Name: hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Alina Li ve Seiko Benno 'ya teknik yardımları için minnettarız. Ayrıca, Yönetici Yardımı ve Dr. Peter Karagiannis 'in gazeteyi düzenlemesini sağlayan Bayan Harumi Watanabe 'e teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, tıbbi araştırma ve geliştirme için Japonya ajansı rejeneratif tıp gerçekleştirilmesi için araştırma merkezi ağı IPS hücre araştırma için Core Center tarafından desteklenmektedir (AMED) [M.K.S.], ıntractable hastalıklar araştırma programı Kullanan. AMED 'in hastalığına özgü IPS hücreleri (17935423) [M.K.S.] ve Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JST) [ULı ve M.K.S.] Inovasyon programı merkezi.

1. reaktifler
<ol><li>Hücre hatları (insan PSC 'Ler): embriyonik kök hücreleri (ESCs) veya IPSC hatları 409B2 ve 201B7 (317-9)) ve CBA11.</li>
	<li>
Reakajın hazırlanması
	<ol>
<li>PSC kaplama ortamı: 10 μM Y-27632 ile PSC bakım ortamını karıştırın ve 4 °C ' de saklayın.</li>
		<li>PSC küre döşeme Orta: karışım PSC bakım orta ile 625 – 1250 ng/mL insan rekombinant laminin-511 E8 parça (LM511-E8) (hücre hattına bağlı olarak) hemen önce kullanmayın. Not: LM511-E8 medya15' te karıştırılabilir. Tam uzunluklu laminin-511 gibi diğer matris önceden kaplanmış olması gerekir, ve hatta bunu yaptı, onlar Farklılaşma süreci sırasında yapışmış Mezodermal organoids sürdüremez.</li>
		<li>Gün 0 farklılaşma Orta: Mix Mesodermal bazal Orta 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve 80 ng/ml vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF).</li>
		<li>2. gün farklılaşma ortamı: 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF ve 100 ng/mL kök hücre faktörü (SCF) ile Hemogenik bazal orta karışımı.</li>
		<li>Fosfat tampon tuz (PBS) kalsiyum veya magnezyum olmadan hazırlayın (bkz. malzeme tablosu).</li>
		<li>1 mM etylenediaminetetraasetic asit (EDTA) tampon: 0,5 M EDTA 500 mL PBS için 1 mL ekleyin.</li>
		<li>EHT Orta: 50 ng/ml SCF ile karışım hematopoetik bazal orta, 20 ng/ml trombopoetine (TPO), 50 ng/ml FMS ile ilgili Tirozin kinaz 3 ligand (flt-3l), 20 ng/ml interlöin-6/interlökin-6 reseptör Alfa (IL-6/Il-6rα), insülin-transferrin-selenyum-etololin, L-glutamin ve penisilin/streptomisin/Amphotericin B.</li>
		<li>FACS tampon: 2% fetal buzağı serum ve 1 mM EDTA ile mix PBS.</li>
		<li>Manyetik ayırma tamponu hazırlayın (bkz. malzeme tablosu).</li>
		<li>Metilselüloz bazlı medyayı hazırlayın (bkz. malzeme tablosu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSC kolonisi oluşumu
<ol><li>MTeSR1% 5 CO2' ye sahip bir 37 °c ' lik küvatör ile 0,5 μg cm-2 LM511-E8 kaplamalı 6-kuyu plakasında hpscs 'ye 70 – 80% konflukans büyütün.</li>
	<li>
PSC ayrışma (gün-4)
	<ol>
<li>Orta aspirate ve iki kez PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri ayrışma çözeltisi ile durulayın. 37 °C ' de 15 dakika (hücreler bu süre içinde kurutmaz) için Inküye yapın.</li>
		<li>PSC bakım ortamdaki hücreleri askıya alın, süspansiyonu uygun boyutta bir tüpe aktarın ve hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g 'de santrifüjler, süpernatant aspirate ve PSC kaplama ortamdaki hücreleri askıya alın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PSC süspansiyonunu 48.000 – 70.000 hücreli cm-2 (hücre hattına bağlı olarak) bir yoğunlukta mikro fabrikasyon plastik bir damar üzerine yerleştirin ve bir gecede 37 °c kuluçkörü ile 5% Co2' ye Not: Biz 100 öneririz μL iyi-1 hücre süspansiyon bir 96-iyi mikro-fabrikasyon plastik gemi. Genellikle 20.000 hücreleri iyi-1 bir 96-iyi plaka yaklaşık 100 kürler verim için tohum olacaktır.</li>
