Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Мы благодарны Алине Ли и Сейко Бенно за техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить г-жу Харуми Ватанабэ за оказание административной помощи и д-ра Питера Карагианниса за редактирование документа. Эта работа была поддержана основным Центром исследований ячеек IPS Исследовательского центра сети по реализации регенеративной медицины от Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED) «M.K.S.», Программы исследований неразрешимых болезней Используя. Специфические для болезней клетки iPS AMED (17935423) «M.K.S.» и Программа Центра инноваций Японского научно-технического агентства (JST) «R.O. и M.K.S.».

1. Реагенты
<ol><li>Клеточные линии (человеческие ПСК): получают либо эмбриональные стволовые клетки (ESC) или линии iPSC 409B2 и 201B7 (317-9)) и CBA11.</li>
	<li>
Подготовка реагента
	<ol>
<li>PSC покрытие среды: смешать PSC техническое обслуживание среды с 10 ММ Y-27632 и хранить при 4 c.</li>
		<li>PSC SpC Spheroid плитка среды: смешать PSC техническое обслуживание среды с 625-1,250 нг/мл человека рекомбинантНый Laminin-511 E8 фрагмент (LM511-E8) (в зависимости от клеточной линии) непосредственно перед использованием. ПРИМЕЧАНИЕ: LM511-E8 можно смешивать в сми15. Другие матрицы, такие как полнометражный ламинин-511, должны быть предварительно покрыты, и даже сделали это, они не поддерживают мезодермальные органоиды, применяемые в процессе дифференциации.</li>
		<li>Среда дифференциации дня 0: смесь мезодермальной базальной среды с 2 мкм CHIR99021, 80 нг/мл морфогенетического белка кости 4 (BMP4) и 80 нг/мЛ Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).</li>
		<li>Среда дифференциации дня 2: смешайте гемогечную базальную среду с 1 qM SB431542, 80 нг/мл VEGF и 100 нг/мл фактор стволовых клеток (SCF).</li>
		<li>Подготовка фосфатного буфера сольников (PBS) без кальция или магния (см. Таблицаматериалов).</li>
		<li>1 мМ этиленедиаминетететацетокислота (ЭДТА) буфер: добавить 1 мл 0,5 М EDTA до 500 мл PBS.</li>
		<li>EHT средний: смесь гематопоиетическая базальная среда с 50 нг/мЛ SCF, 20 нг/мЛ тромбопоэтина (TPO), 50 нг/мЛ FMs связанных тирозина киназы 3 лиганд (Flt-3L), 20 нг/мЛ Интерлейкин-6/Интерлейкин-6-рецептор (IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-6/IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL-IL- инсулин-трансферрин-селениум-этаноламин, L-глутамин и пенициллин/стрептомицин/Амфотерицин В.</li>
		<li>FACS буфер: смесь PBS с 2% сыворотки плода теленка и 1 мМ EDTA.</li>
		<li>Подготовка магнитного буфера разделения (см. Таблица материалов).</li>
		<li>Подготовка метилцеллюлозы на основе средств массовой информации (см. Таблица материалов).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Формирование колонии PSC
<ol><li>Выращивайте hPSCs до 70 - 80% вытежки на 0,5 мкг см-2 LM511-E8-покрытие 6-колодная пластина в mTeSR1 в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.</li>
	<li>
PSC диссоциации (День -4)
	<ol>
<li>Аспирируй среду и мыть клетки с PBS в два раза. Промыть клетки диссоциационным раствором. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин (клетки не будут осевкить в это время).</li>
		<li>Приостановить клетки в среде обслуживания PSC, передать подвеску в соответствующий размер трубки и центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспирировать супернатант и приостановить клетки в PSC покрытие среды.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Плита PSC подвески при плотности 48000 - 70000 клеток см-2 (в зависимости от клеточной линии) на микро-изготовлены пластиковый сосуд и инкубировать на ночь в 37 C инкубатор с 5% CO2. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем 100 л хорошо-1 клеточной подвески в 96-хорошо микро-изготовленного пластикового сосуда. Вы, как правило, семена 20000 клеток хорошо-1 в 96-хорошо пластины, чтобы дать около 100 сфероидов.</li>
	<li>
Плитка PSC сфероидов на LM511-E8 (День -3)
	<ol>
<li>Соберите PSC сфероидов в 15 мл конической трубки, мягко pipetting с помощью микропипеттера P1000 и оставить сфероидов стоять при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы осадок под действием силы тяжести. Аспирируй супернатанта.</li>
