים CD34 לכל באר. דגירה התאים באינקובטור היפוקסי במשך שבוע.כדי לאסוף את התאים הצפים, להעביר את מדיום התרבות לצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות. אז שאף את העל-טבעי. כדי לאסוף את התאים חסידים, לשטוף אותם פעמיים עם 0.5 מיליליטר של PBS, ולשטוף אותם עם חיץ דיסוציאטיבי.שאפו את הנוזל העודף והגררו את הצלחת ב-37 מעלות במשך חמש דקות. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מאגר Facs וערבב את התאים הצפים והחסידים. צנטריפוגה התאים המעורבים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות, ואז לשאוף את supernatant ו resuspend התאים ב 50 microliters של מאגר Facs.לדלל נוגדנים נגד CD34 ואנטי CD45 ב 50 microliters של מאגר Facs;להוסיף אותם לתאים דגירה התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות לאחר כל לשטוף. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים ב- 0.5 מיליליטר של מאגר Facs עם 0.5 מיקרוגרם למיליליטר דאפי.מדוד ביטוי CD34 ו- CD45 לפי ציטומטריית זרימה. כדי לאסוף את התאים hematopoietic, להעביר את מדיום התרבות לצינור חרוט 15 מיליליטר. לאסוף את התאים הנותרים על ידי שטיפה עדין של באר פעמיים עם PBS.צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G במשך שלוש דקות ואז לשאוף את supernatant ו resuspend במיליליטר אחד של מדיום EHT. לאחר ספירת התאים, להוסיף 10, 000 תאים לשלושה מיליליטר של מדיה במים methylcellulose, בתוספת אנטיביוטיקה, ולהשתמש מזרק מד 16 לערבב חמש פעמים. לוותר על כל ההשעיה התקשורתית לתוך כל באר של צלחת שש בארות.כדי לשמור על התאים לחים, מוסיפים מים או PBS ל בארות הריקות על הצלחת. דגירה התאים במשך שבועיים, הקפדה לא להפריע את המנה כמו מושבות רגישים לתנועה. אחרי שבועיים, לספור את המושבות תחת מיקרוסקופ.התא משתנה מורפולוגית מתאי אנדותל להמטופוטויטיים עם גירוי עם הקוקטייל המטופויטי. מושבות תאים hematopoietic להגיח בתרבות. תאים מולדים hematopoietic אקספרס CD34 ו CD45, כך cytometry זרימה משמש כדי לאשר את נוכחותם של מושבות תא hematopoietic על ידי ניתוח ביטוי של CD34 ו CD45.אסיאת יחידה יוצרת מושבה הדגימה את הדור של גרנולוציטים או מושבות מקרופאג' מהתאים ההמוטופיים החיוביים של CD34 ו- CD45 חיוביים. מספר המושבה הוערך ב-38 יחידות יוצרות מושבה לכל 10,000 תאים. הצעדים המכריעים ביותר הם מספירת כדורי PSC.מצאנו כי מדד פני השטח הוא הגורם דטרמיניסטי ביותר ביעילות של פרוטוקול זה. הליך זה יכול להיות מלווה על ידי ייצור מחוץ למדף של תאים לא כירורגיים כגון תאים המתרחשים באופן טבעי מקרופאגים. פלטפורמה זו מאפשרת לחוקרים לחקור גורמים דטרמיניסטיים מרכזיים בהתפתחות ההמוטופיטית האנושית.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...