	<li>
Üzerinde karoseri PSC kürleri LM511-E8 (Gün-3)
	<ol>
<li>Bir 15 mL konik tüpteki PSC küroları, P1000 micropipetter kullanarak hafifçe pipetleme yaparak toplayın ve kürleri 2 dakika boyunca yerçekimi ile çöktmek için oda sıcaklığında bırakın. Süpernatant aspirate.</li>
		<li>Küratör kaplama ortamında askıya alma, süspansiyonu, 3 gün boyunca 5% CO2 Ile 37 °c ' deki 4-küre cm-2 ve kültürün yoğunluğu ile kaplı olmayan 6-kuyu kültürü plakasına dağıtın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hemogenik Indüksiyon (gün 0)
<ol><li>% 5 O2 ve 5% Co2 (hipoxik kuluçk) ile 37 °c ' de Day0 diferansiyel orta ve kültür ekleyin.</li>
	<li>Day0 farklılaşma ortamında iki gün kültür sonra, orta Aspire, daha sonra hipotatik inkükör day2 farklılaşma orta ve kültür ekleyin.</li>
</ol>4. Hemogenik endotelyum izolasyonu (gün 4)
<ol><li>İki gün sonra, orta Aspire ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri ayrışma çözeltisi ile durulayın. 37 °C ' de 5% CO2 ile 30 dakika boyunca kuluçko.</li>
	<li>Tek hücreli seviyeye ayırmak için 1 mm EDTA hücrelerinde yavaşça askıya, süspansiyon bir 50 ml konik tüp içine aktarmak ve 3 dakika için 200 x g hücrelerde Santrifüjlü, süpernatant aspirate ve hücre Pelet askıya 300 μL manyetik ayırma ile Arabellek.</li>
	<li>100 μL CD34+ mikroboncuk ve hafifçe pipet ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın. 100 μL CD34+ boncuk başına 20.000.000 hücreye kadar kullanılabilir.</li>
	<li>40 μm hücre süzgeci ile süspansiyonu filtreleyin.</li>
	<li>CD34+ hücrelerini manyetik ayırıcı kullanarak ayırın.</li>
</ol>5. endotelial-hematopoetik geçiş İndüksiyon (EHT)
<ol><li>
Fibronektin kaplama
	<ol>
<li>PBS 'de 1 mg/mL fibronektin seyreltilerek 5 μg/mL fibronektin-kaplama çözeltisi gerekli hacmini hazırlayın.</li>
		<li>24-Well kültür plakasının her bir kuyusu içine kaplama çözeltisi 0,5 mL dispense. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kulküat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıralı CD34+ hücreleri at 200 x g Için 3 dk. resuspend 1 ml EHT ortamdaki hücre Pelet.</li>
	<li>Hücre sayacı ile uygun hücre yoğunluğunu belirleyin. 200.000 hücreleri mL-1 EHT orta ekleyerek hücre yoğunluğunu ayarlayın.</li>
	<li>Kaplama çözümünü fibronektin kaplı kuyunda aspirate ve atın. 0,5 mL CD34+ hücre süspansiyonu her fibronektin kaplı kuyunda dispense edilir.</li>
	<li>Bir hafta boyunca hipoktanli kuluçkan içinde inkük.</li>
</ol>6. hematopoetik hücrelerin akış Cytometri Analizi
<ol><li>
Kayan hücre koleksiyonu: Kültür ortamını 15 mL Konik Tüpe aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g 'de orta santrifüj yapın.</li>
	<li>
Yapışıcı hücre koleksiyonu
	<ol>
<li>Hücreleri iki kez 0,5 mL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri çözünerek durulayın ve fazlalığı sıvı Aspire.</li>
		<li>37 °C ' deki plakayı 5 dakika boyunca kuluçat.</li>
		<li>Hücreleri 1 mL FACS arabelleğinde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yüzen hücreleri ve yapışan hücreleri karıştırın.</li>
	<li>Hücre Santrifüjü 200 x g 'de 3 dk. supernatant aspirate. 50 μL FACS arabelleğinde resuspend. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat için anti-CD34 ve anti-CD45 antikorları ile hücreleri kulyur.</li>
	<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve 3 dakika boyunca 200 x g 'de santrifüjün, 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole ile 0,5 ml 'lik FACS tampon olarak süpernatant ve pelletini aspirate.</li>
	<li>Ölçüm CD34 ve CD45 ifade akış cytometer tarafından.</li>
</ol>7. koloni şekillendirme ünitesi (CFU) hematopoetik hücrelerin tahlil