		<li>Приостановить в сфероидных покрытий среды, обойтись подвески в непокрытие 6-хорошо культуры пластины при плотности 4-сфероидов см-2 и культуры в 37 КК инкубатор с 5% CO2 в течение трех дней.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Гемогенная индукция (День 0)
<ol><li>Прибавьте среду, добавьте среду дифференциации Day0 и культуру в инкубатор 37 градусов с 5% O2 и 5% CO2 (гипоксический инкубатор).</li>
	<li>После двух дней культуры в Day0 дифференциации среды, аспирировать среды, а затем добавить Day2 дифференциации среды и культуры в гипоксическом инкубаторе.</li>
</ol>4. Изоляция гемогенного эндотелия (День 4)
<ol><li>Два дня спустя, аспирируя среды и мыть клетки с PBS в два раза. Промыть клетки диссоциационным раствором. Инкубировать в инкубаторе 37 градусов с 5% CO2 в течение 30 мин.</li>
	<li>Аккуратно приостановить клетки в 1 мМ EDTA, чтобы отделиться от одноклеточного уровня, передать подвеску в 50 мл конической трубки и центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспир супернатант и приостановить клеточной гранулы с 300 л магнитного разделения Буфера.</li>
	<li>Добавьте 100 кл. микрошариков CD34и аккуратно пипетку. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Можно использовать до 20 миллионов ячеек на 100 л CD34и бусы.</li>
	<li>Фильтр подвески через 40 мкм ячейки ситечко.</li>
	<li>Отделите клетки CD34с помощью магнитного сепаратора.</li>
</ol>5. Индукция эндотелиального к гематопогетному переходу (EHT)
<ol><li>
Фибронектин покрытие
	<ol>
<li>Подготовьте необходимый объем 5 мкг/мл фибронектина-покрытия раствора путем разбавления 1 мг/мл фибронектина в PBS.</li>
		<li>Распределите 0,5 мл покрытия раствора в каждой скважине из 24-хорошо культуры пластины. Инкубировать тарелку при комнатной температуре 30 мин.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge отсортированных клеток CD34на 200 х г в течение 3 мин. Отрежируйте клеточные гранулы в 1 мл среды EHT.</li>
	<li>Определите жизнеспособную плотность клеток с помощью клеточного счетчика. Отрегулируйте плотность клеток до 200 000 мл мл-1, добавив среду EHT.</li>
	<li>Аспирировать и отбрасывать покрытие раствор из фибронектина покрытием хорошо. Распределить 0,5 мл CD34и клеточной подвески в каждом фибронектин покрытием хорошо.</li>
	<li>Инкубировать в гипоксическом инкубаторе в течение одной недели.</li>
</ol>6. Анализ цитометрии потока гематопоатических клеток
<ol><li>
Плавающая коллекция ячеек: Перенесите среду культуры в коническую трубку 15 мл. Центрифуги среды на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант.</li>
	<li>
Коллекция клеток адепта
	<ol>
<li>Вымойте клетки с 0,5 мл PBS в два раза.</li>
		<li>Промыть клетки разъединяющим раствором и аспирировать излишки жидкости.</li>
		<li>Инкубировать тарелку в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.</li>
		<li>Приостанавливай те ячейки в 1 мл буфера FACS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Смешайте плавающие клетки и клетки адептов.</li>
	<li>Центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант. Повторное действие в 50 зл буфера FACS. Инкубировать клетки анти-CD34 и анти-CD45 антителами на 1 ч при комнатной температуре в темноте.</li>
	<li>Вымойте клетки с PBS дважды и центрифуги на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант и повторно в 0,5 мл буфера FACS с 0,5 мкг /мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол.</li>
	<li>Измерьте экспрессию CD34 и CD45 по цитометропотокам потока.</li>
</ol>7. Колония Формирование единицы (CFU) Асса гематопоитических клеток
<ol><li>
Коллекция гематопоитических клеток: Перенос среды из культуры в коническую трубку 15 мл. Аккуратно промыть колодец дважды с ПОМОЩЬю PBS.</li>
	<li>Центрифуги клетки на 200 х г в течение 3 мин. Аспирируй супернатант. Повторно ездовка в 1 мл среды EHT. Определите номер ячейки с помощью клеточного счетчика.</li>
	<li>Добавьте объем подвески, эквивалентный 10 000 клеток, до 3 мл средств массовой информации на основе метилцеллюлозы, дополненных антибиотиками, и хорошо перемешайте 5 раз со шприцем 16 G или 18 G.</li>
	<li>Распределите всю метилцеллюлозу основе медиа подвески в каждой скважине из 6-колодец пластины.</li>
	<li>Инкубировать в инкубаторе 37 градусов с 5% CO2 в течение двух недель, сохраняя при этом влажный. Не мешайте блюду. Колонии чувствительны к движению.</li>
