Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Vi är tacksamma för Alina Li och Seiko Benno för deras tekniska assistans. Vi vill också tacka MS Harumi Watanabe för att ge administrativt stöd och Dr Peter Karagiannis för att redigera papperet. Detta arbete stöddes av Core Center för iPS cell Research av Research Center nätverk för förverkligande av regenerativ medicin från Japan Agency för medicinsk forskning och utveckling (AMED) [M.K.S.], programmet för Svårsmittat sjukdomar forskning Använda. Sjukdomsspecifika iPS-celler från AMED (17935423) [M.K.S.] och Center for innovation-programmet för Japans vetenskaps-och teknik byrå (JST) [R.O. och M.K.S.].

1. reagenser
<ol><li>Cellinjer (Human PSCs): skaffa antingen embryonala stamceller (ESCs) eller iPSC Lines 409B2 och 201B7 (317-9)) och CBA11.</li>
	<li>
Beredning av reagens
	<ol>
<li>PSC bordläggningen medium: blanda PSC underhålls medium med 10 μM Y-27632 och lagra vid 4 ° c.</li>
		<li>PSC spheroid plattsättning medium: mix PSC underhålls medium med 625 – 1250 ng/mL humant rekombinant laminin-511 E8 fragment (LM511-E8) (beroende på cellinjen) strax före användning. Anmärkning: LM511-E8 kan blandas i media15. Annan matris såsom ful längds laminin-511 måste vara pre-Coated, och även gjorde det, de inte upprätthålla mesodermala organoider följs under differentierings processen.</li>
		<li>Dag 0 differentiering medium: blanda Mesodermal basal medium med 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL benmorfogenetiska protein 4 (BMP4) och 80 ng/ml vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF).</li>
		<li>Dag 2 differentierings medium: blanda Hemogent basal medium med 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF och 100 ng/mL stamcells faktor (SCF).</li>
		<li>Förbered fosfatbuffertsaltlösning (PBS) utan kalcium eller magnesium (se material tabell).</li>
		<li>1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert: tillsätt 1 mL 0,5 M EDTA till 500 mL PBS.</li>
		<li>EHT medium: blanda hematopoetiskt basal medium med 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL trombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-relaterad tyrosinkinas 3 ligand (flt-3L), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6 receptor alfa (IL-6/IL-6Rα), insulin-transferrin-selen-etanolamin, L-glutamin och penicillin/streptomycin/amfotericin B.</li>
		<li>FACS buffert: blanda PBS med 2% Foster kalv serum och 1 mM EDTA.</li>
		<li>Förbered magnetisk separeringbuffert (se material tabell).</li>
		<li>Förbered metylcellulosabaserade medier (se material tabell).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSC-Kolonibildning
<ol><li>Växa hPSCs till 70 – 80% sammanlänkning på en 0,5 μg cm-2 LM511-E8-belagd 6-well plattan i mTeSR1 i en 37 ° c inkubator med 5% co2.</li>
	<li>
PSC-dissociation (dag-4)
	<ol>
<li>Aspirera mediet och tvätta cellerna med PBS två gånger. Skölj cellerna med dissociationslösning. Inkubera vid 37 ° c i 15 minuter (cellerna kommer inte att torkas ut i denna tid).</li>
		<li>Suspendera cellerna i PSC-underhållsmediet, överför SUS pensionen till ett lämpligt stort rör och centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten och suspendera CELLERNA i PSC-pläteringsmediet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platta KUSP SUS pensionen med en densitet av 48 000 – 70 000 celler cm-2 (beroende på cellinjen) på ett Micro-fabricerade plast kärl och inkubera över natten i den 37 ° c inkubator med 5% co2. Anmärkning: Vi rekommenderar 100 μL brunn-1 cell SUS pension i ett 96-väl Micro-fabricerade plast fartyg. Du kommer vanligt vis utsäde 20 000 celler well-1 i en 96-well plattan för att ge cirka 100 sfäroider.</li>
	<li>
Tiling PSC sfäroider på LM511-E8 (Dag-3)
	<ol>
<li>Samla PSC-sfäroiderna i ett 15 mL koniskt rör genom att försiktigt Pipettera med P1000 micropipetter och låt sfäroiderna stå i rums temperatur i 2 minuter för att fällas ut genom gravitation. Aspirera supernatanten.</li>
		<li>Suspendera i sfäroiden plätering medium, Dispensera SUS pensionen i en icke-belagd 6-well kultur plattan med en densitet av 4-sfäroider cm-2 och kultur i 37 ° c inkubator med 5% co2 för tre dagar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hemogen induktion (dag 0)