<ol><li>
Hematopoetik hücre koleksiyonu: Orta kültürden 15 mL konik tüp aktarın. PBS ile iyi iki kez yavaşça durulayın.</li>
	<li>Hücre Santrifüjü 200 x g 'de 3 dk. supernatant aspirate. 1 mL EHT orta resuspend. Hücre sayacı ile hücre numarasını belirleyin.</li>
	<li>16 G veya 18 G şırınga ile 5 kez antibiyotik ve mix ile tamamlayıcı 3 mL metilselüloz tabanlı medya 10.000 hücreler için bir süspansiyon hacmi eşdeğer ekleyin.</li>
	<li>Tüm metilselüloz bazlı medya süspansiyonunu 6-kuyu plakasının her bir kuyusu içine dağıtın.</li>
	<li>37 °C ' de iki hafta boyunca 5% CO2 ile kuluçko, nemli tutarken. Yemeği rahatsız etmeyin. Koloniler hareket duyarlı.</li>
	<li>İki hafta sonra, kolonileri mikroskop altında say.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li><li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage.">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA++hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros.">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li><li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells.">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+haematopoietic+stem+cell+development:+from+the+embryo+to+the+dish.">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li><li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+HSCs+in+vitro:+don't+forget+the+hemogenic+endothelium.">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li><li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+lineage+and+legacy:+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells.">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li><li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors.">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261 (2011).</li><li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells.">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li><li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages.">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li><li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner.">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165 (2017).</li></ol>

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Besleyici ve Xeno içermeyen tanımlı indüksiyon yöntemimiz, HE hücrelerini ölçeklenebilir bir şekilde teşvik etmek için hassas ve uygun maliyetli bir platform sunar. Geleneksel protokoller10,11,12,13,14 hemogenic endotel sadık oluşumu PSC kolonisi yoğunluğu ve büyüklüğü hassas kontrol eksikliği ile engel olmuştur, Hangi morphogen/sitokin tabanlı yönlendirilmiş farklılaşma verimliliğini etkiler. Biz geleneksel protokollerden her bağımsız toplu hemogenik endotelyum indüksiyonu tutarsızlık yaşadı. Yeni protokol PSC kolonisi yoğunluğu ve büyüklüğü sıkı düzenleme sağlar, böylece hemogenic endotel indüksiyon tutarsızlığı üstesinden gelir.
Biz, kürlerin üniformalı oluşumu sömürülür ve daha sonra bir besleyici ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşulu toplam 4 gün içinde HE oluşturmak için iletti. Biz üç bağımsız hücre hatları kullanarak doğruladı, küroid oluşumu HE hücrelerinin tutarlı oluşumu sağlar. Temsili bir sonuç olarak, 409B2 hücre hatları% 12.7-23,6% CD34+ hücre verimliliği üç bağımsız deneyler dayalı vermiştir. PSC küroyla döşeme için kritik faktör LM511-E8 ' dir. Bunu, Matrigel veya tam uzunluklu laminin ürünleri gibi diğer matrislerle birlikte deneyimlerimizde yerine getirilmez. Mezodermal organoidlerin Matrigel 'den kolayca ayrıldıkları ve farklılaşma sürecinde kaybettiğimiz yaşamında yaşadık. Ve ne Matrigel ya da tam uzunlukta laminin ön kaplama olmadan hücreleri çapa yok.