	<li>Через две недели посчитайте колонии под микроскопом.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells.">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+HSCs+in+vitro:+don't+forget+the+hemogenic+endothelium.">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li><li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li><li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors.">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261 (2011).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Наш метод индукции без фидера и ксено предлагает точную и экономичную платформу для вывоза клеток HE масштабируемым образом. Точное образование гемогенного эндотелия в обычных протоколах10,11,12,13,14 было затруднено из-за отсутствия точного контроля плотности и размера колонии ПСК, которая влияет на эффективность дифференциации направленной на основе морфогена/цитокинов. Мы испытали несоответствие индукции гемогенного эндотелия в каждой независимой партии от обычных протоколов. Новый протокол позволяет жестко регулировать плотность и размер колонии PSC, таким образом, преодолевает несоответствие индукции гемогенного эндотелия.
Мы использовали униформу формирования сфероидов, а затем передал фидер- и ксено-свободного определенного состояния, чтобы сформировать его в общей сложности 4 дней. Мы подтвердили, используя три независимые клеточные линии, что сфероид образования обеспечивает последовательное образование клеток He. В результате 409B2 клеточные линии дали 12,7%-23,6% эффективности клеток CD34 на основе трех независимых экспериментов. Критическим фактором для плитки PSC сфероидов является LM511-E8. Мы не рекомендуем заменять это с другими матрицами, такими как Matrigel или полнометражные продукты ламинина в нашем опыте. Мы испытали, что мезодермальные органоиды были легко отделены от Matrigel и потеряны в процессе дифференциации. И ни matrigel, ни полнометражный ламинин не закрепляют клетки без предварительного покрытия.
Потенциальное ограничение этого протокола заключается в том, что мы зависим от среды обслуживания PSC для поддержания PSCs. Мы протестировали другие носители, такие как StemFit, но мы скомпрометировали гемогенную индукцию. Предположительно клетки были устойчивы к выходу из плюрипотентного состояния в нашем коротком времени (4 дня) индукционного протокола. Если один поддерживает PSCs в других средствах массовой информации, мы рекомендуем адаптировать клетки в среде обслуживания PSC и провести несколько проходов до дифференциации. Эта платформа позволит систематические манипуляции и анализа клеток, а также готовые производства и крупномасштабной индукции гематопоэтиных клеток для потенциального клинического использования. Долгосрочной целью этой системы является моделирование заболеваний иммунодефицита в гуманизированных моделях мышей для исследования ответственных клеточных и молекулярных механизмов и проведения скринингов лекарственных средств.

Разработка новых терапевтических средств для лечения гематологических и иммунологических расстройств затруднена отсутствием надежных платформ для моделирования заболеваний и высокой пропускной проликворемой скрининга лекарственных средств с аутологичными гематопоитическими стволовыми клетками (ГСК), полученными от пациента плюрипотентных стволовых клеток (ПСЦ). Прорыв индуцированной (i)PSC технологии обещает моделировать болезни из клеток пациентов, но создание функциональных HSCs от пациента iPSCs было неуловимым. Для того, чтобы получить HSCs из человека PSCs, надлежащей индукцииэмбриональных моделей и транскрипционных программ является ключевым 1,2,3,4,5,6, 7,8. Недавний прогресс в гематопоическом развитии продемонстрировал роль гемогенного эндотелия (HE) в развитии HSC9. Он может быть индуцирован из PSCs и поддается вниз по течению вмешательства, такие как передача генов10,11,12,13. Используя HE в качестве платформы, сочетание 5 транскрипционных факторов(ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) успешно индуцированных функциональных HSCs, которые прививают долгосрочные и дифференцировать в несколько линий14. Однако переменная и неэффективная генерация ЛГ из ЧоС препятствует систематическому манипуляции и анализу клеток наряду с готовым производством и крупномасштабной индукцией гематопогетических клеток для клинического использования.