<ol><li>Aspirera mediet, tillsätt Day0 differentiering medium och kultur i 37 ° c inkubator med 5% O2 och 5% co2 (hypoxic inkubator).</li>
	<li>Efter två dagars kultur i Day0 differentiering medium, aspirera mediet, tillsätt sedan dag2 differentiering medium och kultur i hypoxisk inkubator.</li>
</ol>4. isolering av Hemogent Endotelium (dag 4)
<ol><li>Två dagar senare, aspirera mediet och tvätta cellerna med PBS två gånger. Skölj cellerna med dissociationslösning. Inkubera i 37 ° c med 5% CO2 under 30 min.</li>
	<li>Suspendera försiktigt cellerna i 1 mM EDTA för att separera till encellig nivå, överför SUS pensionen till ett 50 mL koniskt rör och centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten med 300 μl magnetisk separation Buffert.</li>
	<li>Tillsätt 100 μl CD34+ mikrokorn och försiktigt pipet. Inkubera i 30 minuter i rums temperatur. Upp till 20 000 000 celler per 100 μL CD34+ pärlor kan användas.</li>
	<li>Filtrera SUS pensionen genom en 40 μm cell sil.</li>
	<li>Separera CD34+ -cellerna med hjälp av en magnetisk separator.</li>
</ol>5. induktion av Endotelial till hematopoetisk över gång (EHT)
<ol><li>
Fibronectin-beläggning
	<ol>
<li>Bered den erforderliga volymen av 5 μg/ml Fibronektin-beläggnings lösning genom spädning av 1 mg/ml Fibronektin i PBS.</li>
		<li>Fördela 0,5 mL av beläggnings lösningen i varje brunn i en 24-vältodlings platta. Inkubera plattan i rums temperatur i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugera de sorterade CD34+ -cellerna vid 200 x g i 3 min. resuspendera cellen pellet i 1 ml EHT-medium.</li>
	<li>Bestäm den livskraftiga cell tätheten med cell räknaren. Justera cell tätheten till 200 000 celler mL-1 genom att lägga till EHT-medium.</li>
	<li>Aspirera och kassera beläggnings lösningen från fibronectin-belagda brunnen. Fördela 0,5 mL CD34+ cell SUS pension i varje fibronectin-belagd brunn.</li>
	<li>Inkubera i hypoxisk inkubator under en vecka.</li>
</ol>6. Flow Cytometri analys av hematopoetiska celler
<ol><li>
Flytande cell samling: Överför odlings mediet till ett 15 mL koniskt rör. Centrifugera mediet vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten.</li>
	<li>
Adherent cell insamling
	<ol>
<li>Tvätta cellerna med 0,5 mL PBS två gånger.</li>
		<li>Skölj cellerna med dissocierande lösning och aspirera överskotts vätskan.</li>
		<li>Inkubera plattan i 37 ° c för 5 min.</li>
		<li>Omsuspendera cellerna i 1 mL FACS-buffert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blanda flytande celler och anhängare celler.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten. Omsuspendera i 50 μL FACS-buffert. Inkubera cellerna med anti-CD34 och anti-CD45 anti kroppar för 1 h vid rums temperatur i mörker.</li>
	<li>Tvätta cellerna med PBS två gånger och centrifugera vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten och resuspendera i 0,5 ml FACS buffert med 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole.</li>
	<li>Mät CD34 och CD45 uttryck genom flödescytometer.</li>
</ol>7. kolonibildande enhet (CFU) halt av hematopoetiska celler
<ol><li>
Hematopoetisk cell insamling: Överför mediet från kulturen till ett 15 mL koniskt rör. Skölj försiktigt brunnen två gånger med PBS.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten. Omsuspendera i 1 mL EHT-medium. Bestäm cell nummer med cell räknaren.</li>
	<li>Tillsätt en SUS pension volym motsvarande 10 000 celler till 3 mL metylcellulosa-baserade medier kompletteras med antibiotika och blanda väl 5 gånger med en 16 G eller 18 G spruta.</li>
	<li>Dispensera hela metylcellulosa-baserade Media SUS pensionen i varje brunn av en 6-well tallrik.</li>
	<li>Inkubera i 37 ° c med 5% CO2 i två veckor samtidigt som den håller sig fuktig. Stör inte skålen. Kolonier är rörelse känsliga.</li>
	<li>Efter två veckor, räkna kolonierna under ett Mikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells.">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+HSCs+in+vitro:+don't+forget+the+hemogenic+endothelium.">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li><li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li><li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors.">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261 (2011).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

Författarna deklarerar inga intresse konflikter.