Bu protokolün olası sınırlaması, PSC 'lerin korunması için PSC bakım ortamına bağlı olmamız. Biz StemFit gibi diğer medya test ettik, ama biz hemogenic indüksiyon tehlikeye. Muhtemelen hücreler kısa sürede (4 gün) indüksiyon protokolünde pluripotent devletten çıkmak için dayanıklıdır. Biri diğer medyada PSC 'leri korumasalar da, hücre ile ilgili hücreleri bağdaştırma ve farklılaşma öncesinde birkaç geçiş yapmak öneririz. Bu platform, hücrelerin sistematik manipülasyon ve analizini ve potansiyel klinik kullanım için kapalı-the-raf üretim ve büyük ölçekli indüksiyon hematopoetik hücrelerin sağlayacaktır. Bu sistemin uzun vadeli bir amacı, sorumlu hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak ve uyuşturucu gösterimleri yürütmek için insanlaşmış fare modellerinde immünyetmezlik hastalıkları modellemek.

Hematolojik ve immünolojik bozukluklar için yeni terapinin geliştirilmesi, hastalık modelleme için sağlam platformların olmaması ve hastadan gelen Otolog hematopoetik kök hücreler (HSCs) ile yüksek verim ilaç taraması ile engellenmiştir. pluripotent kök hücreleri (PSC 'ler). İndüklenen (ı) PSC teknolojisinin atılım, hastaların hücrelerinden hastalık modeli vaat tutar, ancak hasta ıpscs fonksiyonel HSCs kurulması zor olmuştur. İnsan PSC 'lerden HSCs türetmek için, embriyonik desen ve transkripsiyonel programların uygun indüksiyon anahtar1,2,3,4,5,6, 7,8. Hematopoetik gelişiminde son ilerleme HSC gelişimi hemogenik endotelyum (HE) rolünü göstermiştir9. O, PSC 'den indüklenmiş olabilir ve gen transferi10,11,12,13gibi aşağı müdahale için imkan sağlar. HE 'yi bir platform olarak kullanarak, 5 transkripsiyon faktörlerinin (erg, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) kombinasyonu, uzun vadeli bir engreft yapan ve14' ün birden fazla çizgiye farklılaştırılan işlevsel HSCs 'leri başarıyla indüklenmiş. Ancak, o, PSCs 'nin değişken ve verimsiz üretimi, hücrelerin sistematik manipülasyon ve analizini, off-the-raf üretim ve klinik kullanım için hematopoetik hücrelerin büyük ölçekli indüksiyon ile birlikte engellemis.
Burada, bir besleyici ve Xeno içermeyen tanımlı koşul ile 4 gün içinde She türetmek için uygun maliyetli ve hassas bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, küroid oluşumu ve Imarıx-511 üzerinde spontan yeniden düzleştirme, HE hücrelerinin verimli indüksiyonu için önemli olan PSC kolonilerinin tutarlı bir yoğunluğunu sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575</td>
			<td>0.5M EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>40&#956;M cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td>6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-112</td>
			<td>Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07776</td>
			<td>anti-CD34 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304012</td>
			<td>anti-CD45 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td>BMP4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td>CD34 microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Wako</td>
			<td>038-23101</td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15165-01</td>
			<td>Hemogenic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A15169-01</td>
			<td>Mesodermal basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezsphere SP Microplate 96well</td>
			<td>AGC</td>
			<td>4860-900SP</td>
			<td>micro-fabricated plastic vessel&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1365/500</td>
			<td>FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FC010-100MG</td>