Здесь мы описываем экономически эффективный и точный метод получения he в течение 4 дней с фидером- и ксено-свободного определенного состояния. В этом методе, сфероид образования и спонтанного повторного уплощения на iMarix-511 обеспечивает последовательную плотность psC колоний, что имеет решающее значение для эффективной индукции клеток ЕГ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

Получение функциональных гематопоитических стволовых клеток и клеток-прародителей (HSPCs) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) было неуловимой целью для аутологичных трансплантаций для лечения гематологических и злокачественных расстройств. Гемогенный эндотелий (HE) является поддающейся платформе для производства функциональных HSPCs по транскрипции факторов или индуцировать лимфоциты в надежной манере. Тем не менее, текущие методы получения HE являются дорогостоящими или переменной в выходе. В этом протоколе мы разработали экономичный и точный метод получения HE в течение 4 дней в фидер- и ксено-свободноопределенном состоянии. В результате он прошел эндотелиальный к гематопоическому переходу и произвел CD34иCD45- клоногенные гематопоиетические прародители. Потенциальная способность нашей платформы для генерации функциональных HSPCs будет иметь широкое применение в моделировании заболеваний и скрининге терапевтических соединений.

Схема формирования колоний ПСК изображена на рисунке 1A. PSC сфероиды образуются на микро-изготовлены пластиковые сосуды в течение одного дня. В результате 20 000 409B2 клеток могут быть обработаны на 96-ну хорошо микро-изготовленного пластикового сосуда, хотя другие клеточные линии могут потребовать более высокой плотности (30 000-40 000 клеток на 96-ну микро-изготовленного пластикового сосуда). Эти сферы спонтанно сплющены к почти двумерной культуре, когда покрываются на блюдо культуры в присутствии LM511-E8.
Схема гемогенной индукции иллюстрируется на рисунке 1B. Когда колонии PSC растут до диаметра 750 мкм, среда последовательно изменяется, чтобы вызвать мезодермальные органоиды. Колонии PSC постепенно станут солнечной стороной вверх структура во время дифференциации к mesodermal органоидам последовательным средним изменением до дня 4. На 4-й день гемогеновые эндотелии определяются из мезодермальных органоидов магнитной сортировкой и затем покрываются фибронектином в среде EHT. 5-10 миллионов CD34иCD45- клетки, как ожидается, от сфероидов, содержащих 1 миллион PSCs (рисунок1C).
Отмечается, что клетки морфологически меняются от эндотелиальных к гематопогетическим клеткам(Дополнительное видео 1). Репрезентативное фазово-контрастное изображение клеток гематопоиетического прародителя при стимуляции гематопоиетическим коктейлем на 7-й день показано на рисунке 2A. В культуре появились колонии гематопоитических клеток.
Представительный участок цитометрии потока показан на рисунке 2B. Вся культура стимулируется гематопоитическим коктейлем и на 7-й день анализируется на выражение CD34 и CD45 цитометрией потока. Клетки гематопоиетического прародителя выражают CD34 и CD45.