Vår matar-och xenofria definierade induktions metod erbjuder en exakt och kostnads effektiv plattform för att inducera HE-celler på ett skalbart sätt. Den trogna bildandet av hemogena endotelet i konventionella protokoll10,11,12,13,14 har hämmats av brist på exakt kontroll av PSC kolonidensitet och storlek, som påverkar effektiviteten hos morfogen/cytokin-baserad riktad differentiering. Vi hade upplevt inkonsekvens av hemogena endotelium induktion i varje oberoende parti från konventionella protokoll. Det nya protokollet möjliggör en stram reglering av PSC kolonidensitet och storlek, därmed övervinner inkonsekvensen av hemogena endotelium induktion.
Vi utnyttjade den uniformerade bildandet av sfäroider och därefter förmedlas en feeder-och Xeno-fri definierade villkor för att bilda HE i totalt 4 dagar. Vi bekräftade med hjälp av tre oberoende cellinjer att sfäroiden bildandet försäkrar konsekvent bildandet av HE celler. Som ett representativt resultat gav 409B2 cellinjerna 12,7%-23,6% CD34+ cell effektivitet baserat på tre oberoende experiment. Den kritiska faktorn för att kakel PSC sfäroider är LM511-E8. Vi rekommenderar inte att ersätta detta med andra matriser, såsom Matrigel eller ful längds laminin produkter i våra erfarenheter. Vi upplevde att mesodermala organoider var lätt lossnat från Matrigel och förlorade under differentierings processen. Och varken Matrigel eller ful längds laminin inte ankare celler utan pre-beläggning.
Den potentiella begränsningen av detta protokoll är att vi är beroende av PSC-underhållsmediet för att upprätthålla gemensamma kontakt punkter. Vi har testat andra medier som StemFit, men vi har kompromissat med hemogen induktion. Förmodligen celler var resistenta mot utträde ur pluripotenta tillstånd i vår korta tid (4 dagar) induktions protokoll. Om man upprätthåller gemensamma kontakt punkter i andra medier, rekommenderar vi att anpassa cellerna i PSC underhålls medium och genomföra ett par passager före differentiering. Denna plattform kommer att möjliggöra systematisk manipulation och analys av celler, och off-the-shelf produktion och storskalig induktion av hematopoetiska celler för potentiell klinisk användning. Ett långsiktigt mål för detta system är att modellera immun brist sjukdomar i humaniserad mus modeller för att undersöka de ansvariga cellulära och molekyl ära mekanismer och genomföra drog visningar.

Utvecklingen av nya terapier för hematologiska och immunologiska sjukdomar har hämmats av avsaknaden av robusta plattformar för sjukdoms modellering och hög genom strömning drog screening med autologa hematopoetiska stamceller (HSCs) som härrör från patientens de pluripotenta stamcellerna (PSC). Genombrottet av inducerad (i) PSC-teknik håller löftet att modellera sjukdomar från patienternas celler, men inrättandet av funktionella HSCs från patientens iPSCs har varit svårfångade. För att härleda hscs från mänskliga PSCs, är korrekt induktion av embryonala mönster och transkriptionella program nyckel1,2,3,4,5,6, 7,8. De senaste framstegen i hematopoetisk utveckling har visat rollen av hemogent endotel (HE) i HSC utveckling9. Han kan induceras från PSCs och är mottaglig för nedströms intervention såsom gen överföring10,11,12,13. Med hjälp av he som plattform, kombinationen av 5 transkriptionsfaktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) framgångs rikt inducerade funktionella hscs som implantera långsiktiga och differentiera till flera linjer14. Men, varierande och ineffektiv generering av HE från PSC har hindrat systematisk manipulation och analys av celler tillsammans med off-the-shelf produktion och storskalig induktion av hematopoetiska celler för klinisk användning.