			<td>Fibronectin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3L</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>Flt-3L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>8954-SR</td>
			<td>IL-6/IL-6R&#945;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511</td>
			<td>Matrixome</td>
			<td>892 001</td>
			<td>LM511-E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51500-056</td>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>magnetic separation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocult 4435MethoCult&#8482; H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>04435</td>
			<td>Methylcellulose-based media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td>85850</td>
			<td>PSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-24291</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>SCF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemline &#8545; Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0192-500ML</td>
			<td>Hematopoietic basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>288-TPN</td>
			<td>TPO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>253-00513</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (SCS) fonksiyonel hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) türeterek hematolojik ve malign bozuklukları tedavi etmek için otolog nakli için zor bir hedef olmuştur. Hemogenik endotel (HE), transkripsiyon faktörleri ile fonksiyonel HSPCs üretmek veya lenfositleri sağlam bir şekilde teşvik etmek için bir ayısit platformudur. Ancak, geçerli Yöntemler o türeyen maliyet ya da değişken verim. Bu protokolde, bir besleyici ve Xeno içermeyen tanımlı durumda 4 gün içinde She türetmek için uygun maliyetli ve hassas bir yöntem kurduk. Sonuç o bir endotel--hematopoetik geçiş yapıldı ve üretilen CD34+CD45+ clonogenic hematopoetik progenitors. Fonksiyonel HSPCs üretme platformumuzda potansiyel kapasite, terapötik bileşikler için hastalık modelleme ve taramasında geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Şekil 1a'da form oluşturan PSC kolonilerinin şematiği tasvir edilir. PSC kürler bir gün için bir mikro-fabrikasyon plastik gemi üzerinde oluşturulur. Bir temsilci sonucu olarak, 20.000 409B2 hücre 96-iyi mikro-fabrikasyon plastik gemi başına ele olabilir, diğer hücre hatları daha yüksek bir yoğunluk gerektirebilir rağmen (30.000-40000 hücre 96 başına-iyi mikro-fabrikasyon plastik gemi). Bu küreler, LM511-E8 varlığında bir kültür çanak üzerine kaplamakta olan neredeyse iki boyutlu kültürlere kendiliğinden düzleştirilir.
Hemogenik indüksiyon şematik Şekil 1B'de gösterilmiştir. PSC kolonileri 750 μm çapına geliştiği zaman, orta sıralı olarak Mezodermal organoidleri ikna etmek için değiştirilir. PSC kolonileri kademeli olarak gün 4 kadar sıralı orta değişim ile Mezodermal organoids farklılaşma sırasında yapısı kadar güneşli bir yan haline gelecek. 4. gün, hemogenik endotelinde, manyetik sıralama ile Mezodermal organoidlerden belirtilir ve daha sonra EHT ortamında fibronektin üzerine kaplamadır. 5-10 milyon CD34+CD45- hücreler 1.000.000 PSC içeren Kürlerden bekleniyor (Şekil 1C).
Hücrelerin morfolojik olarak hematopoetik hücrelere endotelyal olarak değişdiği görülmektedir (ek video 1). 7. gün hematopoetik kokteyl ile stimülasyon üzerine hematopoetik progenitör hücrelerin temsili faz kontrast görüntüsü Şekil 2a' da gösterilir. Kültürde hematopoetik hücre kolonileri ortaya çıktı.
Şekil 2B'de bir temsilci akış sitometri Arsa gösterilir. Tüm kültür hematopoetik kokteyl ile uyarılır ve 7. gün CD34 ve CD45 tarafından Akış sitometrisi ifadesi için analiz edilir. Hematopoetik progenitör hücreleri ekspres CD34 ve CD45.
