Name: in vitro biochemical assays using biotin labels to study protein-nucleic acid interactions
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00
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Ringraziamo P. Jeremy Wang (Università della Pennsylvania) per modifiche e discussioni utili. Ringraziamo anche Sigrid Eckardt per l'editing linguistico. È stato sostenuto dal Programma nazionale di Ricerca e Sviluppo della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) e dalla National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) e dal Programma Innovativo e Imprenditoriale della Provincia di Jiangsu. J. N. è stato supportato dal progetto di scienza e tecnologia medica di zhejiang (2019KY499). M. L. è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31771588) e del 1000 Youth Talent Plan.

1. Preparazione delle proteine
<ol><li>Costrutti di espressione MEIOB e MOV10<ol><li>Generare costrutti di espressione cDNA codificando mouse MEIOB-A, C ed E (Figura 1A) e MOV10.<ol>
<li>Impostare le reazioni a catena di polimerasi (PCR) per ogni frammento. Mescolare 1 l di cDNA di topo (da C57BL/6 testi topo), 1 "L of dNTP", 2 -L di 10 - L di 10 M in avanti, 2 L di 10 M inverso, 1 l of DNA polymerase, 25 litri di 2x buffer PCR e 18 l di doppio distillato H2O (d...

<ol>
	<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox30+initiates+transcription+of+haploid+genes+during+late+meiosis+and+spermiogenesis+in+mouse+testes.">Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>Watanabe, T., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+of+gene+expression+by+Piwi+proteins+and+piRNAs.">Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs.</a> Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).</li><li>Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+high-throughput+screening+method+to+identify+compounds+targeting+protein-nucleic+acids+interactions.">A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), 52 (2015).</li><li>Hwang, H., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+induced+fluorescence+enhancement+(PIFE)+for+probing+protein-nucleic+acid+interactions.">Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions.</a> Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).</li><li>Gustafsdottir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+DNA-protein+interactions+by+proximity+ligation.">In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).</li><li>Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+quantitative+EMSA+and+its+application+in+the+study+of+RNA--protein+interactions.">A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).</li><li>Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+binding+affinity+of+poly(ADP-ribose)+to+specific+binding+proteins+as+a+function+of+chain+length.">Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length.</a> Nucleic Acids Research. 35 (21), 143 (2007).</li><li>Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+the+study+of+RNA-protein+interactions:+the+IRE/IRP+example.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Nishida, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+roles+of+mitochondrial+Papi+and+Zucchini+in+Bombyx+germline+piRNA+biogenesis.">Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis.</a> Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).</li><li>Anders, C., Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+enzymology+of+Cas9.">In vitro enzymology of Cas9.</a> Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).</li><li>Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+plant+in+vitro+assay+system+for+pre-mRNA+cleavage+during+3'-end+formation.">A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation.</a> Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).</li><li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing.">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes &amp; Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li><li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+Is+a+5'+to+3'+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3'+UTRs.">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), (2014).</li><li>Talwar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAD-box+protein+DDX43+(HAGE)+is+a+dual+RNA-DNA+helicase+and+has+a+K-homology+domain+required+for+full+nucleic+acid+unwinding+activity.">The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).</li><li>Nagy, N. M., Konya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+fast+and+slow+consecutive+processes+by+heterogeneous+isotope+exchange+using+P-32+radiotracer.">Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer.</a> Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).</li><li>Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Probes+for+ALKBH2+Allow+the+Measurement+of+DNA+Alkylation+Repair+and+Drug+Resistance+Responses.">Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses.</a> Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).</li><li>Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+biorecognition:+the+(strept)avidin-biotin+system+as+a+model+for+protein-protein+and+protein-ligand+interaction.">Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction.</a> Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).</li><li>Trippier, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+strategies+for+the+biotinylation+of+bioactive+small+molecules.">Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules.</a> ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).</li><li>Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biotin-labeled+nucleic+acids+for+protein+purification+and+agarose-based+chemiluminescent+electromobility+shift+assays.">Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Pulldown+of+Biotinylated+RNA+for+Detection+of+Protein-RNA+Complexes.">Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes.</a> Bio-Protocol. 6 (24), (2016).</li><li>Bednarek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNAs+biotinylated+within+the+5'+cap+and+protected+against+decapping:+new+tools+to+capture+RNA+-+protein+complexes.">mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes.</a> Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).</li><li>Souquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIOB+Targets+Single-Strand+DNA+and+Is+Necessary+for+Meiotic+Recombination.">MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination.</a> Plos Genetics. 9 (9), (2013).</li><li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination.">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788 (2013).</li><li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks.">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li></ol>