Här beskriver vi en kostnads effektiv och exakt metod för att härleda HE i 4 dagar med ett Matnings-och xenofritt definierat tillstånd. I denna metod, sfäroiden bildning och spontan åter tillplattning på iMarix-511 säkerställer en konsekvent densitet av PSC-kolonier, vilket är avgörande för en effektiv induktion av HE-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

Att härleda funktionell hematopoetisk stam och stamceller (HSPCs) från humana pluripotenta stamceller (PSC) har varit ett svårfångade mål för autologa transplantationer för att behandla hematologiska och maligna sjukdomar. Hemogent endotel (HE) är en mottagbar plattform för att producera funktionella HSPCs genom transkriptionsfaktorer eller för att inducera lymfocyter på ett robust sätt. Men nuvarande metoder för att härleda han är antingen kostsamma eller varierande i avkastning. I detta protokoll har vi fastställt en kostnads effektiv och exakt metod för att härleda HE inom 4 dagar i en feeder-och Xeno-fri definierade villkor. Den resulterande han genomgick en endotelial-till-hematopoetisk över gång och producerade CD34+CD45+ klonogena hematopoetiska progenitorer. Den potentiella kapaciteten hos vår plattform för att generera funktionella HSPCs kommer att ha breda tillämpningar inom sjukdoms modellering och screening för terapeutiska föreningar.

En Schematisk bild av PSC-kolonier avbildas i figur 1a. PSC sfäroider bildas på ett Micro-fabricerade plast-fartyg för en dag. Som ett representativt resultat, 20 000 409B2 celler kan hanteras per 96-brunn av mikro-fabricerade plast fartyg, även om andra cellinjer kan kräva en högre densitet (30000-40000 celler per 96-brunn av mikro-fabricerade plast fartyg). Dessa sfärer är spontant tillplattade till en nästan tvådimensionell kultur när den är klädd på en kultur rätt i närvaro av LM511-E8.
En schematisk av hemogen induktion illustreras i figur 1b. När PSC-kolonier växer till en diameter av 750 μm, ändras mediet sekventiellt för att inducera mesodermala organoider. PSC-kolonierna kommer gradvis att bli en solig sida upp struktur under differentiering till mesodermala organoider genom sekventiell medel förändring till dag 4. På dag 4, hemogena endotelia anges från mesodermala organoider genom magnetisk sortering och därefter pläterade på Fibronektin i EHT medium. 5-10 miljoner CD34+CD45- celler förväntas från sfäroider som innehåller 1 000 000 PSCs (figur 1c).
Det observeras att cellerna morfologiskt förändras från endotelceller till hematopoetiska celler (kompletterande video 1). En representativ fas kontrast bild av hematopoetiska stamceller vid stimulering med hematopoetisk cocktail dag 7 visas i figur 2A. Hematopoetiska cellkolonier uppstod i kulturen.
En representativ flödescytometri diagram visas i figur 2b. Hela kulturen stimuleras med hematopoetisk cocktail och på dag 7 analyseras för uttrycket av CD34 och CD45 av flödescytometri. Hematopoetiska progenitorceller uttrycker CD34 och CD45.