Bir CFU tahlil CD34+ CD45+ hematopoetik progenitör hücrelerden granülositler/makrophaj kolonileri nesil gösterdi (Şekil 2C). Tahmini koloni sayısı 38 CFU-G/M 10.000 hücreleri başına (Şekil 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> Resim 1: hemogenik endothelia yoluyla karoseri PSC kolonileri ve sonraki hematopoetik farklılaşma şeması. (A) PSC kolonileri oluşturan şematik süreç. PSC 'lerin bakım ortamında LM511-E8 kaplı 6-kuyu plakasında SCS korunur. Gün-4, hücreler ayrılmış ve tek hücreli seviyeye bunalımları çözüm kullanarak, daha sonra Y-27632 ile PSC bakım ortamında mikro fabrikasyon plastik gemi üzerine kaplama ve kültürlülük gece küroidler oluşturmak için ayrılır. 3. gün, LM511-E8 ile PSC bakım ortamına kaplanır ve üç gün boyunca kültürlü olurlar. 0. güne kadar, küritler kendiliğinden neredeyse iki boyutlu bir kültüre düzleştirilir. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) gün 0, orta Day0 farklılaşma ortamı ile değiştirilir ve hipoktik kuluçk kültürüdür. Farklılaşma 2. gün, orta day2 farklılaşma ortamı ile değiştirilir. Hemogenik endotel zenginleştirme 4 gün, CD34+ hücreler manyetik olarak sıralanır ve 6 gün boyunca EHT orta bir fibronektin-kaplı 12-kuyu plaka üzerinde kültürlü. (C) CD34 tarafından sıralanmış gün 4 hücrelerin CD45 ve CD34 ifadesinin temsilci flowsitometri arsa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> Şekil 2: hematopoetik özelliğin analizi. (A) 7. gün hematopoetik kokteyl ile stimülasyon sonrası hematopoetik progenitör hücrelerin temsili faz kontrast görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) 7. günde hematopoetik kokteyl ile stimülasyon üzerine tüm kültürün CD45 ve CD34 ifadesinin temsilci akış sitometri arsa. (C) gün 11 hematopoetik progenitör hücrelerden üretilen bir granülosit/makrophaj kolonisinin temsili faz kontrast görüntüsü. Ölçek çubuğu = 500 μm. (D) 10.000 hücre başına CFUs sayısı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> Ek video 1: EHT video. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition at JoVE.com

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Burada, bir besleyici ve Xeno-ücretsiz durumda insan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum tam olarak oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem hastalık modelleme ve terapötik bileşikler için tarama geniş uygulamalara sahip olacaktır.

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Biz insan pluripotent kök hücrelerinden kan hücreleri üretmek sunuyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı hemojenik endotel hücrelerinin tutarlı ve kesin verimleri elde olmasıdır. Platformumuzun tedavi edici bileşikler için hastalık izleme ve tarama da geniş uygulamalara olanak sağlamasını bekliyoruz.Bu teknik özellikle hematoloji ve immünoloji araştırmaları için faydalıdır. Bu yöntem insan kan hücrelerinin genetik müdahalesi veya gen düzenlemesi için uygulanabilir. Hemojenik endotel hücrelerinde vektörlerin kolay indüksiyonuna olanak sağlar.En önemli nokta PSC kolonileri yazmak için LM511-E8 kaplama. Kaplamayı atlamanızı veya başka bir matrisle değiştirmenizi önermiyoruz. Görsel gösteriler önemlidir, çünkü hücreleri bir dissosiasyon arabelleğiyle nasıl durulamagösterebileceğimizi ve lm511-E8 ile plakaların nasıl kaplanabileceğimizi göstermek isteriz.MTeSR1 orta bir LM511-E8 kaplı altı kuyuplaka üzerinde% 70 ve% 80 biraraya gelirken insan pluripotent kök hücreleri veya hPSCs büyümek. Hemojenik indüksiyondan dört gün önce, orta yı aspire edin ve PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri ayrıştırma solüsyonuyla durulayın ve 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.PSC bakım ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve PSC kaplama ortamda hücreleri resuspend.Bir mikrofabrikasyon plastik kap üzerine el yazması talimatlara göre PSC süspansiyon plaka, ve gece kuluçka. Hemojenik indüksiyondan üç gün önce PSC küresel leri 15 mililitrelik konik bir tüpe hafifçe pipetleyin ve yerçekimine göre çökeltmek için oda sıcaklığında iki dakika bekletin. Supernatant aspire ve küresel kaplama ortamda küresel askıya.Süspansiyonu lm511-E8 kaplamalı 10 santimetrelik kültür yemeğine santimetre kare başına dört küresel likte dağıtın ve üç gün boyunca kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra, orta aspirate, gün sıfır farklılaşma orta ekleyin ve kültür iki gün boyunca bir hipoksik kuvöz hücreleri. Sonra, gün sıfır orta aspire, gün iki farklılaşma orta ekleyin ve başka bir iki gün için kültür.