Lo studio delle interazioni tra proteine e acidi nucleici è fondamentale per la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di diversi processi biologici. Ad esempio, MEIOB è una proteina specifica per i testicoli essenziale per la meiosi e la fertilità nei mammiferi25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB che si lega al DNA a filamento singolo e presenta da 3' a 5' attività esonuclease26, c...

Le interazioni tra acido proteina-nucleico sono coinvolte in molti processi cellulari essenziali come la riparazione del DNA, la replicazione, la trascrizione, l'elaborazione dell'RNA e la traduzione. Le interazioni proteiche con sequenze specifiche di DNA all'interno della cromatina sono necessarie per uno stretto controllo dell'espressione genica a livello tracscrivionale1. Una precisa regolazione posttrapescrittiva di numerosi RNA codificanti e non codificanti richiede interazioni estese e complicate tra qualsiasi proteina e RNA2. Questi strati del meccanismo regolatore dell'espressione genica comprendono una cascata di eventi intermolecolari dinamici, coordinati da interazioni di trancilazione/fattori epigenetici o proteine che legano l'RNA con i loro bersagli di acido nucleico, nonché interazioni proteina-proteina. Per sezionare se le proteine in vivo sono direttamente o indirettamente associate agli acidi nucleici e come tali associazioni si verificano e culminano, vengono condotte analisi biochimiche in vitro per esaminare l'affinità legante o l'attività enzimatica delle proteine di interesse sussidi progettati di DNA e/o RNA.
Sono state sviluppate molte tecniche per rilevare e caratterizzare i complessi nucleo-acido-proteina, tra cui l'analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del ritardo del gel o analisi dello spostamento della banda3,4,5 . L'EMSA è un metodo biochimico versatile e sensibile che è ampiamente utilizzato per studiare il legame diretto delle proteine con gli acidi nucleici. L'EMSA si basa sullo spostamento elettroforetico del gel nelle bande, che vengono regolarmente visualizzate utilizzando la chemiluminescenza per rilevare le etichette di biotina6,7, la fluorescenza delle etichette fluoroforiche8,9o autoradiografia delle etichette radioattive 32P10,11. Altri scopi degli studi biochimici sono l'identificazione e la caratterizzazione dell'attività di elaborazione dell'acido nucleico delle proteine, come le reazioni basate sulla nuclea per valutare i prodotti di scissione da substrati di acido nucleico12, 13 del sistema , 14 e analisi di rimozione della struttura del DNA/RNA per valutare le attività elicasise15,16,17.
In questi saggi di attività enzimatica, gli acidi nucleici etichettati al radioisotolo o al fluoroforo sono spesso utilizzati come substrati a causa della loro elevata sensibilità. L'analisi delle radiografie delle reazioni enzimatiche che coinvolgono radiotracciatori con etichetta 32P è risultata sensibile e riproducibile18. Tuttavia, in un numero crescente di laboratori nel mondo, l'uso di radioisotopi è limitato o addirittura vietato a causa dei rischi per la salute associati alla potenziale esposizione. Oltre ai problemi di biosicurezza, altri inconvenienti sono l'attrezzatura necessaria per condurre il lavoro con i radioisotopi, la licenza di radioattività richiesta, l'emivita breve di 32P (circa 14 giorni) e il graduale deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi. Pertanto, sono stati sviluppati metodi alternativi non isotopici (cioè, l'etichettatura della sonda con fluorofori consente il rilevamento mediante imaging fluorescente19). Tuttavia, quando si utilizzano sonde con etichetta fluorescente, è necessario un sistema di imaging ad alta risoluzione. La biotina, un'etichetta comunemente usata, si lega prontamente alle macromolecole biologiche come proteine e acidi nucleici. Il sistema Biotin-streptavidin funziona in modo efficiente e migliora la sensibilità di rilevamento senza aumentare lo sfondo non specifico20,21. Oltre all'EMSA, la biotina è ampiamente utilizzata per la purificazione delle proteine e l'RNA pull-down, tra gli altri22,23,24.
Questo protocollo utilizza con successo gli acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per analisi biochimiche in vitro che includono EMSA, oltre a reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata. Il dominio MEIOB OB è costruito e due mutanti (troncamento e mutazione puntiforme) sono espressi come proteine di fusione GST25,26,27, così come il topo MOV10 ricombinante proteina di fusione FLAG16. La relazione mette in evidenza l'efficacia di questo protocollo combinato per la purificazione delle proteine e i saggi etichettati con biotina per vari scopi sperimentali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:163px;">Eppendorf, Germany</td>
			<td style="width:104px;">5242R</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemiluminescent Imaging System</td>
			<td>Tanon, China</td>
			<td>5200</td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital sonifer</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>BBV12081048A</td>