Анализ CFU показал, что поколение гранулоцитов/макрофагов колоний из CD34и CD45- гематопоиетических клеток-прародителей (рисунок2C). Расчетное число колоний составляет 38 CFU-G/M на 10 000 клеток(рисунок 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Схема черепичных колоний ПСК и последующая гематопоитическая дифференциация через гемогеновые эндотелии. (A) Схематический процесс формирования колоний PSC. PSC поддерживаются на LM511-E8 покрытием 6-колодец пластины в PSC техническое обслуживание среды. На день -4, клетки отделены и отделены к одноклеточному уровню используя dissociating разрешение, затем покрывающ на микро-изготовленном пластичном сосуде в средстве обслуживания PSC с Y-27632 и культивированы всю ночь для того чтобы сформировать spheroids. На день -3, сфероиды покрываются в PSC обслуживания среды с LM511-E8 и культивируется в течение трех дней. К 0-му дню сфероиды спонтанно сплющиваются к почти двумерной культуре. Шкала баров 200 мкм. (B) На день 0, среда заменяется Day0 дифференциации среды и культивируется в гипоксическом инкубаторе. На второй день дифференциации, среда заменяется Day2 дифференциации среды. На 4-й день обогащения гемогенного эндотелия, клетки CD34и магнитно отсортированы и культивируются на фибронектин-покрытие 12-колодцов пластины в среде EHT в течение 6 дней. (C) Представитель flowcytometry сюжет CD45 и CD34 выражение дня 4 клетки отсортированы по CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> Рисунок 2: Анализ гематопоитического свойства. (A) Представитель фазово-контрастное изображение клеток гематопоиетического прародителя после стимуляции гематопойетическим коктейлем на 7-й день. Шкала бар 200 мкм. (B) Представитель потока цитометрии сюжет CD45 и CD34 выражение всей культуры при стимуляции с гематопогетическим коктейлем на 7-й день. (C) Представитель фазового контрастного изображения гранулоцитов / макрофаг колонии порожденных из 11 гематопоиетических клеток-прародителей. Шкала бар 500 мкм. (D) Количество CFUs на 10000 клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> Дополнительное видео 1: Видео EHT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Гемогенная дифференциация эндотелия от стволовых клеток человека в Feeder- и Ксено-свободноопределенное состояние

Здесь мы представляем протокол, чтобы точно сформировать гемогенный эндотелий из человеческих плюрипотентных стволовых клеток в кормушки и ксено-свободного состояния. Этот метод будет иметь широкое применение в моделировании заболеваний и скрининге терапевтических соединений.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Мы предлагаем производить клетки крови из плюрипотентных стволовых клеток человека. Основным преимуществом этой техники является то, что мы получаем последовательные и точные урожаи гемогенных эндотелиальных клеток. Мы ожидаем, что наша платформа позволит широко использовать в мониторинге заболеваний и скрининге терапевтических соединений.Этот метод особенно полезен для гематологических и иммунологических исследований. Метод может быть применен к генетическому вмешательству или редактированию генов клеток крови человека. Это позволяет легко индукции векторов в гемогенных эндотелиальных клеток.Наиболее важным моментом является покрытие LM511-E8 для ввода колоний PSC. Мы не рекомендуем пропускать покрытие или заменять другой матрицей. Визуальные демонстрации важны, потому что мы хотим показать, как промыть клетки с буфером диссоциации и как покрыть пластины с LM511-E8.Выращиваем плюрипотентные стволовые клетки человека или ГПСК до 70-80% на пластине с покрытием LM511-E8 в среде mTeSR1. За четыре дня до гемогенной индукции, аспирировать средний и мыть дважды с PBS. Промыть клетки раствором диссоциации и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут.Перепробовать клетки в среде обслуживания PSC и перенести подвеску в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку. Центрифуга клетки при 200 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатант, и повторного перерасхода клеток в PSC покрытие среды.Плита подвески PSC в соответствии с рукописными указаниями на микрофабрикаты пластикового сосуда, и инкубировать в одночасье. За три дня до гемогенной индукции, аккуратно пипетки сфероидов PSC в 15 миллилитров конической трубки и оставить их на две минуты при комнатной температуре, чтобы осадки под действием силы тяжести. Аспирировать супернатант и повторно высасывания сфероидов в сфероидных покрытия среды.Распределите суспензию на блюдо культуры LM511-E8 с 10-сантиметровым покрытием при плотности четыре сфероида на квадратный сантиметр и инкубировать в течение трех дней. Через три дня, аспирировать среды, добавить день нулевой дифференциации среды, и культуры клеток в течение двух дней в гипоксический инкубатор. Затем, аспирировать день нулевой среды, добавить день два дифференциации среды, и культуры еще на два дня.