İki gün sonra, orta aspire ve PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücreleri ayrıştırma solüsyonuyla durulayın ve %5 karbondioksitle 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatın. Kuluçkadan sonra, hücreleri bir milimolar EDTA'da hafifçe yeniden sulandırarak ayırın.Süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire ve manyetik ayırma tampon 300 mikrolitre ile hücre pelet resuspend. Hücrelere 100 mikrolitre CD34 pozitif mikroboncuk ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.30 dakika oda sıcaklığında kuluçka, sonra süspansiyon zorlanma ve manyetik ayırıcı kullanarak CD34-pozitif hücreleri ayırmak için 40 mikrometre hücresüz kullanın. 24 kuyukültür plakasının her bir kuyusuna mililitre başına 5 mikrogram lık 0,5 mililitre fibronektin kaplama çözeltisi verin ve tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, üç dakika için 200 kez G sıralanmış CD34-pozitif hücreleri santrifüj ve EHT orta bir mililitre pelet resuspend.Bir hücre sayacı ile canlı hücre yoğunluğunu belirleyin ve Hücre yoğunluğunu EHT ortamı ekleyerek mililitre başına 200.000 hücreye ayarlayın. Kaplama çözeltisini fibronektin kaplı kuyulardan aspire edin ve atın ve her kuyuya 0,5 mililitre CD34 pozitif hücre süspansiyonu dağıtın. Hipoksik kuvözdeki hücreleri bir hafta kuluçkaya yatırın.Yüzen hücreleri toplamak için, kültür ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin. Sonra supernatant aspire. Yapışık hücreleri toplamak için, 0,5 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve ayrıştırıcı tampon ile durulayın.Fazla sıvıyı aspire edin ve plakayı 37 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Facs tampon bir mililitre hücreleri resuspend ve yüzen ve yapışık hücreleri karıştırın. Karışık hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı aspire edin ve 50 mikrolitre Facs tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.Facs tampon 50 mikrolitre anti-CD34 ve anti-CD45 antikorları seyreltmek;hücrelere ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreleri kuluçka. Daha sonra hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj edin. Süpernatant aspire ve mililitre dappy başına 0,5 mikrogram facs tampon 0.5 mililitre hücreleri resuspend.Cd34 ve CD45 ifadesini akış sitometrisi ile ölçün. Hematopoetik hücreleri toplamak için, 15 mililitrekonik tüp kültür ortamı aktarın. PBS ile kuyuyu iki kez hafifçe durulayarak kalan hücreleri toplayın.Hücreleri 200 kez G'de üç dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı aspire edin ve bir mililitre EHT ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri sayarak sonra, metilselüloz aralıklı medya üç mililitre için 10, 000 hücre ekleyin, antibiyotikler ile takviye, ve beş kez karıştırmak için 16 gauge şırınga kullanın. Altı kuyulu bir plakanın her kuyunun içine tüm medya süspansiyonu dağıtın.Hücreleri nemli tutmak için, plaka üzerindeki boş kuyulara su veya PBS ekleyin. Koloniler harekete duyarlı olduğu için kabı rahatsız etmemeye dikkat ederek hücreleri iki hafta kuluçkaya yatırın. İki hafta sonra kolonileri mikroskop altında say.Hücre morfolojik hematopoetik kokteyl ile stimülasyon üzerine endotel lerden hematopoetik hücrelere değişir. Hematopoetik hücre kolonileri kültürde ortaya çıkar. Hematopoetik atahücreleri CD34 ve CD45 ifade, bu nedenle akış sitometri CD34 ve CD45 ekspresyonu analiz ederek hematopoetik hücre kolonilerinin varlığını doğrulamak için kullanılır.Koloni oluşturan birim testi, CD34-pozitif ve CD45-pozitif hematopoetik atahücrelerinden granülosit veya makrofaj kolonilerinin neslini gösterdi. Koloni sayısının her 10.000 hücrede 38 koloni oluşturan birim olduğu tahmin edilmektedir. En önemli adımlar PSC küresel spheroidleri solmaktır.Yüzey ölçümünün bu protokolün verimliliğinde en belirleyici faktör olduğunu bulduk. Bu yordamı, doğal olarak oluşan hücreler ve makrofajlar gibi inerjik hücrelerin off-the-raf üretimi takip edilebilir. Bu platform araştırmacılar ın insan hematopoetik gelişiminde ki temel deterministik faktörleri keşfetmelerine olanak tanır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...