			<td style="width:176px;">450 Watts; 50/60 HZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-dry electrophoretic blotter</td>
			<td style="width:163px;">Hoefer, USA</td>
			<td style="width:104px;">TE77XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tube Revolver&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Crystal, USA</td>
			<td style="width:104px;">3406051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">UV-light cross-linker</td>
			<td>UVP, USA</td>
			<td style="width:104px;">CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter&#160;</td>
			<td>Milipore, USA</td>
			<td>UFC801096</td>
			<td>4 ml/10 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nylon membrane</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:104px;">TG263940A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430167</td>
			<td style="width:176px;">100 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430597</td>
			<td style="width:176px;">150 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Microtubes tubes</td>
			<td style="width:163px;">AXYGEN, USA</td>
			<td style="width:104px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:176px;">1.5 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning, USA</td>
			<td style="width:104px;">430791</td>
			<td style="width:176px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:176px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>SunShine Bio, China</td>
			<td>8h288h28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Anti-FLAG M2 magnetic beads</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">M8823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">ATP</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>591136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime, China</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CelLyticTM M Cell Lysis Reagent&#160;</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>107M4071V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ClonExpress II one step cloning kit&#160;</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>C112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>T1269950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>DNTP100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DMEM</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DPBS buffer</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">AM9260G</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">EDTA free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:163px;">Roche, USA</td>
			<td style="width:104px;">04693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EndoFree Maxi Plasmid Kit&#160;</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>&#160; 
			DC202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit</td>
			<td>Vazyme, China</td>
			<td>DC301-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FBS</td>
			<td style="width:163px;">Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">FLAG peptide</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Glycerol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma, USA</td>
			<td style="width:104px;">SHBK3676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GST Bulk Kit</td>
			<td style="width:163px;">GE Healthcare, USA</td>
			<td style="width:104px;">27-4570-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>SLBZ2837</td>
			<td>1 M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">KoAc</td>
			<td style="width:163px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:104px;">127-08-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamin 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td style="width:104px;">L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:351px;">MgCl2</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">AM9530G</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>AM9759 
			&#160;</td>
			<td>5 M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NP-40</td>
			<td style="width:163px;">Amresco, USA</td>
			<td style="width:104px;">M158-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td style="width:104px;">31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:163px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:104px;">N251B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Streptavidin alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:163px;">Promega, USA</td>
			<td style="width:104px;">V5591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TBE</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:104px;">15581044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15567027</td>
			<td>1 M, PH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCI Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>15568025</td>
			<td>1 M, PH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tween-20</td>
			<td style="width:163px;">Sangon Biotech, China</td>
			<td style="width:104px;">A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro biochemical assays using biotin labels to study protein-nucleic acid interactions