En CFU-analys visade generering av granulocyter/makrofagkolonier från CD34+ CD45+ hematopoetiska stamceller (figur 2C). Det uppskattade antalet kolonier är 38 CFU-G/M per 10 000 celler (figur 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> Figur 1: Schematisk uppdelning av PSC-kolonier och efterföljande hematopoetiska differentiering via hemogen endotelia. ASchematisk process för bildandet av PSC-kolonier. De gemensamma kontakt punkterna upprätthålls på en LM511-E8-belagd 6-well-platta i PSC-underhållsmediet. På dag-4, celler lossas och separeras till encellig nivå med separera lösning, därefter pläterad på mikro-fabricerade plast fartyg i PSC underhålls medium med Y-27632 och odlade över natten för att bilda sfäroider. På dag-3, är sfäroider pläterade i PSC underhålls medium med LM511-E8 och odlade i tre dagar. Vid dag 0, sfäroider är spontant tillplattad till en nästan tvådimensionell kultur. Skal streck = 200 μm. (B) på dag 0 ersätts mediet med Day0 differentierings medium och odlas i hypoxisk inkubator. På dag 2 av differentieringen, mediet ersätts med dag2 differentiering medium. På dag 4 av hemogena endotelium berikning, CD34+ celler magnetiskt sorteras och odlas på en fibronectin-belagd 12-well plattan i EHT medium för 6 dagar. C representativ flowcytometri-Plot av CD45 och CD34 uttryck för dag 4-celler sorterade efter CD34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> Figur 2: analys av hematopoetisk egendom. (A) representativ fas kontrast bild av hematopoetiska progenitorceller efter stimulering med hematopoetisk cocktail dag 7. Skalbar = 200 μm. (B) representativ flödescytometri tomt på CD45 och CD34 uttryck för hela kulturen vid stimulering med hematopoetiska cocktail på dag 7. (C) representativ fas kontrast bild av en granulocyt/makrofagkoloni som genereras från dag 11 hematopoetiska stamceller. Skalbar = 500 μm. (D) antal cfus per 10 000 celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> Kompletterande video 1: EHT-video. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogena Endotelium differentiering från mänskliga pluripotenta stamceller i en feeder-och Xeno-fritt definierade villkor

Här presenterar vi ett protokoll för att exakt bilda hemogent endotel från humana pluripotenta stamceller i ett Matnings-och xenofritt tillstånd. Denna metod kommer att ha breda tillämpningar inom sjukdoms modellering och screening för terapeutiska föreningar.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Vi erbjuder producera blodkroppar från mänskliga pluripotenta stamceller. Den största fördelen med denna teknik är att vi får konsekvent och exakt avkastning av hemogenic endotelceller. Vi förväntar oss att vår plattform kommer att möjliggöra breda tillämpningar inom sjukdomsövervakning och screening för terapeutiska föreningar.Denna teknik är särskilt fördelaktigt för hematologi och immunologi forskning. Metoden kan tillämpas på genetisk intervention eller genredigering av mänskliga blodkroppar. Det möjliggör enkel induktion av vektorer i hemogenic endotelceller.Den mest avgörande punkten är LM511-E8 beläggning för att skriva PSC kolonier. Vi rekommenderar inte att du hoppar över beläggningen eller ersätter med en annan matris. Visuella demonstrationer är viktigt eftersom vi vill visa hur man sköljer cellerna med en dissociationsbuffert och hur man belägga plattor med LM511-E8.Odla mänskliga pluripotenta stamceller eller hPSCs till mellan 70 och 80%konfluency på en LM511-E8-belagda sex-väl platta i mTeSR1 medium. Fyra dagar före hemogenic induktion, aspirera mediet och tvätta två gånger med PBS. Skölj cellerna med dissociation lösning, och inkubera i 37 grader Celsius i 15 minuter.Resuspend cellerna i PSC underhållsmedium och överföra suspensionen till en 1,5 milliliter microcentrifug röret. Centrifugera cellerna vid 200 gånger G i tre minuter. Aspirera supernatanten, och resuspend cellerna i PSC plätering medium.Platta psc-fjädringen enligt manuskriptet riktningar på en mikrotillverkade plastkärl, och inkubera över natten. Tre dagar före hemogenic induktion, försiktigt pipettera PSC sfäroider i en 15 milliliter koniska röret och lämna dem i två minuter i rumstemperatur för att fällas ut av gravitationen. Aspirera supernatanten och resuspend spheroidsna i spheroid pläteringmedel.Fördela suspensionen i en LM511-E8 belagda 10 centimeter kultur skålen vid en densitet av fyra sfäroider per kvadratcentimeter och inkubera i tre dagar. Efter tre dagar aspirera mediet, tillsätt dag noll differentiering medium, och kultur cellerna i två dagar i en hypoxisk inkubator. Sedan aspirera dagen noll medium, lägga dag två differentiering medium, och kultur i ytterligare två dagar.Två dagar senare aspirerar du mediet och tvättar cellerna två gånger med PBS. Skölj cellerna med dissociationslösning och inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Efter inkubationen, separera cellerna genom att försiktigt resuspending dem i en millimolar EDTA.