Два дня спустя, аспирировать среды и мыть клетки дважды с PBS. Промыть клетки раствором диссоциации и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. После инкубации отмежеваться от клеток, мягко resuspending их в один миллимолярд EDTA.Перенесите суспензию в 50 миллилитровую коническую трубку и центрифуга клетки в 200 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатант и повторно поместью клеточной гранулы с 300 микролитров магнитного буфера разделения. Добавьте 100 микролитров CD34-положительных микробусов в клетки и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем использовать 40 микрометровый ситечко клетки для деформации подвески и отделить CD34-положительных клеток с помощью магнитного сепаратора. Выделять 0,5 миллилитров по 5 микрограмм на миллилитр фибронектин покрытие раствора в каждый колодец 24 хорошо культуры пластины, и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут. Между тем, центрифуга отсортированных CD34-положительных клеток в 200 раз G в течение трех минут, и повторно гранулы в один миллилитр ЭГТ среды.Определите жизнеспособную плотность клеток с помощью клеточного счетчика и отрегулируйте плотность клеток до 200 000 клеток на миллилитр, добавив среду EHT. Аспират и отказаться от покрытия раствор из фибронектина покрытием скважин, и обойтись 0,5 миллилитров CD34-положительной клеточной подвески в каждой скважине. Инкубировать клетки в гипоксический инкубатор в течение одной недели.Чтобы собрать плавающие клетки, перенесите культурную среду в 15 миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 200 Г в течение трех минут. Затем аспирировать супернатанта. Чтобы собрать адепт клетки, мыть их дважды с 0,5 миллилитров PBS, и промыть их с разобщающих буфера.Аспирировать излишки жидкости и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Переусейте клетки в одном миллилитре буфера Facs и смешайте плавающие и приверженные клетки. Центрифуга смешанных клеток в 200 раз G в течение трех минут, а затем аспирировать супернатант и повторного перерасхода клеток в 50 микролитров буфера Facs.Разбавить анти-CD34 и анти-CD45 антител в 50 микролитров буфера Facs;добавить их в клетки и инкубировать клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Затем, мыть клетки дважды с PBS, центрифугирование в 200 раз G в течение трех минут после каждого мытья. Аспирировать супернатант и повторно изымать клетки в 0,5 миллилитров буфера Facs с 0,5 микрограмма на миллилитр dappy.Измерьте выражение CD34 и CD45 по цитометрии потока. Чтобы собрать гематопоэтические клетки, перенесите культурную среду в 15 миллилитровую коническую трубку. Соберите оставшиеся клетки, аккуратно полоскания хорошо в два раза с PBS.Центрифуга клеток в 200 раз G в течение трех минут, то аспирировать супернатант и повторно в один миллилитр ЭГТ среды. После подсчета клеток, добавить 10000 клеток до трех миллилитров метилцеллюлозы пространства средств массовой информации, дополненные антибиотиками, и использовать 16 калибровочный шприц, чтобы смешать пять раз. Разпределите всю подвеску мультимедиа в каждый колодец из шести хорошо пластины.Чтобы сохранить клетки влажными, добавить воду или PBS в пустые колодцы на тарелке. Инкубировать клетки в течение двух недель, убедившись, что не беспокоить блюдо, как колонии движения чувствительны. Через две недели посчитайте колонии под микроскопом.Морфологически клетки меняются от эндотелиальных к гематопоэтическим клеткам при стимуляции гематопоэтическим коктейлем. Гематопоэтические клеточные колонии возникают в культуре. Гематопоэтические клетки-предшественники выражают CD34 и CD45, поэтому цитометрия потока используется для подтверждения присутствия гематопоэтических клеточных колоний путем анализа экспрессии CD34 и CD45.Анализ единицы колонии продемонстрировал генерацию гранулоцитов или колоний макрофагов из CD34-положительных и CD45-положительных гематопоэтических клеток-предшественников. Численность колонии оценивалась в 38 колоний, образующих единицы на 10 000 камер. Наиболее важными шагами являются подсчет сфероидов PSC.Мы обнаружили, что поверхностный показатель является наиболее детерминистским фактором эффективности этого протокола. За этой процедурой может последовать производство готовых инертических клеток, таких как естественные клетки и макрофаги. Эта платформа позволяет исследователям исследовать ключевые детерминистские факторы в развитии гематопоэтического человека.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Прямая индукция гемогенного эндотелия и крови сверхэкспрессией факторов транскрипции в человека плюрипотентные стволовые клетки

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческой периферической Т-клеток с использованием вируса Сендай в фидерной бесплатно условиях

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Определенных Xeno бесплатно и фидер свободной культуры условия для моделей клеток поколения прав человека iPSC производные сетчатки

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...