Le interazioni tra acido proteina-nucleico svolgono un ruolo importante nei processi biologici come la trascrizione, la ricombinazione e il metabolismo dell'RNA. I metodi sperimentali per studiare le interazioni tra proteine-nucleici con acido richiedono l'uso di tag fluorescenti, isotopi radioattivi o altre etichette per rilevare e analizzare molecole bersaglio specifiche. La biotina, un'etichetta di acido nucleico non radioattivo, è comunemente usata nei saggi di mobilità elettroforici (EMSA), ma non è stata regolarmente impiegata per monitorare l'attività delle proteine durante i processi dell'acido nucleico. Questo protocollo illustra l'utilità dell'etichettatura della biotina durante le reazioni enzimatiche in vitro, dimostrando che questa etichetta funziona bene con una serie di diversi saggi biochimici. In particolare, in linea con i precedenti risultati ottenuti utilizzando substrati con etichetta a radioisotopi 32P, è confermato tramite EMSA con etichetta biotina che IL MEIOB (una proteina specificamente coinvolta nella ricombinazione meiotica) è una proteina legante al DNA, che MOV10 (un RNA helicase) risolve le strutture in base al polpa di RNA etichettate con biotina, e quel MEIOB fende il DNA a filamento singolo etichettato con biotina. Questo studio dimostra che la biotina è in grado di sostituendo 32P in vari saggi biochimici correlati all'acido nucleico in vitro.

La struttura proteica di MEIOB e i costrutti di espressione utilizzati in questo studio sono illustrati nella Figura 1A. Le pieghe OB in MEIOB sono strutture compatte simili a botte in grado di riconoscere e interagire con gli acidi nucleici a filamento singolo. Uno dei domini OB (aa 136-307, costrutto A) lega il DNA a singolo filamento (ssDNA), la proteina troncata (troncamento aa 136-178, costrutto C) e la forma mutante a punti (R235A, costrutto E) di MEIOB non hanno attiv...