Överför suspensionen till ett koniskt rör på 50 milliliter och centrifug cellerna vid 200 gånger G i tre minuter. Aspirera supernatanten och resuspend cell pelleten med 300 mikroliter av magnetiska separationsbuffert. Tillsätt 100 mikroliter av CD34-positiva mikropärlor till cellerna, och blanda försiktigt genom pipettering.Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter, använd sedan en 40 mikrometercellsil för att anstränga suspensionen och separera de CD34-positiva cellerna med hjälp av en magnetisk separator. Dispensera 0,5 milliliter 5 mikrogram per milliliter fibronectin beläggningslösning i varje brunn av en 24 brunnskulturplatta, och inkubera plattan vid rumstemperatur i 30 minuter. Samtidigt centrifug de sorterade CD34-positiva celler på 200 gånger G i tre minuter, och återanvända pelleten i en milliliter av EHT medium.Bestäm den livskraftiga celltätheten med en cellräknare, och justera celltätheten till 200, 000 celler per milliliter genom att lägga till EHT-medium. Aspirera och kassera beläggningslösningen från de fibronectinbelagda brunnarna och dosera 0,5 milliliter CD34-positiv cellfjädring i varje brunn. Inkubera cellerna i hypoxisk inkubator i en vecka.För att samla de flytande cellerna, överför odlingsmediet till ett 15 milliliter koniskt rör och centrifug vid 200 gånger G i tre minuter. Därefter aspirera supernatanten. För att samla upp de vidhäftande cellerna, tvätta dem två gånger med 0,5 milliliter PBS, och skölj dem med dissocierande buffert.Aspirera överskottet vätska och inkubera plattan på 37 grad Celsius i fem minuter. Resuspend cellerna i en milliliter facs buffert, och blanda de flytande och anhängare celler. Centrifugera de blandade cellerna vid 200 gånger G i tre minuter, sedan aspirera supernatanten och resuspend cellerna i 50 mikroliter facs buffert.Späd anti-CD34 och anti-CD45 antikroppar i 50 mikroliter facs buffert;lägg till dem i cellerna och inkubera cellerna i en timme vid rumstemperatur i mörker. Sedan tvättar du cellerna två gånger med PBS, centrifugerar vid 200 gånger G i tre minuter efter varje tvätt. Aspirera supernatanten och resuspend cellerna i 0,5 milliliter facs buffert med 0,5 mikrogram per milliliter dappy.Mät CD34 och CD45-uttryck efter flödescytometri. För att samla de hematopoetiska cellerna, överför odlingsmediet till ett 15 milliliter koniskt rör. Samla de återstående cellerna genom att försiktigt skölja brunnen två gånger med PBS.Centrifugera cellerna vid 200 gånger G i tre minuter sedan aspirera supernatant och resuspend i en milliliter av EHT medium. Efter att ha räknat cellerna, tillsätt 10, 000 celler till tre milliliter metylcellulosa fördelade medier, kompletterad med antibiotika, och använda en 16 gauge spruta för att blanda fem gånger. Fördela hela mediaupphängningen i varje brunn av en sex-brunnsplatta.För att hålla cellerna fuktiga, tillsätt vatten eller PBS till de tomma brunnarna på plattan. Inkubera cellerna i två veckor, se till att inte störa skålen som kolonier är rörelsekänsliga. Efter två veckor, räkna kolonierna under mikroskop.Cell morfologiskt förändring från endotel till hematopoietic celler vid stimulering med den hematopoietic cocktail. Hematopoetiska cellkolonier uppstår i kulturen. Hematopoietic progenitor celler express CD34 och CD45, så flöde cytometri används för att bekräfta förekomsten av hematopoietic cell kolonier genom att analysera uttryck av CD34 och CD45.En koloni bildar enhet assay visat generering av granulocyter eller makrofag kolonier från de CD34-positiva och CD45-positiva hematopoietic progenitor cellerna. Kolonintalet beräknades vara 38 kolonibildande enheter per 10 000 celler. De mest avgörande stegen är tallying PSC sfäroider.Vi fann att ytan metriska är den mest deterministiska faktorn i effektivitet av detta protokoll. Detta förfarande kan följas av off-the-shelf produktion av inergical celler såsom naturligt förekommande celler och makrofager. Denna plattform gör det möjligt för forskare att utforska viktiga deterministiska faktorer i människans hematopoetiska utveckling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkt Induktion av Hemogenic endotelet och Blood av Uttryck av transkriptionsfaktorer i Human pluripotenta stamceller

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humana perifera T-celler med Sendai virus i Feeder fria förhållanden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierade Xeno-fri och Feeder-fri odlingsbetingelser för den Generation av mänskliga iPSC-derived Retinal cellmodeller

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...