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In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Questo protocollo offre una piattaforma con etichetta biotina per lo studio delle interazioni proteina-acido nucleico che si rivela robusta, affidabile, efficiente e conveniente. Lo stesso lotto degli acidi nucleici etichettati con biotina può essere utilizzato per un lungo periodo di tempo, mantenendo la riproducibilità degli esperimenti. Infine, tutti i saggi con etichetta biotina descritti qui possono essere eseguiti entro un giorno e non richiedono attrezzature speciali.A dimostrare la procedura sarà Lina Yu, una post-laurea del nostro laboratorio. Preparare i costrutti MEIOB e MOV10 e trasformarli nei batteri appropriati. Per estrarre MEIOB, pelletare le cellule tramite centrifugazione e rimostrarle in 20 millilitri di saline tamponate al fosfato di Dulbecco ghiacciate, o tamponamento DPBS.Sonicare la sospensione batterica sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a 12.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti e trasferisci il supernatante in un tubo fresco. Pre-lavare le perline di glutatione-sefarose e incubarle con il lisato a quattro gradi Celsius per due ore.Centrifugare la miscela a 750 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto per pelletare le perline. Risciacquare le perline con 10 millilitri di PBS ghiacciato otto volte. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione, incubare le perline a quattro gradi Celsius per 10 minuti ed eludere le perline tramite centrifugazione.Ripetere l'eluizione sei volte e mettere insieme le sei frazioni. Trasferire le proteine eluite in un filtro centrifugo e concentrarsi per centrifugazione a 7.500 volte g per un volume finale da 100 a 200 microlitri. Per estrarre MOV10, esprimere la proteina nelle cellule HEK293T e pelletare le cellule secondo le indicazioni del manoscritto.Rimescolare il pellet in tre millilitri di tampone di lisi cellulare con cocktail completo di inibitore della proteasi senza EDTA e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a quattro gradi Celsius. Preparare perline magnetiche anti-FLAG lavandole due volte con tampone K150.Dopo il lavaggio, rimorsi le perline in un millilitro di tampone K150 ghiacciato e incubarle per due minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata. Raccogliere le perline su un magnete e rimuovere il supernatante. Aggiungere le perline al lisato cellulare e incubare a quattro gradi Celsius per due ore.Lavare le perline con tampone K150 secondo le indicazioni del manoscritto e rimpiorsi le perline in 300 microlitri di tampone di eluizione FLAG. Posizionare le perline su un magnete, raccogliere il supernatante con le proteine MOV10 e determinare la concentrazione proteica. Preparare gli oligonucleotidi dell'RNA diluendo ogni oligo a 20 micromolari e ricotturandoli per formare duplex RNA secondo le indicazioni del manoscritto.Per il saggio di spostamento elettroforetico di mobilità MEIOB, o EMSA, mescolare i reagenti in base alle direzioni del manoscritto. Aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi aggiungere tampone di arresto 5x.Per il saggio di attività dell'elicase MOV10, mescolare i reagenti secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti, 30 minuti e 60 minuti, quindi aggiungere un buffer di arresto 5x per interrompere la reazione. Quindi, preparare un gel di poliacrilammide nativo al 20% e caricare da 20 a 25 microlitri di ogni campione in ogni pozzo.Eseguire il gel a 100 volt su un bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu bromofenolo non è migrato verso il quarto inferiore del gel. L'acrilammide è dannosa e tossica. È importante gestirlo con adeguati dispositivi di protezione individuale.Smontare le piastre di gel e tagliare il gel rimuovendo i pozzi di carico e le corsie inutilizzate. Posizionare il gel in un buffer TBE 0,5x. Tagliare la carta da filtro e la membrana di nylon alle dimensioni del gel, pre-bagnare la carta e la membrana e assemblare la pila per il trasferimento.Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparecchio elettroforetico semi-secco a 90 milliampere per 20 minuti. Quindi, incrociare i campioni irradiando la membrana a 120 millijoule per centimetro squadrato per 45-60 secondi. Per il rilevamento della chemiluminescenza, iniziare aggiungendo 20 millilitri di tampone di blocco alla membrana e incubandolo per 15-30 minuti mentre si trema delicatamente.Rimuovere con cura il buffer di blocco e sostituirlo con un buffer coniugato/bloccante. Incubare nuovamente la membrana per 15 minuti. Lavare la membrana quattro volte mentre si trema per cinque minuti per lavaggio.Quindi, aggiungere 30 millilitri di tampone di equilibrazione del substrato alla membrana e incubarlo per cinque minuti mentre si trema a 20-25 giri/min. Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scansionare la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per uno o tre secondi.La purificazione delle proteine MEIOB A, C ed E può essere verificata con colorazione blu Coomassie e analisi western blot. Le frecce rosse indicano le posizioni delle proteine MEIOB purificate. Le interazioni tra MEIOB e DNA a singolo filamento possono essere visualizzate utilizzando l'EMSA.Si osservano legatura e scissione dipendenti dalla concentrazione. Come previsto, solo il MEIOB-A di tipo selvaggio interagisce con il DNA mentre i mutanti MEIOB-E e MEIOB-C no. Si possono anche osservare interazioni di MEIOB e RNA a singolo filamento.Il MEIOB di tipo selvaggio mostra l'attività di legame e esonucleasi dipendente dalla concentrazione sull'RNA a singolo filamento. Tuttavia, il confronto quantitativo mostra che il MEIOB lega il DNA con un'efficienza superiore rispetto all'RNA. La purificazione del MOV10 è stata verificata con la colorazione blu coomassie e l'attività elicase della proteina è stata misurata su un duplex RNA con uno sbalzo a cinque primi.Con l'aumentare del tempo di reazione, MOV10 srotola progressivamente l'RNA a doppio filamento. Per ridurre il costo del saggio, il rilevamento della chemiluminescenza può essere eseguito con una diluizione duplice dei reagenti del kit di rilevamento o con reagenti autoprodetti. Il protocollo qui descritto utilizzava con successo acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per saggi biochimici in vitro come l'EMSA e per reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata.

Research

JoVE Journal

Genetics

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In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Ricerca

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